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固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 摘要：电化学免疫传感器是将免疫反应的特异性与电化学方法的高灵敏度相结合的分 析器件，具有操作简单、响应速度快、灵敏度高、价格低廉等优点，在食品工业、临床 诊断和环境监测等领域已展现出十分广泛的应用前景。然而，在免疫传感器的研究与应 用中仍存在着诸多亟待解决的问题，如生物活性材料( 抗体或抗原) 的有效固定，更好 的保持其生物活性，降低甚至消除抗体在传感器上的非特异性吸附，提高传感器的再生 性能等等。其中将抗体稳定的、高活性的固定在基体电极表面，构成生物敏感膜是制备 电化学免疫传感器的关键技术之一。本文以石墨和金电极为基础电极，分别运用电聚合、 电沉积、自组装和纳米技术研究抗体的固定化方法，制备了三种免疫传感器，并对抗体 的固定化过程进行了电化学表征。这些传感器制备简单、操作方便、检测下限低、线性 范围宽、可对游离抗原进行快速检测。本论文工作主要包括以下几个方面： 1 基于聚邻苯二胺和纳米金的电位型免疫传感器 分别利用电聚合技术、电沉积技术将邻苯二胺、纳米金依次固定在石墨电极上，进 而通过纳米金对蛋白质的强烈吸附作用，将抗体固定在石墨电极表面，制备出抗体金纳 米粒子聚邻苯二胺石墨免疫传感器( a b g n p s p o p d c e ) 。该传感器对抗原( 小鼠i g g ) 的检测下限为1 0 x 1 0 一n g m l ，线性范围为4 0 x 1 0 - 3 。1 o x l on g m l ，响应时间短( 1 0m i n 以内) ，同时具有较好的重现性、稳定性和选择性。 2 基于4 b d t 与n p q d 混合s a m 的电位型免疫传感器 首先在金电极表面制备4 a t p 自组装单分子膜( 4 a t p s a m ) ，得到4 a t p s a m a u 电极，在0 1m o l lp b s ( p h7 4 0 ) 溶液中对4 a t ps a m a u 电极进行循环伏安扫描，使金 表面上4 - a t ps a m 中的4 - a t p 单体发生聚合，生成4 巯基n 苯基苯醌二亚胺( n p q d ) ， 在金电极表面上空出4 巯基苯硫酚( 4 b d t ) 的结合位点，进而可将4 b d t 组装在n p q d 膜的空隙中，制备4 b d t 、n p q d 混合s a m ，使4 b d t 分子直立在金表面，得到的毓 基( s h ) 化表面与金纳米粒子( g n p s ) 作用，构筑一种具有生物兼容活性的纳米金界 面，进而通过纳米金对蛋白质的较强吸附作用将抗体( 羊抗小鼠i g g ) 固定于修饰电极 表面，从而制备了抗体金纳米粒子对巯基苯硫酚+ 4 毓基n 苯基苯醌二亚胺混合s 舢 金电极免疫传感器( a b g n p s 4 b d t + n p q dm s a m a u ) 。该传感器具有灵敏度高、响 应速度快，其检测下限为2 0 x 1 0 。4n m l ，线性范围为2 0 x 1 0 - 3 1 0 x 1 0 3n g m l ，而且能 够再生，重复使用寿命长达1 0 天左右。 3 基于蛋白a 定向固定抗体的电位型免疫传感器 利用蛋白a ( p r o a ) 对抗体具有定向固定的作用，并结合自组装技术在金电极表 面自组装4 一a t p 形成自组装单层膜( 4 a t ps a m ) ，利用4 a t p 的氨基官能团与蛋白a 之间静电吸附作用在4 a t p 单层膜上组装蛋白a ，通过蛋白a 对抗体的亲和力将羊抗 小鼠i g g 抗体定向的固定在修饰后的舍电极表面，从而制备了抗体蛋白对氨基苯硫 酚金电极免疫传感器( a b p r o a 4 一a t p ，+ a u ) 。该传感器制备简单、使用方便，其检测下 固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 限为1 0 x l o n g m l ，线性范围为4 0 x 1 0 3 - 4 o x l 0 3n g m l ，而且具有较好的稳定性和选 择性，寿命长达2 0 天左右。 关键词：电化学；免疫传感器；自组装单分子膜；纳米金粒子；抗原；抗体 固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 a b s t r a c t ：e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r sc o m b i n i n gt h es p e c i f i cr e s p o n s eo fi m m u n o r e a c t i o n a n dt h e h i g hs e n s i t i v i t y o fe l e c t r o c h e m i c a ld e t e r m i n a t i o nh a v et h ea d v a n t a g e so f e a s y o p e r a t i o n ，f a s t r e s p o n s e ，h i g h s e n s i t i v i t y ，a sw e l la sl o w - c o s t t h e yh a v eb e e na p p l i e dt o aw i d er a n g eo fa n a l y t i c a lt a s k s ，s u c ha sf o o di n d u s t r y , c l i n i c a ld i a g n o s i sa n de n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n g h o w e v e r , i nt h er e s e a r c ha n da p p l i c a t i o n so fi m m u n o s e n s o r s ，t h e r e a r es t i l lm a n y u r g e n tp r o b l e m s ，s u c ha st h ee f f i c i e n ti m m o b i l i z a t i o no fb i o m a t e r i a l ( a n t i b o d yo ra n t i g e n ) ， b e t t e rt om a i n t a i ni t sb i o l o g i c a la c t i v i t ya n dr e d u c eo re v e ne l i m i n a t et h en o n s p e c i f i c a d s o r p t i o no ft h ea n t i b o d i e so nt h es e n s o r si no r d e rt oi m p r o v et h er e g e n e r a t i o np e r f o r m a n c e o ft h es e n s o r sa n ds oo n i na d d i t i o n ，o n eo ft h ek e yt e c h n o l o g i e si nt h ed e s i g na n df a b r i c a t i o n o fe l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r si st oi m m o b i l i z ea n t i b o d i e ss t a b l ya n da c t i v e l yo no ri n t ot h e e l e c t r o d et oc o n s t r u c ts e n s i t i v em e m b r a n e i nt h i sp a p e li m m u n o s e n s o r sc o n s t r u c t e db ye l e c t r o p o l y m e r i z a t i o n ，e l e c t r o - d e p o s i t i o n ， s e l f - a s s e m b l dt e c h n o l o g ya n dn a n o t e c h n o l o g yr e s p e c t i v e l yw e r ei n v e s t i g a t e d g r a p h i t ea n d g o l de l e c t r o d ew e r es l e e t e da st h eb a s i ce l e c t r o d eo fi m m u n o s e n s o r s ，a n dt h ei m m o b i l i z a t i o n a n t i b o d yw a sc h a r a c t e r i z e db yc y c l i c v o l t a m m i t r i cm e t h o da n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c e s p e c t r o s c o p y t h e s ea s p r e p a r e di m m u n o s e n s o r sw e r eu s e dt o d e t e c tf r e ea n t i g e nw i t ht h e m e r i t so fs i m p l i c i t y , l o wd e t e c t i o nl i m i t w i d el i n e a rr a n g e t h em a j o rc o n t e n t si n t h i st h e s i s a r ed e s c r i b e da sf o l l o w s ： 1 d e v e l o p m e n to ft h ep o t e n t i o m e t r i ci m m u n o s e n s o rb a s e do np o l yo - p h e n y l e n e d i a m i n ea n d n a n o - g o l d a no p h e n y l e n e d i a m i n ea n dg o l dn a n op a r t i c l e sw e r ei m m o b i l i z e do n t ot h eb a s i c e l e c t r o d eb ye l e c t r o p o l y m e r i z a t i o na n de l e c t r o d e p o s i t i o nt e c h n o l o g yr e s p e c t i v e l yt of a b r i c a t e a b g n p s p o p d c e t h e nt h ea n t i b o d i e sw e r ef i x e do n t ot h eg r a p h i t ee l e c t r o d et h r o u g ht h e s t r o n ga d s o r p t i o nb e t w e e nt h en a n o g o l da n dp r o t e i n t h er e s u l t ss h o w e de x c e l l e n tr e s p o n s e t ot h ed e t e c t i o no ft h ea n t i g e n ( m o u s ei g g ) w i t hal i n e a rr a n g ef r o m4 o x l o 。t o 1 0 x 1 0 3 n g m la n dad e t e c t i o nl i m i to f1 o x l o 。3n g m l m o r e o v e r , t h es e n s o re x h i b i t e df a s t r e s p o n s e ( 1 e s st h a n1 0 m i n ) ，h i g hs e n s i t i v i t y , g o o dr e p e a t a b i l i t ya n dl o n g t i m es t a b i l i t y 2 c o n s t r u c t i o no ft h ep o t e n t i o m e t r i ci m m u n o s e n s o rb a s e do ns a m o ft h em i x t u r eo f4 - b d t a n dn p q d f i r s to fa l l ，4 一鼹p | e l e c t r o d ew a sd e s i g n e db yp r e p a r i n g4 - a t ps e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r ( 4 a t ps a m ) o nt h es u r f a c eo fg o l de l e c t r o d e t h e nt h e4 一a t p a ue l e c t r o d ew a s s c a n n e db yv o l t a m m e t r yi n0 1m o l lp b s ( p h7 4 0 ) i no r d e rt oe n a b l e4 - a t pm o n o m e rt o p o l y m e r i z ea n dp r o d u c e4 - m e r c a p t o n p h e n y l - p b e n z o q u i n o n ed i i m i n e ( n p q d ) s e q u e n t l y , t h eb i n d i n gs i t eo f4 - m e r c a p t o b e n z o t h i a z o l et h i o p h e n o l ( 4 b d t ) o nt h eg o l de l e c t r o d es u r f a c ew a sp r o d u c e d ，w h i c hc a n a s s e m b l e4 一b d ti n t ot h eg a p o fm e m b r a n en p q dm e m b r a n e t h ea s - p r e p a r e ds a mo f4 - b d ta n dn p q dp r o v i d e da n e n v i r o n m e n tw h e r e4 - b d tm o l e c u l e sc a ns t a n dv e r t i c a l l yo ng o l ds u r f a c eb yt h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nt h et h i o l ( - s h ) o ft h es u r f a c ea n dg o l dn a n o p a r t i c l e s ( g n p s ) ，w h i c hc a n c o n s e q u e n t l yb u i l dan a n o g o l d c o m p a t i b l ei n t e r f a c e f i n a l l y , t h r o u g ht h es t r o n ga d s o r p t i o n i i i 固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 b e t w e e nt h en a n o g o l da n dt h ep r o t e i n ，a n t i b o d i e s ( s h e e pa n t i m o u s el g g ) w e r ef i x e do n t ot h e s u r f a c eo fm o d i f i e de l e c t r o d et od e s i g nt h ei m m u n o s e n s o r ( a b g n p s 4 一b d t + n p q d a u ) n es e n s o ro f f e r e da ne x c e l l e n te l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s et ot h ed e t e c t i o no fa n t i g e nw i t hh i g h s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t y f u r t h e r m o r e ，t h es e n s o re x h i b i t e daf a s tr e s p o n s ew i t had e t e c t i o n l i m i to f2 0 x 1 0 4n m la n dal i n e a rr a n g eo f2 0 x 1 0 3 - 1 o x l 0 3n g m l , a n di tc a nb e r e g e n e r a t i o n ，l i f e t i m eo fu pt o1 0r e p e a td a y s 3 d e s i g no ft h ep o t e n t i o m e t r i c i m m u n o s e n s o rb a s e do nap r o t e i naf i x i n ga n t i b o d y d i r e c t i o n a l l y b a s e do nt h ef u n c t i o nt h a tap r o t e i na ( p r o - a ) c a ni m m o b i l i z ea l la n t i b o d yd i r e c t i o n a l l y c o m b i n i n gw i t hs a m s t h e4 a = r pw a sa s s e m b l e do n t h eg o l de l e c t r o d es u r f a c et of o r m s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r ( 4 a t ps a m s ) b yt h ee l e c t r o s t a t i ca d s o r p t i o nb e t w e e na m i n oo f 4 册a n dp r o t e i n 八t h ep r o t e i naw a sa s s e m b l e do n t ot h e4 - a t ps a m s t h r o u g ht h e a f f i n i t yo fa n t i b o d i e sa n dp r o t e i na as h e e pa n t i m o u s ei g ga n t i b o d yw a si m m o b i l i z e do nt h e m o d i f i e dg o l de l e c t r o d es u r f a c et op r e p a r et h ei m m u n o s e n s o r ( a b p r o - a 4 - a t p a u ) t h e s e n s o ri ss i m p l et op r e p a r ea n de a s et ou s e ，w h i c hw i t had e t e c t i o nl i m i to f1 o x l o 。n g m l a n dal i n e a rr a n g eo f4 0 x1 0 - 3 - 4 0 x1 0 n g m l i na d d i t i o n ，i ts h o w sg o o ds t a b i l i t ya n d s e l e c t i v i t y , w i t ht h el i f e t i m ea sl o n ga s2 0d a y s k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i s t r y ；i m m u n o s e n s o r ；s e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ；n a n o 。g o l dp a r t i c l e s ； a n t i g e n ；a n t i b o d y i v 固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特 别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其 他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均己在论文中做了明确的声明并表示 谢意。 学位论文作者签名：三亟翌醯 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名： 指导教师签 肌夕年可同 田免疫分子新 女噩其* 感性能的研究 第1 章绪论 1 1 生物传感器 生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学电子技术等多学科相互渗透成长起来 的新技术，成为生命科学与信息科学之间的桥梁。生物传感技术和纳米技术相结合将是 生物传感器领域研究的热点【1 4 j 。生物传感器是利用生物特异性的化学量传感器，由生 物识别元件和换能器组成，它能将被测物的浓度与可测的物理化学信号关联起来，其原 理如图1 - 1 所示p l ：待测物质经具有分子识别功能的感受器识别后所产生的信号，再由 换能器将其转化为与分析物浓度( 或活度) 有关的电信号或者光信号等输出，通过检测 嚣进行检测。它能检测由小分子到大分子的复杂化学物质，如酶、微生物、抗原( 抗体) 和复杂蛋白质等等。目前己研究出的生物传感器有：酶传感器、微生物传盛器、免疫传 感器、半导体生物传感器、热生物传感器、光生物传感器和压电晶体生物传感器等。生 物传感器可用于食品发酵、临床诊断、环境监测等领域 5 - 7 。 l l 样品 酉_ 识别元件敏感元件 检测仪器 图1 1 生物传意器原理困 生物传感器利用生物体的特异性有针对性地对有机物进行简便而迅速的测定。它 具有极好的选择性、噪音低；操作简单，在短时间内能完成测定：重现性好，且能以电 信号直接输出，容易实现检测自动化。 1 1 1 生物识别元件 生物识别元件( 即生物敏感膜) 主要是由具有分子识别功能的生物体成分或生物体 本身构成，是生物传感器的关键部分，也是传感器进行选择性检测的基础。它直接决定 传感器的功能和质量。分子识别物质( 如酶、抗原、抗体、组织、细胞等) 的特点在于 其专一性和可逆性。当分子识别物质与信号产生、固定化等技术紧密结合时，就形成了 生物传感器真正需要的敏感材料口j 。如图1 2 所示，按被选材料不同，可将生物传感器 分为酶传感器、组织传感器、微生物传感器和细胞传感器。按生物传感器与底物作用机 理不同，可将生物传感器分为催化型生物传感器和亲和型生物传感器两类，前者包括酶 传感器、组织传感器、微生物传感器；后者主要包括免疫传感器和d n a 传感器。 固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 图1 2 生物传感器生物识别原件分类 1 1 2 换能器 换能器是将感受器上发生的生化反应中的物理或化学变化转化成可测量信号的器 件。生物传感器主要有电化学生物传感器和光学生物传感器。其中前者主要包括电位型、 电流型、电导型和电容型等。后者主要有荧光型和化学发光型等。此外，热敏电阻、压 电晶体、表面声波换能器和表面等离子体共振等也已被用作生物传感器的换能器。电化 学换能器被广泛用于传感器的制备，因为它有许多优点如它能在混浊的溶液中操作，具 有较高的灵敏度且容易微型化，此外，所用的仪器简单、便宜，还能进行在线测剧9 1 0 l 。 因此，电化学生物传感器更具商业化前景。 1 1 3 生物传感器的发展历程 1 9 6 2 年c l a r k 和l y o n s 1 1 】首次把嫁接酶法和离子敏感氧电极技术结合，研制了测定 葡萄糖含量的酶电极，开创了生物传感器的先河。1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s 1 2 j 用聚丙烯 酞胺凝胶固定葡萄糖氧化酶成膜和氧电极组装在一起，制成了固定化酶电极一这是生物 传感器的首次问世。在这之前的电化学传感器只能检测阴、阳离子，当与生物识别物质 结合以后，许多其它物质得以检测。随后许多其它的生物组分和换能器相继应用到生物 传感器中。1 9 7 5 年，j a n a t a 1 3 】研制出了电化学免疫生物传感器，d i v i e s l l 4 j 同年发表了第 一篇关于电流型微生物传感器的论文。电位型微生物传感器出现于1 9 7 7 年1 1 5 j ：组织传 感器出现于1 9 7 8 年【1 6 】，线粒体电极则是1 9 8 0 1 1 7 j 年完成的。2 0 世纪8 0 年代，利用生物 反应中的光效应、热效应、场效应和质量变化而开发的生物传感器蓬勃发展，开始了生 物电子学传感器的新时代。1 9 8 0 年c a r a s 和j a n a t a l l 8 j 首先研制成功可测定青霉素的酶场 效应晶体管生物传感器，这一成果为离子敏场效应晶体管开创了新的研究领域，又为生 物传感器的微型化，全固态化，集成化和多功能化开辟了一条新的途径，实现了生物传 感器与微电子技术的结合，为生物传感器应用于医学领域的在线测定奠定了基础。1 9 8 3 年i o w e 和c o f d f i n c h l l 9 】第一次将光学换能器引入到酶传感器领域。1 9 9 0 年h e n r yl z u j 提 出了免疫传感器的概念。免疫传感器足将高度灵敏的传感技术与特异的免疫反应结合起 来，用以检测抗原抗体反应的乍物传感器。此后，d n a 、r n a 以及人工i ： 别元件都先 固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 后应用于生物传感器中。近些年来，己经研制出一系列在环境监测、临床检验和生化分 析等方面具有实用价值的生物传感器。 1 1 4 生物传感器的应用 生物传感器种类繁多，涉及学科领域广，技术先进、优点突出而有广泛的实际应用 领域和潜在的应用前景【2 1 】。近年来生物传感器在发酵工业、食品工业、临床诊断和环境 监测等方面得到广泛的应用。生物传感器专一性好、灵敏度高、测量快速准确、适用范 围广、设备简单、易操作。在功能方面，生物传感器已经发展到活体( i nv i v o ) 澳j j 定、多 指标测定和联机在线测定，检测对象包括近百种常见的生物化学物质。随着固定化技术 的发展以及化学、生物、物理、电子技术等学科的发展，生物传感器将会在分析领域有 着越来越广泛的应用1 2 2 , 2 3 j 。 1 1 4 1 生物传感器在发酵工业中的应用 微生物传感器可用于测量发酵工业中的原材料、代谢产物和微生物细胞数目。利用 这种电化学微生物细胞数传感器可以实现菌体浓度连续、在线的测定。在各种生物传感 器中，特别是微生物传感器具有成本低、设备简单、不受发酵液混浊程度的限制、能消 除发酵过程中其它物质的干扰等特点。因此在发酵工业中广泛地采用微生物传感器作为 一种有效的测量工具。 1 1 4 2 生物传感器在食品工业中的应用 生物传感器可以用来检测食品中营养成分和有害成分的含量、食品的新鲜程度等。 如已经开发出来的酶电极型生物传感器可用来分析白酒、苹果汁、果酱和蜂蜜中的葡萄 糖含量，从而衡量水果的成熟度。采用亚硫酸盐氧化酶为敏感材料制成的电流型二氧化 硫酶电极可用于测定食品中的亚硫酸含量。此外，也可以用生物传感器测定色素和乳化 剂的成分。 1 1 4 3 生物传感器在医学领域中的应用 生物传感器在医学领域也发挥着越来越大的作用。临床上用免疫传感器等生物传感 器来检测体液中的各种化学成分，为医生的诊断提供依据；在军事医学中，对生物毒素 的及时快速检测是防御生物武器的有效措施。生物传感器已应用于监测多种细菌、病毒 及其毒素。生物传感器还可以用来测量乙酸、乳酸、乳糖、尿酸、尿素、抗生素、谷氨 酸等各种氨基酸，以及各种致癌和致变物质。已研制成功的各种免疫球蛋白( 除i g g 外) 传感器已能进行多种免疫反应检测。 1 1 4 4 生物传感器在环境检测中的应用 生物传感器能对污染物进行连续、快速、在线监测，在环境检测方面已经得到广泛 应用。m a r t y 2 4 】等将亚细胞类脂类一含亚硫酸盐氧化酶的肝微粒体固定在醋酸纤维膜上 和氧极制成安培型生物传感器，可对酸m 酸雾样品溶液进行检测。生物传感器在研究土 壤养分及污染对农作物的影响，在研究植物不同生长时期对营养成分的需求等方面也有 固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 应用。 1 2 电化学免疫传感器 1 2 1 免疫传感器 免疫传感技术是将高灵敏度的传感技术与特异性免疫反应结合起来，用以检测抗原 一抗体反应的一种生物传感技术。基于抗原抗体特异性结合的免疫分析技术广泛应用在 遍及生化测定和医学检验的各个领域。任何物质只要能获得相应的特异性抗体，即可用 免疫方法进行检测。可测定的对象包括：具有免疫活性的免疫球蛋白、补体、细胞因子 等；微生物和相应的抗体；血液凝固因子；以及临床化学测定中微量而难于分离的物质， 如蛋白质、同工酶、激素、药物、毒品等。 抗原是能刺激机体免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞又能与相应抗体或致敏淋巴 细胞发生特异性结合的物质。抗体是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球 蛋白，抗体具有高度的特异性，一般只能与相应的抗原起专一的反应，其最基本的生物 功能是防御外界物质对机体的侵袭。相对其它的生物传感技术，由于抗原和抗体的结合 具有很高的特异性，减少了非特异性干扰，提高了检测的准确性。 免疫传感器( i m m u n o s e n s o r ) 是将免疫测定法与传感技术相结合而构建的一类新型生 物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究。免疫传感器作为生物传感器的一个重 要分支，因其具有耐用、可携带、易操作、低成本等突出优点，使其成为目前开发研究 的热点。它利用动物体内a g 、a b 能发生特异性的吸附反应的性质，将a b 固定在电极 上，通过传感技术使吸附发生时产生的物理、化学、电学、或光学上的变化，转变成可 检测的信号来测定环境中待测分子的浓度1 2 5 】。目前，对细胞、孢子及病毒等最成功的检 测手段是a b 的免疫检测1 2 6 。在分子识别原件中抗体与抗原选择性结合产生的信号敏感 地传送给换能器，抗体与抗原的结合具有高度的特异性。免疫传感器的优劣取决于抗体 与待测物结合的选择性和亲和力。在传统的免疫传感器研究中，抗原抗体结合前后可导 致多种信号的改变，如在重量、光学、热学、电化学等方面。光学分析的研究比较活跃， 但是由于电化学分析有其独到之处，如可以实现在体检测，不受样品颜色、浊度的影响 ( 即样品可以不经处理，不需分离) ，所需仪器设备相对简单，因此前景看好。根据所使 用的信号转换器不同，免疫传感器可分为：电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电 免疫传感器及s p r 型免疫传感器等。对生物样品中的低浓度成分进行选择性分析有两 个基本要求：高选择性和高灵敏度。免疫传感器由于利用了抗原抗体反应的高亲和性和 分子识别的特点，加之感受器的高灵敏度，从而在这一方面显示了突出的优越性。在免 疫传感器的研制过程中特别值得注意的是保持传感器中生物活性单元对于目标物的识 别活性和将识别过程转化为一种可检测的连续信号。 1 2 2 电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是免疫技术与电化学检测技术相结合的产物。1 9 5 1 年b r e y e r 和 4 固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 r a d c l i f f 首次用极谱方法测定了由偶氮标记的抗原，这成为电化学免疫分析的开端1 2 。 电化学免疫传感器也是免疫传感器中研究最早、种类最多、较为成熟的一个分支，它结 合各种电分析技术，如循环伏安法、即时电流法、交流阻抗法等，使灵敏度大大提高， 目前正朝着更加灵敏、特效、微型和实用的方向发展。根据检测信号的不同，电化学免 疫传感器分为电位型、电流型、电导型和电容型。 ( 1 ) 电位型免疫传感器兴起于2 0 世纪7 0 年代，它是基于离子选择电极原理而发展起 来的【2 8 3 0 1 。利用a g 或a b 在水溶液中两性解离本身带电的特性，将其中一种固定在电极 表面，当另一种与之结合形成a g a b 复合物时，原有的膜电荷密度将发生改变，从而引起 膜的d o n n a n 电位和离子迁移的变化，最终导致膜电位改变。电位与活性物质浓度对数值 成正比，其关系遵循能斯特方程。因此，它可直接或间接检测各种a g 或a b ，具有可实 时监测、响应时间快等特点。1 9 7 5 年j a n a t a 首次描述了用电位测量来监测免疫化学反应 【1 3 l ，他通过聚氯乙烯膜把抗体固定在金属电极上，然后用相应的抗原与之特异性结合， 抗体膜中的离子迁移率随之发生变化，从而使电极上的膜电位也相应发生改变。膜电位 的变化值与待测物浓度之间存在对数关系，因此根据电位变化值即可求出待测物浓度。 早期的研究者利用此原理测定了人血清中的梅毒抗体、人血清白蛋白，并完成了血清鉴 定。彭图治、袁若等分别报道了对人甲胎蛋白( a f p ) 等一些疾病标志物直接检i 贝l j 3 0 , 3 1 j 。 酶标记电位型免疫传感器是将免疫化学的专一性和酶化学的灵敏性融为一体，以实现对 低含量物质的检测。标记酶有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和脲酶等。 酶标记传感器( 电位型或电流型) ，最后均可归结为是对n a d h 、苯酚、0 2 、h 2 0 2 、n h 3 及新近开发的电活性物质的检测。g h i n d i l i s 3 2 佣乳糖酶标记胰岛素抗体，与样品中的胰 岛素抗体竞争结合固定在电极上的胰岛素。乳糖酶能催化电极上的氧化还原反应，从而 使电极上的电位增加，检测胰岛素，获得了很宽的线性范围。电位型免疫传感器与一般 免疫检测方法相比，其优势在于，它不但能弥补目前常规免疫检测方法不能进行定量检 测的缺点，而且而且检测仪器比电流型免疫传感器更加简单，更容易实现抗原抗体反应 的实时监测。 ( 2 ) 电流型免疫传感器的原理主要有竞争法和夹心法两种。前者是用酶标抗原与样品 中的抗原竞争结合电极上的抗体，催化氧化还原反应，产生电活性物质而引起电流变化， 从而可测得样品中抗原浓度；后者则是在样品中的抗原与氧电极上的抗体结合形成免疫 复合物后，再加酶标抗体与传感器表面中的抗原结合，形成夹心结构，从而催化氧化还 原反应产生电流值变化。文献己报道采用酶联免疫吸附试验及多功能电流免疫传感器检 测了茶碱、载脂蛋白e 、促卵泡激素与黄体生成激素等人体血清中的生物活性物质1 3 引。 ( 3 ) 电导型免疫传感器是基于检测换能器( 电极) 与溶液之问的导电性变化而建立的 1 3 4 , 3 5 j 。d ii k s m a l 3 6 j 用交流阻抗法测定了y 干扰素，下限达到0 0 2 吖m i 。但是，这类传感 器易受实测样品中的离子强度和缓冲液容积的影响，存在较高的背景，且难以克服非特 固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 异吸附，故检测灵敏度欠佳。 h ) 电容型免疫传感器是建立在双电层理论上一种高灵敏非标记型免疫传感技术。金 属电极插到溶液中时，电极溶液界面的行为类似于平板电容器，它可以用类似于电容器 的物理方程来描述： c = a eo e d 其中c 为界面电容，eo 为真空介电常数，e 为电极溶液界面物质介电常数，a 是电 极与溶液的接触面积，d 是界面层厚度。电极溶液的界面电容能灵敏反应界面物理化学 性质的变化，当极性低的物质吸附到电极表面上时，d 就会增大，e 就会减少，从而使界 面电容降低。蛋白质分子量大、极性小，当它吸附到电极表面时，会显着地降低电极 溶液界面电容。当抗原抗体在电极表面复合时，界面电容相应地降低，据此检测抗原或 抗体的量。 1 3 生物活性材料的固定方法 在免疫传感器的制备中，如何将生物活性材料( a b ) 稳定、高活性的固定到传感器的 换能器上是至关重要的。因为它构成了生物传感器敏感识别部分( 分子识别元件) ，是 生物传感器的关键部件，直接决定生物传感器的性能和质量，如灵敏度、检测范围、检 测下限、选择性及寿命等。良好的固定化方法应该满足以下条件：( 1 ) n 定化后的抗原或 抗体能够保持良好的生物活性；( 2 ) i n 化层( 即生物敏感膜) 要有良好的稳定性、耐用性； ( 3 ) 能够对不同种类的抗体进行固定；( 4 ) 能够在不同材料的电极表面进行固定。至今已 经发展了多种固定化方法，主要包括：物理或活性吸附法、交联法、包埋法、共价键合 法和自组装方法。 1 3 1 吸附法 吸附法是一种通过物理吸附作用将生物活性材料固定于换能器表面的方法。这种方 法的优点是操作简便，无需化学试剂，对生物分子活性影响较小。不足之处是受溶液的 p h 变化、温度及电极基底的影响较大，而且由于抗原、抗体与电极基底表面结合力弱， 容易发生生物分子的脱落，从而降低了传感器的灵敏度及选择性，并进一步影响到了所 制备传感器的使用寿命。所以这种固定化方法在生物传感器的制备中应用范围比较小 【3 7 l o 1 3 2 交联法 交联法【3 8 l 是利用双( 多) 功能官能团试剂的桥梁作用将生物分子( 抗原、抗体) 固 定在换能器的表面。最常使用的交联剂( 如戊二醛) 。这是一种普遍使用的方法，但这 种方法的主要缺点是生物敏感膜与换能器表面结合力不强，固定的稳定性较差，同时， 交联剂对生物分子的活性也有一定的影响。 1 3 3 包埋法 包埋法是将生物分子包埋于聚合物膜或表面活性剂基底中，它一般不需要与生物物 6 固定免疫分子的新方法及其传感性能的研究 质的残基进行结合反应，很少改变生物活性物质的高级结构，因而生物活性损失很少。 传统的包埋法主要有生物材料整体包埋法【3 9 】和表面包埋法【删。整体包埋法主要应用于电 化学生物传感器制备中，将生物材料、电导材料以及粘结剂一起混合均匀，形成导电复 合材料压至特制的管材中，并形成电连接，从而获得生物材料修饰电极。电化学酶生物 传感器和免疫传感器均可用此方式构建；表面膜包埋法则是利用特定的膜将生物材料固 定在换能器的表面，获得生物敏感膜，可利用的膜材料较多如n a f i o n 、l b 膜、溶胶凝 胶膜以及各种导电聚合物膜。将抗体固定于导电聚合物薄膜修饰的电极表面，导电聚合 物薄膜既起到作为固定化抗原、抗体的基质的作用，又起到在抗原、抗体与电极之间进 行电子传输的作用。通常用作固定免疫物质的基质的导电聚合物体系有聚吡咯、聚苯胺、 聚噻吩和聚苯酚等。其中，邻苯二胺具有良好的水溶性及温和的电聚合条件，所以常 用于蛋白质的固定。将聚邻苯二胺用于固定酶已有大量的文献报道1 4 2 , 4 3 】。蒲晓允用聚 邻苯二胺嵌合葡萄糖氧化酶检测葡萄糖，灵敏度为0 3 9m a m m o l l ，响应时间5s ， 线性范围是3 5 7 5m m o l l ，稳定性为2 5d 。 1 3 4 共价键法 共价键合法心，4 5 1 是通过特殊化学键的形成将生物分子固定化于电极基质表面。共价 键合法是非常普遍应用的一种固定化方法，要实现生物分子与换能器的共价键合，首先 必须对换能器表面进行处理或活化，引入活性反应基团，如n h 2 、c o o h 等，然后用 偶联剂将生物材料与换能器表面的活性基团共价连接，从而将生物分子固定。利用这种 方法制备的生物传感器的使用寿命要比采用吸附法制备的传感器的寿命长，然而由于共 价键的形成，在一定程度上降低了生物分子活动的自由度且无法控制固定在电极表面生 物分子的取向、分布状态和传感元件的空间位阻，甚至影响到生物分子的化学结构而降 低其生物活性，从而影响到传感器的整体性能。 1 3 5 自组装固定法 自组装( s e l f - a s s e m b l y ) 是8 0 年代新兴的一种非常简单的成膜技术，该技术提供了在 分子水平上方便的构造理想界面的手段，所得到的自组装单分子层膜( s e l fa s s e m b l e d m o n o l a y e r s ，s a m s ) 具有优于传统的l b 膜的有序性与稳定性的特点，在生物传感器、 催化、电子转移反应、分子器件等众多领域中都有广泛的应用前景，从而成为近年来界 面化学与材料科学领域研究的热点i 铂 4 7 j 。 1 4 纳米技术 纳米粒子( n a n o p a r t i c l e s ) 是指粒径为纳米级的超细颗粒，其范围一般为1 1 0 0 n m 。纳 米材料被认为是跨世纪材料研究领域的热点，有“2 1 世纪最有前途的材料”的美誉。当物 质的尺度小到定程度时，则必须改用量子力学取代传统力学的观点来描述它的行为。 纳米材料，介于原子簇或分子簇与宏观大块