（微生物学专业论文）海南根瘤菌i66结瘤基因nodd的克隆及其功能检测.pdf

摘要 摘要 海南根瘤菌( r h i z o b i u mh a i n a n e n s e ) 1 6 6 分离自我国海南省。( 是我国特 有的根瘤菌资源。 “ f 提取1 6 6 的总d n a ，经酶切验证其质量适合于构建部分基因文库。根据不 同根瘤菌的n o dd 基因的上下游保守序列设计引物，) ，以1 6 6 的总d n a 为模板， 再以该引物进行p c r 扩增，得到约7 0 0 b p 的片段用地高辛标记法将其标记为探 针。再将其与含sm e j i l o t i 的n o dd 基因的质粒进行s o u t h e r n 杂交呈阳性，) 7 。 证明所得片段为1 6 6n o dd 基因的一部分。 用s a ci 完全酶切z 6 6 的总d n a 后，f 电泳，将凝胶从上到下分成5 部分， 分别回收d n a ，以其为模板，以上述引物进行p c r 扩增，把呈阳性的片段连接 到p u c l 8 载体上，构建部分基因文库。提取转化子的质粒，以其为模板，以上 述相同的引物进行p c r 扩增，初步筛选阳性克隆，再以点杂交验证，j 得到6 个 阳性克隆，选取其一命名为p u c t d ，用s a c i 酶切质粒p u c t d ，得到2 2 k b 的插 入片段，由于插入的d n a 片段的大小合适，故无需亚克隆，可直接将质粒送去 、， 测序。) 测序结果显示为，1 6 6n o d 口基因与sm e l i l o t in o dd 基因高度同源。 ， 回收s a c i 酶切后2 2 k b 大小的插入片段，将其连接到具有广泛寄主的载体 p b b r l m c s 5 上，筛选转化子，经酶切验证，得到p u c t d 1 。三亲本杂交把 质粒p u c t d 一1 转入豌豆根瘤菌蚕豆生物型l p r 5 0 4 5 中进行类黄酮诱导试验，结 果，所得的接合子能在含有毛地黄黄酮的f y 平板上呈现蓝色，说明1 6 6 的n o d d 基因能接受苜蓿分泌的毛地黄黄酮的诱导，激活其他结瘤基因的转录，其n o d d 蛋白具有结瘤调节的功能。 关键词：海南根瘤菌1 6 6 ，结瘤基因，p c r 扩增筛选，功能检测 y i ! 旦奎些查堂堡主堂丝堡兰 a b s t r a c t r h i z o b i u mh a i n a n s e n s e1 6 6w a si s o l a t e d f r o mr o o tn o d u l e so f d e s m o d i u ms i n u a t u mf r o mh a i n a np r o v i n c e t h et o t a ld n ao f1 6 6w a se x t r a c t e db yt h er o u t i n ew a ya n d d e t e c t e di tb yt h ee n z y m ed i g e s t i n gt om a k es u r ei t sq u a l i t yb es u i t a b l e f o rt h ec o n s t r u c t i n g1 6 6n o dd g e n el i b r a r y c o n s e r v e ds e q u e n c e sw e r e o b t a i n e da ss e v e nr h i z o b i u mn o dd g e n e w e r ec o n t r a s t e du s i n gt h e s o f t w a r ed n a m a n ；a n do i i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s f o rp c rw e r e d e s i g n e df r o mt h e s es e q u e n c e s b a s i n gt h e1 6 6t o t a ld n a p c r w a s p e r f o r m e d a n di t s p r o d u c t w a s h y b r i d i z e d w i t h p l a s m i d p y s d l 亿o n t a i n i n g & m e l i l o t in o 扣) b ys o u t h e l t ld o tb l o t t h ep o s i t i v e d o t p r o v e d t h a tt h ep c rr e a c t i o n p r o d u c tc o n t a i n i n g7 0 0 b p d n a f r a g e m e n tw a sp a r to f 1 6 6n o dd g e n e s a c lw a ss e l e c t e dt o d i g e s t t h et h e1 6 6t o t a ld n a 。a f l e r e l e c t r o p h o r e s i so n a1 a g a r o s eg e l t h eg e lw a sc l e a v e di n t of i v ep a r t s f r o mt h eu p p e rt ot h eb o t t o mu n d e rt h eu ve x t r a c t e dt h e mf r o m t h eg e la n ds c r e e n e dt f l e mb yp c r t h ep o s i t i v eb a n d sc o n t a i n i n g 1 3 2 3k bs a c f r a g m e n t sw e r el i g a t e dw i t hp l a s m i dp u cl8a n dt h e p a r t i a l 1 6 6n o ddg e n e l i b r a r yw a sc o n s t r u c t e d t h e nt h ep o s i t i v e c o l o n i e sc o n t a i n i n gn o d dw e r ef o u n db yt h ep c r s c r e e n i n gm e t h o d a n dw e r ec o n f i r m e d b y t h es o u t h e r nd o tb l o th y b r i d i z i n gw i t ht h ep c r r e a c t i o n p r o d u c t ( 7 0 0 b p ) a n dt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d p u c t dw a s o b t a i n e d t h ei n s e r t e db a n dw a s 2 2 k b ，b e i n gs u i t a b l ef o rt h es e q u e n c i n g d n ah o m o l o g y a n a l y s i s s h o w e dt h a t1 6 6n o d dg e n es h a r e d h i g h h o m o l o g y w i t ht h eg e n e ：s m e l i l o t i 9 2 1 6 61 7 0 d d g e n e w a si n t r o d u c e di n t o r 1 e g u m i n o s a r u m 巩v i c i a e l p r 5 0 4 5 ( p s y m 。，p m p l5 4 ) f o r f l a v o n o i d i n d u c i n ge x p e r i m e n t s a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a t1 6 6n o d dc o u l dr e s p o n d e dt ol u t e o l i n w h i c hw a ss e c r e t e db va l f a l f a o k e y w o r d s ： r h i z o b i u mh a i n a n s e n s e1 6 6 ，n o d u l a t i o n g e n e ，s c r e e n i n g t h e l i b r a r yb yp c r ，f u n c t i o n a la n a l y s i s 文献综述 第一部分文献综述 一、根瘤菌与豆科植物的共生关系 根瘤菌是一类土壤微生物，包括根瘤菌属( r h i z o b i u m ) 、慢生根瘤菌属 ( b r a d y r h i z o b i u m ) 、固氮根瘤菌属( 爿z o r h i z o b i u m j 、 中华根瘤菌属 f s i n o r h i z o b i u m ) 、中慢生根瘤菌属( m e s o r h i z o b i u mj 和异根瘤菌属 ( a l l o r h i z o b i u m ) ，而且在也发现m e t h y l o b a c t e r i u m 、b u r k h o l d e r i a4 自t r a l s t o n i a 能在豆科植物上结瘤的根瘤菌。它们能侵染豆科植物形成一种独特的结构一一 根瘤( 或茎瘤) 。根瘤菌在其中分化成类菌体，将大气中的分子态氮转化为氨态 氮供植物利用，而植物则为细菌提供其生长所需的养料，这就是所谓的共生固 氮作用。豆科植物每年通过这种作用固定的氮相当于全世界化肥工业所固定的 氮的总和。因此，共生固氮在农业上具有巨大的潜在的应用价值。 根瘤菌与豆科植物之间存在着特殊的共生关系，特定的根瘤菌菌株或根瘤 菌生物型( b i o v a r ) 只能侵染一种或几种特定的豆科植物，形成能固氮的根瘤。也 就是说，属于同一个互接种族的植物可以与同一种根瘤菌形成根瘤，但属于不 同互接种族的植物则不能与该菌种形成根瘤。根瘤菌与豆科植物之间的共生关 系具有专一性，这种宿主专一性是共生固氮体系的一个重要特征，也是限制其 在农业上推广应用的一个主要因素。如表1 所示( v a nr h i j n 和v a n d e r l e y d e n ， 1 9 9 5 ；k r i s h n a ne ta l ，1 9 9 5 ) 。 随着根瘤菌和植物共生关系研究的深入，从自然界中不断地分离到一些新 的根瘤菌菌株，它们与植物的共生关系跨越了已知的互接种族关系。基因工程 方法可使根瘤菌和豆科植物发生变异，导致这种互接种族关系发生特定的变化， 1 中国农业大学硕士学位论文 从而使上述共生关系发生了很大的变化。 表l根瘤菌与植物的互接种族关系 根瘤菌宿主植物 苜蓿属( m e d i c a g o ) ，草木樨属 苜蓿中华根瘤菌( s , m e l i l o t i )( m e l i l o t u s ) ， 胡芦巴属( t r i g o n e l l a l 豌豆根瘤菌阻l e g u m i n o s a r u m ) 蚕豆生物型( b 玑v i c i a e ) 豌豆属( p i s u m ) ，香豌豆属( 砂哟垆批砂， 巢菜属( v i c i a ) ，小扁豆属( l e n s ) 三叶草生物型( b v ，啪棚 车轴草届( n 扣地m ) 菜豆生物型( b v ，却船印，f菜豆( p h a s e o l u sv u l g a r i s ) 百脉根根瘤菌限肠删百脉根属d ，蚶) 华癸搌瘤茵氓h 姗h i f ) 紫云英m 口髀l 她s 跏i c m 砖 鹰嘴豆根瘤菌( r c i c e r o鹰嘴豆( c i c e ra r & t i n “州 月s n g 尺刀一 热带豆科植物( 1 l o e l f f 蓠) p a r a s p o 疗妇 s p p ( - 非豆_ 科1 热带根瘤菌俾舳p 七一 银合欢属e “明n ) ，菜豆( p v “咖r 括) 大冀豆属( m a c r o p t i l i u m ) 菜豆根瘤菌佛e t l o 菜豆- ( p v u l g a r i s ) | b 羊豆耗密菡嗥斛1 e 罨a e ) 啦茸豆铡e g n 妤c 1 舶1 1 t s i 高加索山羊豆( g o ，招n ，口胁) 文献综述 费氏中华根瘤菌( s f r e d i o 慢生大豆根瘤菌( b j a p o n i c u m ) 埃氏慢生根瘤茵佃e l k a n i 0 b s pp a r a s p o n i a 茎瘤固氮根瘤菌 ( a z o r h i z o b i u mc a u l i n o d a n s ) 羽扇豆根瘤菌僻1 u p i n i ) 豇豆根瘤菌俾c o w p e a ) r h i z o b i u m 印g r h 2 大豆( g l y c i n em a x ) ，野大豆( g s o j a ) 木( c a j a n u sc a j a m ，具爪豇豆_ ( v i g n a u n g u i c u l a t a ) 大豆( g m a x ) ，野大豆( g s o j a ) 等 大豆( g m a x ) ，野大豆( g s o j a ) 等 p a r a s p o n i as p p 田菁属( s e s b a n i a ) ( 茎瘤) 羽扇m _ ( l u p i n u s p o l y h y l l u s ) ， 紫花鸟足豆( o r h n i t h o p u ss a t i v u s ) 花生口r a c h i sh y p o g a e a ) ，猪屎豆 ( c r o t a l a r i ap a l l i d a ) ，绿豆( p h a s e o l u s r a d i a t u s ) ，豇豆( v i g n as i n e n s i s ) ， 胡枝子旺e s p e d e z ab i c o l o r ) ， 金合欢属似c c l c 神，菜豆属( p h a s e o l u s ) ， 巢菜属( v i c i a ) ，牧豆树属( p r o s o p i s ) ，色 拉豆( m a t r o p u r p u r e u m ) ，三叶草属 ( n 咖l i u m ) ，百脉根属o t u s ) 然而，实际情况远远要比表1 所反应的关系复杂。很明显，宿主专一性程 度在各种根瘤菌之间变化极大。有的菌种的寄主范围很窄，如尼l e g u m i n o s a r u m b v t r i f o l i i 。有的菌株则寄主范围很广，如尼s p n g r 2 3 4 ，至少可与11 0 个不 同的豆科植物属和一个非豆科植物属p a r a s p o n i a 结瘤( l e w i n ，1 9 8 7 ；r e l i c ， 1 9 9 4 ) 。研究表明，这种宿主专一性是由基因在分子水平上控制和决定的，在很 里坐些查堂堡主堂焦堡壅 大程度上取决于共生体双方所产生的低分子量信号分子及对信号分子的识别与 交换。具体地说，豆科植物在种子萌发和根的生长过程中释放一类信号分子， 主要是类黄酮物质，它能被根瘤菌结瘤调节基因产物( 主要为n o d d 蛋白) 所 i 识别，并诱导根瘤菌中与结瘤有关的结瘤基因的表达，导致根瘤菌分泌产生一 类脂壳寡糖( l i p o c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ) 化合物的信号分子，即结瘤因子( n o d f a c t o r ) ；结瘤因子反过来作用于寄主植物，引起根部表皮、皮层和中柱鞘组织 的一系列反应，启动植物的结瘤过程。 二、结瘤基因的结构和功能 结瘤基因是指根瘤菌中与结瘤有关的基因，或与这些基因协同表达的基 因。n o d a 、n o d b f r ln o d c 是最早发现的结瘤基因( r o s s e ne ta ，1 9 8 4 ：t o r o k e ta 1 ，1 9 8 4 ) ，而尼s p n g r 2 3 4 中的n o e l 基因是近年来鉴定的结瘤基因 ( f r ej b e r ge ta 1 ，1 9 9 7 ) 。由于遗传工具的发展，如广宿主范围的克隆载体、 粘粒载体的应用、粘粒文库的构建、结瘤突变株的互补试验、染色体图谱分析、 随机与定点突变、标记技术，以及噬菌体转染等方法的应用，使结瘤基因的研 究更加深入和广泛( d o w n i ee t 日，】9 8 3 ，1 9 8 5 ：f i s h e re ta ，1 9 8 5 ) 。因 而，自1 9 8 2 年从苜蓿中华根瘤菌( sm e l i l o t i ) 中得到第一个结瘤基因以来，已 经鉴定和克隆了6 4 个结瘤基因( h u n g r i a m ，s t a c e y g ，1 9 9 7 ) 。 结瘤基因按其功能可分成4 种类型：调节基因：门d 彩基因是组成型表达 的，存在于所有的根瘤菌中。调节基因的产物n o d d 蛋白可以和宿主植物的信号 分子( 类黄酮) 特异结合，从而诱导其他结瘤基因的表达。除刀d 彬外，目前又发 现了其他一些调节基因，如苜蓿中华根瘤菌( & m e l i l o t i ) 中的n o l r 基因，以及 大豆慢生根瘤菌( 口j a p o n i c u m ) 中的n o i a 和n o d v # 基因等。共同结瘤基因， 包括n o d , t s g 它们在不同的根瘤菌之间具有较高的同源性，功能上可以互补。 一 兰坚簦垄 一一_ 一 它们的蛋白可以催化结瘤因子基本骨架的合成。宿主专一性( h o s ts p e c i f i c n od i ，1 a t i o n h s n ) 基因。这类基因决定了根瘤菌特定的宿主范围。不同的根瘤菌 具有不同的宿主专一性基因。如苜蓿中华根瘤菌中的h s n 基因包括n o d h , n o d p q 等。有些宿主专一性基因编码的酶可催化结瘤因子上不同侧链或基团的取代和 添加。基因型专一性( g e n o t y p i cs p e c i f i cn o d u l a r i o n ，g s n ) 基因，这类基 因决定了根瘤菌对同一种豆科植物的不同品种( 不同基因型的植株) 具有不同的 结痛能力。如豌豆根瘤菌蚕豆生物型( 尼 c g u i i l f h o s i f l i i n b y v i c i a e ) t o m 菌株 中的n o d x ，以及大豆慢生根瘤菌中的n o l a 基因就属于基因型专一性基因 ( f r i m i n j 1 9 9 3 ) ( 一) 结瘤基因的结构 在rl e g u m i n o s a r u mb v s v i c i a e 和护扣，眠sm e l i l o t i 、r e t l i 、r g a l e g a e 、 rt r o p i c i 和r s p n g r 2 3 4 中，结瘤基因定位于共生质粒上，只有sm e l i l o t i 、 rl e g u m i n o s a r u mb y v i c i a et o m 菌株及月s p n g r 2 3 4 中的调节基因n o l r 位于 染色体j z ( k o n d o r o s i e t a 1 ，1 9 8 9 ) 。而在另外一些根瘤菌中，如且j a p o n i c u m 、 a z o r h i z o b i u mc a u l i n o d a n s 、触疥f 和ml o t i ，所有的结瘤基因都位于染色体上。 有些结瘤基因，如n o d a 、n o d b 和n o d c 只有一个拷贝；而另外一些基因，如 n o d m ) 、n o d p 、n o 坦和n o d t 等，则在基因组中还存在其他的同源序列( b a e v e t a 1 ，1 9 9 1 ) 。在许多情况下，结瘤基因成簇存在。绝大多数结瘤基因处于不同的 操纵子中，这些操纵子在不同的根瘤菌中具有保守性。bj a p o n i c u m 的 ”o d 翻b 傩u 【肪。埘r o 忉。以操纵子是最大的一个，它长约1 2 k b ，包含1 2 个基因。 n o d a 、n o d b 、n o d c 、n o d d 、n o d l 和n o d , l 基因存在于所有的根瘤菌中，而其他 结瘤基因只存在于部分或单个根瘤菌或菌株中。n o d a 、n o d b 和n o d c 基因总是 位于个操纵子中，但也有例外，如在ml o t i 、r p f ，f 和r s p n 3 3 菌株中，它 们就分处于不同的操纵子中( c l o u t i e re l a l ，1 9 9 6 ；s c o t te t a l ，1 9 9 6 ) 。除上述基因 s 皇里垒些叁堂堡主堂生堡茎 外，不同的根瘤菌中还含有不同的结瘸基因。图l 表示的是目前研究较多的根 瘤菌结瘸基因的遗传图谱。 专 挺华岂掣捌雌卜h 3 r - g n _ ”- 删n h “槲 “x ：姒n = u l r c e p ；d o a c | c , d 。 h 足) 站鄙磷酏如凸铡溜牮剃h 卤玉h 榔扁 二 o一 b 洲趟诰繇曲书 鞋地：$ i 译掣一一孓 矿肆皓芷：- 搿1 r 萄皇母_ 彩 s # 1 r o l 尊赢棒制赢芦南 r 黛k 弓6 芒生：! ：拈_ t - ， 盎一舀b 舀h o u m h ac$uijzchkd 卜c d 【3 d ) 】工) l 刚强时硝h 卜p r o n o r 2 m i + i # 一 h _-_ ” ，- | _ - ，- xw 1uv mr _ h _ 嘲 磐一 巾 图1 不同种根瘤菌的结瘸基因遗传图谱 文献综述 ( 二) 结瘤基因的功能 根瘤菌的结瘤基因的功能是复杂的，呈现多样化。现将目前已知的结瘤基 因及其产物的功能归纳于表2 表2 结瘤基因产物的功能 具有此基因 基因基因产物的功能 的菌株 n o d a 乙酰转移酶，参与结瘤因子的非还原端的n 一取代过程所有菌株 n o d b 舰既基酶，参与结熘凼于的匍稽器聚话骨柴的合成所有菌株 n o d c 聚乙酰氨基葡糖合成酶，催化一乙酰一d 一氨基葡糖残基间所有菌株 的b 一1 ，4 键，合成聚乙酰氨基葡糖低聚体的骨架 n o d d 转录n o d 基因的激活因子，与激活蛋白质l y s r 相类似所有菌株 n o d e b 一酮脂酰基合成酶( 缩合酶、柠檬酸合酶) 在合成结瘤s m ，r l v ，r 1 t 因子的酰基链中起作用，与宿主专一性有关 n o d f 酰基载体蛋白( c a p ) ，参与合成结瘤因子脂酰键，与宿s m ，r 1 v ，r l t 主专一性有关 n o d o 核话爵戥俐匈裙脱氢酶，认为它在修饰结瘤因子脂酰化 s m 侧链中起作用，与宿主专一性有关 n o d h 磺基转移酶，参与结瘤因子合成中含硫基团的转移，引 s m ，r t ，r n 起苜蓿特殊结瘤因子的产生，与宿主专一性有关 n o d i a t p 结合蛋白，与7 0 d j 起构成转运系统 所有菌株 n o d j膜蛋白，与，7 d 以一起构成膜转运系统 所有菌株 n o d ( 尚不清楚，与n o d y 类似 r n n o d l 乙酰转移酶，在6 一o 一乙酰化结瘤因子形成中起作用 r l v ，r 1 t ，s m ! 笪坐些叁堂堡主堂堡鲨奎一 n o d m葡糖胺( 氨基葡糖) 合成酶，它对合成结瘤因子的糖基 s m ，r l v ，r l t 亚单位中起作用 n o d n参与结瘤因子的产生过程s m ，r l v ， h o d oc a ”结合蛋白，与溶血因子( h l y a ) 和相关的转运蛋白类r l v ， 似，可能在根瘤菌一豆科植物相互作用的早期起作用 n o d pa t p 硫酸化酶，参与结瘤因子还原端的o 一取代作用 s m ，r t n o d qa t p 硫酸化酶和a p s 激酶，参与结瘤因子还原端0 一取代 s m ，r t 作用 n o d r位于染色体上，功能不清楚 n o o s s 一腺苷甲硫氨酸转移酶，参与结瘤因子还原端的n 一取代 r n ，r t ，a c ，b j 作用 ，s f 1 7 0 d t 与宿主专一性有关，是一种膜蛋白r l v r 1 t n o d u6 - 0 一氨基酰基转移酶 r n ，r t ，a c ，b j ，s f 1 7 0 d v 双组分调控系统，感受子蛋白，转录激活子蛋白 b j ， n o d w 双组分调控系统的激活子蛋白，可能调节一个或一些尚b j 未知晓的基因 n o d e 乙酰转移酶，与结瘤因子还原端o 一取代作用有关，与宿r l v ( 1 、o m ) 主专一性有关 1 7 0 d y 功能不清楚 b j ， n o d z 墨角藻糖转移酶，与宿主专一陆有关 a c ，r n ，r e n o l a调节因子 b j n o 1 3 与分泌系统有关 r n ，s f - 一 苎坚堡堕 -一 n o (诱导突变后扩大寄主范田 s f n o i o凋控因予 r 1 p n o e产生细胞周质蛋白r 1 p n o 尸与运载有关 s m n o l g与运载有关s m n o |与运载有关s m n o i与运载有关s m n o i延迟结瘤 s f n o 与g d p 墨角藻糖合成有关a c n o i l 0 一乙酰基转移酶 m l n o l k l 与n o l z 有功能上的协同b j n o l 功能未知b j n o l o 与2 一甲基墨角藻糖有关b j n o 户 功能未知r l p n o l o功能未知s m n o 厅 n o d 基因转录的抑制因子s m n o l s 功能未知，与硫胺素合成似乎有关s m n 0 1 ， 与( h r p i ) 分泌系统有关s f ，r n n o 与分泌系统有关 s f ，r n n o v 与分泌系统有关 s f ，r n n o 与( h r p a ) 分泌系统有关 s f ，r n n o l x 与分泌系统有关 s f ，r n n o l ， 功能未知，影响蚕豆的结瘤 b j 9 中国农业人学硕士学位论文 n o z诱导正常结瘤 s m n o e a甲基转移酶s m n o e b 功能未知( 在内膜中) s m d o e c阿拉伯糖基化的膜整合蛋白a c h o e d功能未知 b j n o e e 与墨角藻糖的甲基化有关r n 7 2 0 e f 功能未知s f n o o 2 - 0 一甲基转移酶r n n o e f f卜p 一甘露糖鸟苷酸转移酶r n n o e l g p d 一4 ，6 - 甘露糖脱水酶r n 备注：a c ：茎瘤圊氮根瘤菌：b e ：埃氏慢生根瘤菌；b j ：大豆慢生根瘤菌：r e ：菜豆根 瘤菌；s f ：费氏中华根瘤菌；m 1 ：百脉根中慢生根瘤菌：r l p ：豌豆根瘤菌菜豆生物型；r t t ： 豌豆根瘤菌三叶草生物型；r 1 v ：豌豆根瘤菌豌豆生物型；s m ：苜蓿中华根瘤菌；r n ：广宿主 根瘤菌n g r 2 3 4 ：r t ：热带根瘤菌 - ( = ) 未知功能的结瘤基因 目前对有些结瘤基因的生化作用还不了解。其中一些基因编码的蛋白与已 知蛋自没有同源性，因而很难推测其功能。尽管如此，对有些基因的生物学作 用已有相当的了解。 n o d k 是早期发现的结瘤基因，它存在于r s p n g r 2 3 4 中，位于 o d a b c l j 。 操纵子的起始部位( s c o t t ，1 9 8 6 ) 。它和b j a p o n i c u m 中的门d d 】，有关， d d y 也位 于n o d a 的上游( n j e u w k o 叩e t a l ，1 9 8 7 ) 。n o d y 希1n o d k 可能编码膜蛋白。 n o d n 的功能还不清楚，在r ，v i c i a e 和sm e l i l o t i 中它与 o 捌位于同一个 跚q 3 ( s u r i n a n d d o w n i e ，1 9 8 8 ；b a e ve ta 1 ，1 9 9 1 ) 。在s 脚p l i l d t i 中，7 d d n 的突 o 文献综述 变j 以降低合成结瘤因子的数量，因此，它可能与n o d m 一样参与产生合成 u d p g i c n a c 所需的前体。 d f c 基因是在触d iu s d a 2 5 7 中发现的，它的突变使该菌株获得了在大 豆栽培品种“m c c a l l ”上结瘤的能力( k r i s h n a na n dp u e p p k e ，1 9 9 1 a ，1 9 9 2 ) 。推测 7 0 l c 基因的产物是一种水溶性蛋白，与在多种细菌中存在的热激蛋白d n a j 相 似。与d n a j 不同的是，n o l c 并不受热激诱导，也没有证据表明它受n o d d 的 润控。 n o u 是在s y r e g f i 中受异类黄酮诱导的两个相连基因中的一个( s a d o w s k y e t a ，1 9 8 8 ；b o u n d y m i l l se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。这两个基因都捌有自己的启动子，二者的 起动子序列同源性很高，但它们与n o d d 蛋白结合的n o d b o x 启动子序列同源 性f 艮低。n o l j 的突变抑制了它在大豆上的结瘤能力，而其上游基因( o r n ) 的突变 则降低了它的竞争结瘤能力。 n o l p 和n o l e 基因存在于足t p h a s e o h 中，位于可诱导的n o db o x 启动子下 游( d a v i sa n dj o h n s t o n ，1 9 9 0 ) 。n o l e 蛋白定位于细胞周质中。n o l p 可能是一个 比较小的亲水蛋白。n o l p 和n o l e 与已报道的基因无序列同源性，它们的突变也 不影响足fp h a s e o l i 在蚕豆上的结瘤能力。 丑j a p o n i c u m 的n o l n 基因位于疗d 删b c ，呦2 口f 脚忉操纵子上。n o l n o 基 因的缺失突变和单独n o l o 的突变对结瘤因子合成的影响没有区别，它们都影响 到甲基岩藻糖基团的合成( l u k ae t 甜。】9 9 3 ) 。 n o l q 和n o l s 基因位于m e l i l o t in o db o x 启动子下游，但它们不受类黄酮的 诱导( p l a z a n e te t a l ，1 9 9 5 ) 。n o l q 的突变降低了它在m e d i c a g ol u p u t i n a 上的结瘤 能力，但对结瘤因子的生物合成没有影响。n o l s 编码的蛋白与最m e l i l o t i 的t h i l 蛋白高度同源。t h i l 与硫胺素合成有关。因为无法构建n o l s 的插入突变，所以 对其表型性状缺乏了解( p l a z a n e t e ta 1 1 9 9 5 ) 。 1 1 ! ! 鬯坐些查堂堕主堂笪丝奎一一 占儿眇d 肝i c “中n d l y z 基因位于n o d d 和n o d w 诱导的n o d b o x 下游 f d o c k e n d o r fe ，a ，1 9 9 4 ) 。n o l y 的突变予对在蚕豆上的结瘤具有影响，而n o l z 的突变子不影响结瘤。这两个基因的突变都不影响结瘤因子的合成，它们和已 报道的基因无序列同源性。 ”d 鲥和”d p b 位于sm e l i l o t in o d l 基因的下游，它们的突变强烈地抑制在 m e d i c a g ol u p u l i n a 和m e d i c a g ol i t o r a l i s 上的结瘤能力，但不影响在m e d i c a g o l r u n c a t u l a 上的结瘤，侵染线的形成也受到极大的影响，但不影响结瘤因子的产 生( a r d o u r e l e la 1 ，1 9 9 5 ) 。n o e a 与e c o l i 甲基转移酶的s 腺苷甲硫氨酸结合区 域有一定的同源性，但它与n o d s 无任何同源性，n o e b 基因可能编码一种膜整 合蛋白，该蛋白与其他蛋白不具有同源性。 三、结瘤因子 ( 一) 结瘤因子的结构 在根瘤菌中，结瘤基因能编码各种酶，催化合成并分泌出结瘤因子。结瘤 因子是根瘤菌返还给宿主植物的信号分子，它是一类脂壳寡糖化合物，都含有 3 5 个b l ，4 糖苷键连接的n 乙酰葡糖胺骨架，在非还原性末端具有n 一脂酰 基。但不同根瘤菌分泌的结瘤因子在侧链上羟基的取代基因和脂肪酰链的长度 和不饱和度方面表现出较大的差异( 图1 ) ( h u n g r i a m ，1 9 9 7 ；p a n a g i o t a m ， 1 9 9 5 ) 。而这些结构上的差异是与根瘤菌的寄主范围紧密相关的。根瘤菌的共同 结瘤基因决定了结瘤因子的骨架，而宿主专一性基因则参与侧链基团的修饰。 兰燮簦竺 一一一 r r ： 图2 结瘤因子的基本结构 仉 对n o d a b c 的功能进行研究，得到了结瘤因子合成的途径：n o d c 参与以尿 苷二磷酸一n 一乙酰葡糖胺( u p d n a c e t y l 9 1 u c o s a m i n e ) 为前体，合成几丁质寡 多糖( c h i t i no l i g o s a c c h a r i d e ) 骨架的生物学过程：随后在n o d b 作用下将几 丁质寡多糖中非还原端糖分子脱氮乙酰基化，产生活性胺基；n o d a 的作用是将 脂肪酸转到胺基上，形成l c o 核心结构。k a m s t 等发现n o d c 是壳多糖中单糖数 目的决定因子，l o c 骨架的链的长短强烈影响l c o 在宿主植物上的活性。1 9 9 6 年，3 个实验室几乎同时报道，n o d a 在结瘤因子合成过程中所转移的不同脂肪 酸具有宿主专一性( r i t s e m a ，t e ta 1 ，1 9 9 6 ：d e b e l i ee ta 1 ，1 9 9 6 ：r o c h e e t a 1 ，1 9 9 6 ) 。这些研究结果表明，共同结瘤基因在不同种问的交换不可避免影 响宿主范围，这与以前认识相悖。在这之前认为，共同结瘤基因可以在不同种 根瘤菌之间相互替换或互补，其作用是引起宿主根毛变形、卷曲及根皮层细胞 分裂。这些新近研究结果说明，n o d a 、n o d b 和n o d c 这些等位基因上的突变将 会引起结瘤因子结构的某处变化，进而导致宿主范围的改变。因而，r o c l l e 等 认为在苜蓿中华根瘤菌中的n o d a b c 也是宿主专一性结瘤基因。 除共同性结瘤基因外，宿主专一性结瘤基因在结瘤因子合成中起重要作用。 l3 里鳖些盔堂堡堂堡堡窭一 这些基因包括n d d e f , 册d h , n o d ln o d p , n o d o , n o d s u , n o d x , , n o d z 等，它们对 l c o 骨架起特定的修饰作用，这种修饰替换作用既可发生于非还原端又可在还 原端进行，包括甲基化、脂肪酸置换、乙酰化和氨甲酰化等。如刀。碰f 决定酯 。 酰基的结构，n o d l 催化非还原端的乙酰化，而n o d x , , 则催化还原端的o 一乙酰化 在苜蓿中华根瘤菌中n o d h 和n o dp q 决定结瘤因子的磺酸化；在大豆根瘤菌和 广谱宿主根瘤菌n g r 2 3 4 中，结瘤因子的甲基化和2 0 一甲基墨角藻糖基化分别 由n o d s 和n o d z 来完成( f i r m i n ，j l ，e ta 1 ，1 9 9 3 ) 。采用突变和互补实验进 行特定豆科结瘤范围的宿主专一性基因功能的研究，结果表明，通过这些手段 可以将一些根瘤菌菌株宿主范围扩大到热带银合欢属( l e u c a o n a ) 的一些树种。 在这些树种结瘤过程中，编码甲基转移的n o d s 基因似乎是一个不可缺少的基因 ( l e w i n ，e ta 1 ，t 9 9 0 ：w a e l k e n s ，e ta 1 ，1 9 9 5 ) 。可是v a nr h i j n 等发现从巴西 l 1 e u c o c e p h a _ l a 树种中分离得到r h i z o b i u ms p b r 8 1 6 的n o d0 基因的功能 与热带根瘤菌( 厅。t r o p i c i ) 并u 宿主广谱菌株s i n c r h i z o b i u ms p n g r 2 3 4 中的 n o d s 相同，且当n o d0 基因转移到r e t l ic e 一3 后，该菌株获得了与 。e u c o c o p h a a 结瘤的能力( v a nr h ij n ，o ta j ，1 9 9 6 ) 。同样，将苜蓿中华根 瘤菌( sm e j i l o t i ) 的结瘤基因导入宿主范围广的热带根瘤菌( 尼t r o p i c 后， 发现s m e l i l o t i 的结瘤能力也传递给了见t r o p i c i 还发现1 7 , t r o p i c i 在苜 蓿上结瘤除了需要s m e l i l o t i 的宿主专一性基因外，其n o d a b c 也是必需的。 因此，任何一种根瘤菌的宿主范围至少部分是由其产生结瘤因子种类所决 定的。宿主广谱菌株s i n c r h i z o b i u ms p n g r 2 3 4 已证实可通过合成整族的l c o 信号来传递信息，即具备l c o 骨架的不同修饰系统( p r i c e ，e ta 1 ，1 9 9 2 ) 。然而， 所有菌株都产生一种结瘤因子混合物，现在还不清楚它对扩大宿主范围的重要 性质如何，或是同一宿主结瘤需要多种信号。反过来，植物与广谱还是窄谱结 瘤的根瘤菌形成根瘤的能力，是植物识别细菌产生的不同信号类型的结果。例 1 4 文献综述 如，菖蓿的有效侵染结瘤要求根瘤菌产生3 个特定位点发生置换的这类结瘤因 于。而菜豆可以与几种产生不同结瘤因子的根瘤菌种进行结瘤( d e n a r i e ，j ，e t a 1 1 9 9 6 ) 。表3 显示了不同根瘤菌的结瘤因子的特异性基团。 表3 不同根瘤菌的结瘤因子的特异性基团 菌株 r 1r 2r 3r 4r 5n 茎瘤固氮根瘤菌m ec 1 8 ：1 ，c 1 6 ：0 0 r s 5 7 】 埃氏慢生根瘤菌m e ，c 1 8 ：l u s d a 6 1h 一 大豆慢生根瘤菌hc 1 6 ：0 ，c 1 6 ：1 u s d a l1 0c 1 8 ：1 根瘤菌菌株m e ，c 1 6 ：0 ，c 1 8 ：0 g r h 2hc 1 8 ：1 ，c 2 0 ：1 根瘤菌菌株m ec 1 8 ：0 ，c 1 8 ：1 o r s l 6 4 5 根瘤菌菌株m ec 1 6 ：1 ，c 1 8 ：0 ， n g r 2 3 4c 1 8 ：1 菜豆根瘤菌m ec 1 8 ：1 c f n 4 2 c b ，hf u c ，ha r a ，h1 ，2 a c ，h m e f u ch 1 ，2 hm e f u ch2 hs ，hh c b s ，hh 2 c b ，h m e f u ch2 h a c m e f u c ，s m e f u c a c f u ch2 菜豆根瘤菌c e 3m ec 1 8 ：0 c 1 8 ：1ha c f u ch2 1 5 = 一 _ _ 了= 五一h f u c , m 1 4 o，1，2c18 费氏中华根瘤菌h ：i ，c 1 8 ：0 h u 。 u 曲s 咩d a 由1 9 化1 炯，崩菌h c 1 6 ：l e f f u u c c c l 8 ：1 h，h 。，1 ，2 费氏中华根瘤菌h 。“ “u u s d a 2 5 7 山羊豆根瘤菌 h 华癸中幔蚓麟 豌豆根瘤菌 三叶草生物型 a n u 8 4 3 h h 三叶草生物型h l p r 5 0 5 4 豌豆生物型h r b l 5 5 6 0 豌豆生物型t o m h 百脉根根瘤菌h n z p 2 2 1 3 百脉根根瘤