（药物分析学专业论文）胶束毛细管电泳在线推扫富集技术在兽药残留中的应用.pdf

摘要 惦。西 捅芰 在过去几十年中，兽药在畜牧生产中的应用显著增加，其对人体的危害日益显著， 由此导致的动物性食品中兽药残留问题越发突出。发展可靠、灵敏和实用的残留分析技 术无疑是检测和控制兽药残留、保证食用者安全和避免国际间有关贸易争端的重要前 提。毛细管电泳( c e ) 技术具有高速、高效、低消耗等优点，因其优点在药物分析中的 应用越来越广泛。由于受检测器、检测光程和进样量的限制，毛细管电泳( c e ) 技术检 测灵敏度不是很高，这使其在应用于痕量分析时受到一定限制，远不能满足体内痕量和 超痕量分析的要求；兽药残留通常采用的分离分析方法以及样品预处理过程操作繁琐， 测定成本高。通过采用胶束毛细管电泳( m e k c ) 在线推扫( s w e e p i n g ) 富集技术，在 一定程度上解决了以上两个难点。全文分为四个部分： 第1 章：介绍了兽药残留的危害及其常用检测技术。 第2 章、第3 章：采用在线推扫富集技术建立了胶束毛细管电泳法( k c ) 检测 动物肌肉组织和内脏( 肾脏、肝脏) 痕量喹诺酮类药物残留的方法。结果表明，生物样 品加入三氯乙酸去蛋白后即可直接进样上机检测，在优化分离条件下，环丙沙星富集倍 数可达6 0 0 倍。此方法弥补了毛细管电泳检测灵敏度低的缺点，大大减化了操作过程， 为动物食品中残留的痕量药物检测提供了一种简便可靠的方法。 第4 章：建立胶束毛细管电泳在线推扫富集技术快捷检测血液中百草枯浓度以及测 定超氧化物歧化酶( s o d ) 活力的方法，分析影响血液中百草枯浓度和s o d 活力高低的 因素。结果表明，百草枯的检测限为2 0 1 0 m g l ，平均回收率9 9 0 。胶束毛细管电 泳在线推扫富集技术因其简单快捷，适用于血液灌流前后百草枯浓度的监测；血液灌流 能有效除去其中的百草枯，提高s o d 的活力；灌流效果取决于s o d 活力的恢复，而后者 除取决于血液中百草枯浓度的降低以及上述各种影响因素外，还取决于患者自身年龄、 体质等多方面的因素。 关键词胶束毛细管电泳法在线推扫富集技术兽药残留痕量 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h ep a s tf e wd e c a d e s ，t h eu s eo fv e t e r i n a r yd r u gi na n i m a lp r o d u c t i o ni n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y , i ta d d e dt h e h a z a r dt o w a r d sh u m a nb o d yo b v i o u s l y t h er e s u l to fr e s i d u a l v e t e r i n a r yd r u gi nt h ea n i m a lf o o dw a sb e c o m i n gm o r es e r i o u s t od e v e l o pr e l i a b l e ，s e n s i t i v e a n dp r a c t i c a lt e c h n o l o g yw a sa ni m p o r t a n tp r e r e q u i s i t ef o rt h ed e t e c t i o na n da n a l y s i so f r e s i d u e so fv e t e r i n a r yd r u gi nc o n t r o l l i n g ，e n s u r i n gf o o ds a f e t ya n da v o i d i n gad i s p u t eo f i n t e r n a t i o n a lt r a d e t h ea p p l i c a t i o no fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) w a sb e c o m i n gw i d e ra n d w i d e ri nt h ef i e l do fp h a r m a c e u t i c a la n a l y s i sb e c a u s eo fi t sc e l e r i t y , h i g hp e r f o r m a n c ea n dl o w c o n s u m p t i o na n ds oo n c ew a sh a m p e r e db yt h el o wc o n c e n t r a t i o ns e n s i t i v i t ya s s o c i a t e d w i t ht h eo p t i c a lp a t hl e n g t hf o ro n - c a p i l l a r yp h o t o m e t r i cd e t e c t i o na n dt h em i n u t ev o l u m eo f s a m p l es o l u t i o nt h a tc o u l db e 蝎e c t e d s oi tw a sr e s t r i c t e dt om a k eat r a c ea n a l y s i s t h e s a m p l ep r e t r e a t m e n tw a sc o m p l i c a t e da n d i tw a s t e dt h em o n e yi nt h ec o m m o na n a l y t i c a l m e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fr e s i d u a l so fv e t e r i n a r ym e d i c i n ei nt h ea n i m a lf o o d a m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y ( m e k c ) m e t h o db a s e do no n - l i n e s w e e p i n g c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u ec o u l ds o l v et h et w op r o b l e m sa b o v e i nt h i st h e s i s ，t h e r ew e r ef o u r c h a p t e r s c h a p t e ro n e ：t h eh a r mo fr e s i d u a lv e t e r i n a r yd r u ga n dt h ec o m m o nd e t e c t i o nt e c h n o l o g y r e l a t e dt oi tw e r ei n t r o d u c e d c h a p t e rt w oa n dt h r e e ：a m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y ( m e k c ) m e t h o db a s e d o no i l l i n es w e e p i n gt e c h n i q u ew a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fr e s i d u e so ft r a c e q u i n o l o n e si nt h em u s c u l a rt i s s u ea n dv i s c e r a ( k i d n e ya n dl i v e r ) o fa n i m a l t h es a m p l e p r e t r e a t m e n tr e q u i r e do n l yt h ep r e c i p i t a t i o no fp r o t e i nc o n t e n t s ，a n da l l o w e du pt o6 0 0 - f o l d a c c u m u l a t i o nc o n c e n t r a t i o no fc i p r o f l o x a c i nu n d e rt h es e l e c t e dc o n d i t i o n s t h i sm e t h o dw a s s i m p l ea n ds e n s i t i v e ，a n dw a st h e r e f o r ea l la l t e r n a t i v et o o lt ot h ee x i s t i n gh p l cm e t h o df o r a n a l y z i n gt h er e s i d u a l so ft r a c em e d i c i n e si na n i m a lf o o d c h a p t e rf o u r ：am i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y ( m e k c ) m e t h o dw i t ho n - l i n e s w e e p i n gt e c h n i q u ew a se s t a b l i s h e df o rt h ef a s td e t e r m i n a t i o no fp a r a q u a ti ns e r u ma n dt h e m e t h o do fm e a s u r i n gt h ev i g o ro fs o dw a sa l s od e s c r i b e d t h ef a c t o r sw h i c hi n f l u e n c e dt h e c o n c e n t r a t i o no fp a r a q u a ta n dt h ev i g o ro fs u p e r o x i d ed i s m u t a s e ( s o d ) i ns e r u mw e r es t u d i e d i i a b s t r a c t t h er e s u l t sw e r et h a tt h ed e t e c t i o nl i m i tw a so 0 0 2 m g l ，a n dt h ea v e r a g er e c o v e r yw a s 9 9 0 s i n c et h eo p e r a t i o no ft h es w e e p i n g - m e k cw a ss i m p l ea n dq u i c k ，i tw a sa p p l i c a b l e f o r t h ed e t e r m i n a t i o no fp a r a q u a tc o n c e n t r a t i o nb e f o r ea n da f t e rh e m o p e r f u s i o n t h e h e m o p e r f u s i o nc o u l de f f e c t i v e l yr e m o v ep a r a q u a ti ns e r u m ，a n di n c r e a s et h ea c t i v i t yo fs o d t h ee f f e c to fh e m o p e r f u s i o nw a sd e c i d e db yt h er e c o v e r yo ft h ev i g o ro fs o d ，b u tt h el a t t e r , b e s i d e st h er e d u c t i o no ft h ec o n c e n t r a t i o no fp a r a q u a t ，w a sa l s od e t e r m i n e db yp a t i e n t s a g e ， t h e i rp h y s i c a lc o n d i t i o n sa n dv a r i o u so t h e rf a c t o r s k e yw o r d s m i c e l l a re l e c t r o k i n e t i cc h r o m a t o g r a p h y ( m e k c ) o n l i n es w e e p i n gc o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e r e s i d u e so f v e t e r i n a r ym e d i c i n e t r a c e 1 1 1 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名：至面约： 日期：趔2 年月 三 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年 月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密留。 ( 请在以上相应方格内打“) 作者签名：至亘丕翊 一 ：日期：趔年鱼月三 日 导师签名：凄乡兰旦址日期：碑年乒月上日 保护知识产权声明 ( 王丽应狗 ) ，是河北大学药学院的( 二op 七) 届( 诵土 ) 研究生。 本人为获得河北大学( 动增1 珀士) 学位证书所提交的题目为： ( 胨震纠丑篦啦绥概拇痦磋授东荔兽药缮留枸铆) 的磁锄懈学位论文，是我个人在导师( 邀跨簇， 教授) 指 导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在 河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完 全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法 律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本人以任何形式公开和传播科研成果和科研工作 时，包括发表的学术论文、学术交流、科技咨询和科技成果转让等行 为时，如果涉及到本论文所包含的研究内容和研究成果，本人将征得 指导教师( 走磷，蕊，教授) 和河北大学的书面同意和授权。如果 违反本声明，本人承担法律责任。 声明人：签名( 章) 互丽次角日期：如呷否2 第1 章绪论 i ii i 第1 章绪论 1 1 兽药残留及其危害 1 1 1 兽药残留的定义及其分类n 。3 3 兽药残留是“兽药在动物源食品中的残留 的简称，根据联合国粮农组织和世界卫 生组织( f a o w h o ) 食品中兽药残留联合立法委员会的定义，兽药残留n 3 是指动物产品的 任何可食部分所含兽药的母体化合物及( 或) 其代谢物，以及与兽药有关的杂质。所以， 兽药残留既包括原药，也包括药物在动物体内的代谢产物和兽药生产中所伴生的杂质。 目前，兽药残留可分为7 类：抗菌药类：驱肠虫药类：生长促进剂类：抗原 虫药类：灭锥虫药类：镇静剂类：1 3 一肾上腺素能受体阻断剂。其中在动物源食品中 较容易引起兽药残留量超标的兽药主要有抗菌药类，镇定剂类，激素类，兴奋剂类，驱 肠虫类药物残留等。 抗菌药类抗菌药类包括人工合成的抗菌药( 如喹诺酮类等) 和抗生素，动物大量、 频繁地使用抗生素，其体内抗生素残留可使动物机体中的耐药致病菌很容易感染人类； 同时可使人体中细菌对其产生耐药性，扰乱人体微生态而造成感染的难以控制，甚至危 及生命。目前，在畜产品中容易造成残留量超标的抗生素主要有氯霉素、四环素、土霉 素、金霉素等。 镇静剂药物丙酰丙嗪，氯丙嗪等作为镇静剂用于动物运输中以及宰杀前短期使 用。作为镇静药和止吐药，局部注射后组织中残留很高，存在较大的潜在危害。动物实 验发现即使小剂量时也会导致行为异变，我国已禁用于食品动物。 激素残留激素残留是指畜牧业生产中应用激素作为动物饲料添加剂，以促进动物 生长、增加体重和肥育为目的，或用于疾病防治和同期发情等，而导致在肉品中的残留。 主要有睾丸酮，黄体酮，已烯雌酚，已烷雌酚等。残留于肉中激素一旦通过食物链进入 人体，即会明显的影响机体的激素平衡。 兴奋剂残留主要有1 3 一兴奋剂，是一类与肾上腺素或去甲肾上腺素结构和功能类 似的苯乙醇胺类衍生物，其作用类似于生长激素。这类物质俗称“瘦肉精 ，医学上 称为克伦特罗。在体内代谢慢，存留时间长，在家畜肺及肝中残留最多。 驱肠虫类药物残留主要有左旋咪唑，苯硫哒唑，磺唑氨脂：苯硫氨脂等，这些药 l 河北大学理学硕士学位论文 曼曼曼! 曼曼曼曼笪曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼皇曼! 皇il l l i i i ； 一 一一i ii ! 曼曼曼曼! 皇! 曼曼曼曼曼曼曼曼曼! 曼基曼曼曼曼曼鼍! ! 曼曼曼曼 物在体内可互相转化，均能引起动物骨骼、脾和胸腺细胞、白细胞减少及贫血，均有胚 胎、肝脏毒性，小鼠口服高剂量苯硫哒唑可发生肝癌。 1 1 2 兽药残留产生的原因h 1 1 1 2 1 非法使用违禁或淘汰药物 我国农业部在2 0 0 3 年( 2 6 5 ) 号公告中明文规定，不得使用不符合兽药标签和说明 书管理办法规定的兽药产品，不得使用食品动物禁用的兽药及其他化合物清单所 列2 1 类药物及未经农业部批准的兽药，不得使用进口国明令禁用的兽药，畜禽产品中 不得检出禁用药物。但事实上，养殖户为了追求最大的经济效益，将禁用药物当作添加 剂使用的现象相当普遍，如饲料中添加盐酸克仑特罗( 瘦肉精) 引起的猪肉中毒事件等。 1 1 2 2 不遵守休药期规定 休药期的长短与药物在动物体内的消除率和残留量有关，而且与动物种类，用药剂 量和给药途径有关。国家对有些兽药特别是药物饲料添加剂都规定了休药期，但是大部 分养殖场( 户) 使用含药物添加剂的饲料时很少按规定施行休药期。 1 1 2 3 滥用药物 在养殖过程中，普遍存在长期使用药物添加剂，随意使用新或高效抗生素，大量使 用医用药物等现象。此外，还大量存在不符合用药剂量、给药途径、用药部位和用药动 物种类等用药规定以及重复使用几种商品名不同但成分相同药物的现象。所有这些因素 都能造成药物在体内过量积累，导致兽药残留。 1 1 2 4 违背有关标签的规定 兽药管理条例明确规定，标签必须写明兽药的主要成分及其含量等。可是有些 兽药企业为了逃避报批，在产品中添加一些化学物质，但不在标签中进行说明，从而造 成用户盲目用药。这些违规做法均可造成兽药残留超标。 1 1 2 5 屠宰前用药 屠宰前使用兽药用来掩饰有病畜禽临床症状，以逃避宰前检验，这也能造成肉食畜 产品中的兽药残留。此外，在休药期结束前屠宰动物同样能造成兽药残留量超标。 1 1 2 6 环境污染 如重金属、杀虫剂等污染。农药和工业“三废”大多是对人体有害的化学物质，如 有机氯、磷、汞、氟、铅、镉、砷、铜、铁、亚硝胺等，直接污染水源、饲料、饲草 2 第1 章绪论 曼鼍量! 曼! i 一一一一。= ； 一 = i 一 _ 一i 曼曼曼曼曼曼皇曼皇! 曼曼曼曼曼曼蔓曼曼! 岂寡! 皇! 曼皇! ! 曼曼 及动物的生活环境，通过食物链进入动物体内，并在动物体内大量积蓄。 1 1 3 兽药残留的危害性睛吨1 1 1 3 1 毒性反应 长期食用兽药残留超标的食品后，当体内蓄积的药物浓度达到一定量时会对人体产 生多种急慢性中毒。目前，国内外已有多起有关人食用盐酸克仑特罗超标的猪肺脏而发 生急性中毒事件的报道。此外，人体对氯霉素反应比动物更敏感，特别是婴幼儿的药物 代谢功能尚不完善，氯霉素的超标可引起致命的“灰婴综合征”反应，严重时还会造成 人的再生障碍性贫血。四环素类药物能够与骨骼中的钙结合，抑制骨骼和牙齿的发育。 红霉素等大环内酯类可致急性肝毒性。氨基糖苷类的庆大霉素和卡那霉素能损害前庭和 耳蜗神经，导致眩晕和听力减退。磺胺类药物能够破坏人体造血机能等。 1 1 3 2 耐药菌株的产生 动物机体长期反复接触某种抗菌药物后，其体内敏感菌株受到选择性的抑制，从而 使耐药菌株大量繁殖；此外，抗药性r 质粒在菌株间横向转移使很多细菌由单重耐药发 展到多重耐药。耐药性细菌的产生使得一些常用药物的疗效下降甚至失去疗效，如青霉 素、氯霉素、庆大霉素、磺胺类等药物在畜禽中已大量产生抗药性，临床效果越来越差。 1 1 3 3 “三致”作用 研究发现许多药物具有致癌、致畸、致突变作用。如丁苯咪唑、丙硫咪唑和苯硫苯 氨酯具有致畸作用；雌激素、克球酚、砷制剂、喹恶啉类、硝基呋喃类等已被证明具有 致癌作用；喹诺酮类药物的个别品种己在真核细胞内发现有致突变作用；磺胺二甲嘧啶 等磺胺类药物在连续给药中能够诱发啮齿动物甲状腺增生，并具有致肿瘤倾向；链霉素 具有潜在的致畸作用。这些药物的残留量超标无疑会对人类产生潜在的危害。 1 1 3 4 过敏反应 许多抗菌药物如青霉素、四环素类、磺胺类和氨基糖苷类等能使部分人群发生过敏 反应甚至休克，并在短时间内出现血压下降、皮疹、喉头水肿、呼吸困难等严重症状。 青霉素类药物具有很强的致敏作用，轻者表现为接触性皮炎和皮肤反应，重者表现为致 死的过敏性休克。四环素药物可引起过敏和荨麻疹。磺胺类则表现为皮炎、白细胞减少、 溶血性贫血和药热。喹诺酮类药物也可引起变态反应和光敏反应。 1 1 3 5 肠道菌群失调 河北大学理学硕士学位论文 近年来国外许多研究表明，有抗菌药物残留的动物源食品可对人类胃肠的正常菌群 产生不良的影响，使一些非致病菌被抑制或死亡，造成人体内菌群的平衡失调，从而导 致长期的腹泻或引起维生素的缺乏等反应。菌群失调还容易造成病原菌的交替感染，使 得具有选择性作用的抗生素及其他化学药物失去疗效。 1 1 3 6 对生态环境质量的影响 动物用药后，一些性质稳定的药物随粪便、尿被排泄到环境中后仍能稳定存在，从 而造成环境中的药物残留。高铜、高锌等添加剂的应用，有机砷的大量使用，可造成土 壤、水源的污染。杨居荣等研究发现，砷对土壤固氮细菌、解磷细菌、纤维分解菌、真 菌和放线菌均有抑制作用。w o l l e n b e r g e rl 等发现喹乙醇对甲壳细水蚤的急性毒性最强， 对水环境有潜在的不良作用。s 仃o n gl 等报道了阿维菌素、伊维菌素和美倍霉素在动物 粪便中能保持8 周左右的活性，对草原中的多种昆虫都有强大的抑制或杀灭作用。另外， 已烯雌酚、氯羟吡啶在环境中降解很慢，能在食物链中高度富集而造成残留超标。 1 1 3 7 严重影响畜牧业发展 长期滥用药物严重制约着畜牧业的健康持续发展。如长期使用抗生素易造成畜禽机 体免疫力下降，影响疫苗的接种效果；还可引起畜禽内源性感染和二重感染；使得以往 较少发生的细菌病( 大肠埃希菌、葡萄球菌、沙门氏菌) 转变成为家禽的主要传染病。 此外，耐药菌株的增加，使有效控制细菌疫病变得越来越困难。如根据对广州肉品市场 的2 0 0 例食用猪肝进行病理学分析，6 8 的猪肝存在着各种各样的病变，病变种类多达 2 5 种，不仅有肝细胞的萎缩和各种变性、水肿、囊肿、出血、坏死和钙化等，还发现恶 性肿瘤以及见于癌前期或癌症的肝细胞病理性核有丝分裂现象。 1 2 样品前处理 兽药在动物体内的残留通常是通过检测药物在组织，脏器，血液，尿液等的含量而 进行评定，根据具体的生物样品采取的样品前处理方式有所不同。生物样品前处理的目 的是提高分析的准确度和精密度实现样品的富集排除干扰，提高选择性。样品前 处理一般分为提取、净化、浓缩和衍生化4 个部分： 提取首先使样品均匀化，对于血液样品可使用涡流混合器混匀，而对于粪便，肌 肉，组织等固体样品业的进行匀浆处理。常采用的提取方法有溶剂提取法，对于复杂样 品也可采用柱色谱提取法而达到分离。而对于血清，血浆含有大量的蛋白质，尤其对于 4 第1 章绪论 曼曼曼皇曼皇! 皇曼! ! 曼! 皇曼曼曼曼曼曼! 曼! 鼍m i i i | 1 ： ： 一 一_ = ；曼 药物蛋白结合率高的药物，生物样品去蛋白是必要的。去蛋白处理过程通常是将蛋白变 性处理后，把与蛋白结合的药物解离出来，离心分离除去蛋白。 净化、浓缩净化即将待测物与提取液中的样品干扰杂质分离，浓缩即使预测样品 富集，达到提高灵敏度的要求。对于不同的检测方法在此环节采取的方法和要求有所不 同，浓缩可分为离线富集和在线富集两大环节。 衍生化衍生化的目的是为了便于检测到被测物而设计的样品分析前处理方法，对 于不同的检测方法衍生化手段不同。 动物性样品的分离纯化是兽药残留分析技术中的重点和难点，其难点在于样品基质 复杂，干扰物质多，而且残留物浓度很低，因而不易从样品中分离、纯化。因此样品 前处理是兽药残留分析技术的关键。 1 3 常用兽药残留检测方法糟1 目前用于兽药残留的检测方法主要有免疫分析法、毛细管电泳法、高效液相色谱法、 液相色谱一质谱联用法等。 1 3 1 高效液相色谱法( 瑚) l c ) 几乎所有的化合物包括高极性离子型待测物和大分子物质均可用h p l c 进行测 定，目前大多数兽药残留分析都采用反相高效液相色谱法。h p l c 是在目前兽药残留检 测中应用比较成熟的技术。其优点是精密度和灵敏度比较高，不足的地方是试剂用量大， 既浪费又造成污染；样品预处理操作繁琐；且长时间使用可造成柱效下降。除了传统的 组织匀浆法、振荡法、索氏提取法或液一液萃取法等，现常采用的样品前处理方法有： 固相萃取( s p e ) ，基质固相分散技术( m s p d ) ，超临界流体萃取( s f e ) ，免疫亲和色 谱( i a c ) 等。 1 3 1 1 固相萃取 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化 合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱达到分离和富集目标 化合物的目的n 。固相萃取实质上是一种液相色谱分离，其主要分离模式可分为正相( 吸 附剂极性大于洗脱液极性) ，反相( 吸附剂极性小于洗脱液极性) ，离子交换和吸附。 固相萃取所用的吸附剂也和h p l c 常用的固定相相同，大多为高聚物，分离效率高，处 理样品的比容量大，只是在粒度上有所区别，固相萃取柱上所加压一般都不大，分离目 5 河北大学理学硕七学位论文 曼i i 一 一i 一一一i i i ! 量! 曼! ! 曼曼曼曼! 曼曼皇! 曼兰! 曼 的只是把目标化合物与干扰化合物和基体分开即可，柱效要求一般不高，仅为l o 5 0 塔板m 2 ，故作为固相萃取吸附剂的填料都较粗，一般在4 0 i - t m 即可用，粒径分布要 求也不严格。 s p e 既可用于复杂样品中微量或痕量目标化合物的提取、又可用于净化、浓缩或富 集，是目前兽药残留分析样品前处理中的主流技术。如磺胺类药物是畜牧业中常用的 广谱抗菌素，刘海新n 2 3 以h p l c 检测罗非鱼肌肉中磺胺二甲基嘧啶，其样品前处理采用 o d s c 1 8 ( 2 0 0m g ) 柱固相萃取，该方法的精密度和准确度都比较好。 1 3 1 2 基质固相分散技术， 基质固相分散( m a t r i xs o l i d p h a s ed i s p e r s i o n ，m s p d ) 是b a r k e r 等n 3 3 在1 9 8 9 年提 出并给予理论解释的一种快速样品处理技术。其基本操作是将样品( 固态或液态) 直接 与适量反相键合硅胶一起混合研磨，使样品均匀分散于固定相颗粒的表面，制成半固态 装柱，然后采用类似于s p e 的操作进行洗脱。所用的填充料一般为c 1 8 或c 8 ，样品和填 充料的比例通常为1 ：4 。m s p d 是一种在s p e 的基础上改进后的样品处理方法，较s p e ， 它的优点在于：它依靠机械剪切力、c 1 8 键合相的去垢效应和巨大的表面积使样品结构破 碎并且在填料表面均匀分散，浓缩了传统的样品前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂 解、提取、净化等过程，避免了样品匀化、转溶、乳化、浓缩造成的待测物损失，而且 固定相处理样品的比容量大，提取净化的效率较高。 m s p d 处理样品耗时短、节省溶剂、样品用量少，引起兽药残留分析界的广泛关注， 如s c h e n c k 采用m s p d 和碱性氧化铝s p e 柱净化牛肝组织中的伊维菌素，将2g c l 8 填 料( 4 0 6 0 目) 与0 5g 组织混合，研磨成均质的半固态，装柱，正己烷洗涤，二氯甲 烷一乙酸乙酯洗脱，流出液经氧化铝柱，浓缩后进行荧光衍生化h p l c f l d 测定。 1 3 1 3 超临界流体萃取 超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) 技术是以超临界状态下的流 体为溶剂，利用该状态下的流体所具有的高渗透能力和高溶解能力分离混合物的过程。 超临界流体是温度与压力均在其临界点之上的流体，性质介于气体和液体之间，有与液 体相接近的密度，与气体相接近的粘度及高的扩散系数，故具有很高的溶解能力及良好 的流动、传递、渗透性能，可代替传统的有毒、易燃、易挥发的有机溶剂。最常用的超 临界流c o 。，由于具有临界条件温度( t c = 3 1 3 c p c = 7 4 8 x1 0 6p a ) 、对大部分物质 呈化学惰性、无溶解污染等优点，特别适用于热敏性、易挥发、易氧化成分的分离萃取。 6 第1 章绪论 ii ii i ii_i_iiii 用c 0 2 作流体，可萃取非极性和中等极性的物质，对极性较强的组分，则需要在c 0 2 中加入适量的极性溶剂充当改良剂以提高流体的极性，或采用极性的超临界流体，如 n 0 2 、n h 3 等。 s f e 与其它技术如溶剂萃取、蒸馏、常规柱色谱等相比，显示了许多特点，如速度 快、效率高、选择性强，几乎不消耗溶剂等优点，十多年来，在环境监测、医药卫生、 食品检验等领域得到广泛应用。其缺点是实验条件的选择和优化比较困难，萃取体系的 可选择性差，仪器价格昂贵。在兽药残留分析的样品前处理方面，s f e 有其独到之处。 p e n s a b e n e 等用s f e 对鸡蛋样品中的氯霉素残留进行提取与净化，采用h p l c u v d 检测。 1 3 1 4 免疫亲和色谱 免疫亲和色谱( i m m u n o a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，i a c ) 是以抗原抗体的特异性、可 逆性免疫结合反应为原理的色谱技术n 1 8 3 ，其基本过程为将抗体与惰性基质( 如珠状琼 脂糖、键合相硅胶) 偶联制成固定相，装柱。当含有待测组分的样品通过i a c 柱时，固 定抗体选择性地结合待测物，其它不被识别的样本杂质则不受阻碍地流出i a c 柱，经洗 涤除去杂质后将抗原一抗体复合物解离，待测物被洗脱，样品得到净化。i a c 的最显著 优点在于对待测物的高效、高选择性保留能力，特别适用于复杂样品极稀组分的净化与富 集。 氯霉素危害人体的造血系统，容易引起再生障碍性贫血，是禁用的抗生素，因此方 法的检测限很受研究者关注，v a n d e w a t e rn 鲫等报道了猪肌肉、蛋和牛奶中氯霉素的i a c 净化法，样品经提取、离心、过滤和稀释后用i a c 柱净化，h p l c 舢v d 测定。 1 3 1 5 分子印迹技术 分子印迹的原理啪1 是首先使拟被印迹的分子与聚合物单体键合，键合方式有共价结 合或非共价结合两种。然后将聚合物单体交联，再将印迹分子从聚合物中提取出来，聚 合物内部就留下了被印迹分子的印迹。分子印迹技术可以用于药物、激素、蛋白质、兽 药、氨基酸、多肽、碳水化合物、辅酶、核酸碱基、甾醇、染料、金属离子等各种化合 物分离工作。除分离作用外，此项技术还可用于制备人工抗体和受体，生物传感器类似 物等。分子印迹技术在残留分析领域的研究刚刚起步，是一个新的发展方向。彭涛( 2 0 0 2 ) 首次利用该技术检测了玉米赤霉醇残留。 1 3 2 免疫法胁屯幻 7 河北大学理学硕士学何论文 免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的新型分析技术。抗原 与抗体的初级结合反应遵守质量作用定律，可用著名的s c a t c h a r d 方程来描述。所以， 免疫分析是使用生物材料作为试剂的理化分析技术，其中抗原是核心试剂。兽药残留免 疫分析方法的建立步骤包括待测物选择、半抗原及人工抗原的合成、抗体制备和测定方 法建立。其质量控制原则应与常规理化分析技术一致。免疫反应具有极高的选择性和灵 敏性，因此，免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手段还是样品净化方法都能使 分析过程特别是前处理步骤大大简化。作为相对独立的检测方法，即基于竞争结合分析 原理的免疫测定法( 认) ，如酶联免疫吸附测定( e l i s a ) 、放射免疫测定法( 刚a ) 、荧 光免疫测定法( f i a ) 、固相免疫传感器等。以使用最普遍的e l i s a 为例，i a 具有操作 简便、灵敏度高、样品容量大、仪器化程度和分析成本低的优点，是目前最理想的残留 筛选性分析方法之一。 但是从也有很大的局限性，如有些测定方法在用了一段时间后发现的意想不至i j 的 假阳性或交叉反应性；组织样品处理不够快，不能灭活降解酶等：因药物或肌体本身原 因而造成的组织和血液等检测效果的不一致性，可造成虚假数据。所以，队适用于用 药历史己知的大批量样本中某些兽药残留的快速筛选性检测和常规分析技术测定困难 的兽药的分析。丛不可能取代目前使用的常规分析技术，只能作为其重要补充。将免 疫分析技术与常规理化分析技术联用，可避免单独i a 信息量太少等缺欠，并且弥补了 理化分析方法选择性差等不足，使整个分析方法简化或进一步提高检测效率，显示了免 疫分析与理化分析在分析机制方面的互补性，其中最引人注目的是免疫分析技术与 i q p l c 的联用，不足之处是延长了分析周期。 1 3 3 液相色谱一质谱联用法乜朝 药物残留研究中，常用的色谱法具有高效的分离能力和高灵敏度的定量检测能力， 但仅显示色谱峰和保留值，不能提供待测物残留组分的结构信息或对未知化合物进行结 构鉴定。质谱等具有很强的结构鉴定能力，但只适用于纯物质的分析，自身不具备分离 能力，两者结合特别是联用仪器可以集高效分离和结构鉴定于一体，是生物样品复杂混 合物中痕量组分定性和定量分析的最有效手段之一。 国内外将液谱质谱( l c m s ) 联用技术用于兽药残留尤其是多残留分析才刚刚开 始，目前大部分报道主要集中在兽药残留的液谱单个质谱联用技术的研究上，l c m s r 第1 章绪论 主要有四种接口技术：热喷雾( t s p ) 、粒子束( p b ) 、电喷雾电离( e s i ) 、大气压化学电离 ( a p c i ) 。高效液相色谱( h p l c ) 及大气压电离质谱( a p i m s ) 主要用来分析低浓度( p g l ) 、 难挥发、热不稳定和强极性兽药。液谱串联质谱( l c m s m s ) 联用技术在兽药残留分 析中尚极少应用。 此外，色谱质谱联用检测技术对待测残留物纯度的要求极为严格，一般的样品前 处理技术很难达到满意程度。 1 3 4 毛细管电泳法 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e t r o p h o r e s i s ，c e ) 统指以高压电场为驱动力，以毛细管为 分离通道，依据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类分离 技术。毛细管电泳现已发展出多种不同分离模式，并具有不同的分类方法瞳6 。按其分离 机制毛细管电泳可分为：毛细管区带电泳，胶束毛细管电泳，毛细管等点聚焦，毛细管 凝胶电泳，毛细管等速电泳和毛细管电色谱等。毛细管电泳技术与发展相对成熟的高效 液相技术相比具有快速、高效、痕量、低消耗、低污染等优点，但其精密度较差，检测 限较高。近些年来为了弥补其不足发展了许多方法，如采用检测能力更高的检测器；增 大光程；研制集成毛细管电泳芯片；样品浓缩技术等。 最初通过改造仪器提高其灵敏度，采用特殊设计的检测池如使用泡状检测池，z 型 和多重反射毛细管扩展检测光程，可以将通用型紫外检测的灵敏度提高1 0 倍至几十倍瞳。1 ， 但进一步发展的潜力较小。高灵敏度的检测器，如激光诱导荧光和电化学检测可以将检 测灵敏度提高几个数量级降2 9 l 。但是前者仪器昂贵，后者则要求样品具有电化学活性。 也可采用离线富集技术，如经典的液一液萃取，近年来发展较快的固相萃取技术、超临 界流体萃取和免疫亲和色谱等。但由于其操作繁琐，且在富集过程中容易丢失样品或引 入杂质，以及富集倍数有限等因素限制了其在c e 中的应用。近些年发展了许多在线( 或 在柱) 样品浓缩的方法，可以提高检测灵敏度，降低样品的浓度检测限，拓展c e 在包括 痕量分析等众多领域的应用。 在毛细管区带电泳( c z e ) 中应用比较多的在线富集技术有等速电泳、样品堆积技 术等，在胶束毛细管电泳中有在线推扫富集法。 等速电泳( i s o t a c h o p h o r e s i s ，i t p ) 又称“移动边界 电泳技术，是基于离子淌度差 异的一种电泳富集模式呦一。样品注入到前导( 即较高电泳迁移速率) 和尾随( 较低电泳 9 河北大学理学硕士学位论文 迁移速率) 电解质之间。施加高压后，随着样品中各组分的分离，每个样品组分区带的 电场在发生变化。电泳迁移速率大的离子，电导较大，区带的电场较小，其迁移速率就 会逐渐降低。到平衡时，样品各组分的电泳迁移速率均与前导电解质的相同，建立一种 稳态迁移模式。由于i t p 是种富集技术，其分离效果并不理想，因此常与c z e 配合使 用。如m a r g a r i t a 2 3 利用i t p c z e 分离检测猪血清中恩诺沙星，环丙沙星和氟甲喹。 样品堆积口3 喵3 ( s a m p l es t a c k i n g ) 是基于因电场强度不同所引起的分析物电泳速度的 骤变而实现的。具体讲是将样品溶解于低导溶液中，并使样品溶液在高导背景溶液中运 行。当低导和高导溶液同时存在于毛细管中并施以电压时，则低导区的电场较高导区的 强，样品离子在低导区的迁移速度比在高导区快。当样品离子穿越低导区域和背景缓冲 溶液的边界时，样品离子的迁移速度骤降从而导致了样品区带长度的缩短，样品的浓度 相应地提高，从而达到了富集的目的。样品堆积为c z e 提供了更广泛的应用领域。有常 规堆积( n o r m a ls t a c k i n gm o d e ，n s m ) 、大体积样品堆积( 1 a r g ev o l u m es a m p l es t a c k i n g ， l v s s ) 和场放大进样( f i e l da m p l i f i e ds a m p l es t a c k i n g ，f a s s ) 等模式。 胶束毛细管电动色谱法( m e k c ) 是把一些离子型表面活性剂( 如十二烷基磺酸 钠，简称s d s ) 加到缓冲液中，形成有一疏水内核的胶束，待测离子依据疏水性的不同 在水相和胶束之间进行多次分配，其中疏水性强的中性粒子与胶束结合比较牢固，洗脱 时间长，就会与水溶性较好的中性粒子分离。在m e k c 中，中性粒子的分离机理只是 它与胶束间的相互作用，而对于带电离子则同时有电泳迁移、静电作用、两相分配等多 种分离机理。 推扫富集法( s w e e p i n g ) 汹一力首先由q u i r i n o 和t e r a b e 提出，它是一种在线富集非极 性分子的方法。在电渗流为零、负电荷的胶束缓冲溶液中施加反向电压时，此时胶束的 电泳速率大于电渗速率，胶束从阴极端进入样品区带，当胶束穿过样品区带时，样品在 胶束相中分配、富集，并被胶束携带着向前运动；随着分离的进行，样品区带不断地缩 短，样品浓度大大地提高；富集完成后，富集的样品按胶束电动色谱进行分离。它的富 集是基于分配的原理，富集效果取决于分析物在假固定相( 胶束) 分配能力的大小或者是 分析物与假固定相间相互作用的大小。分析物与假固定相的亲和力越强，富集效果越好。 通常的富集因子在8 卜5 0 0 0 之间。 1 3 4 1 毛细管电泳在药物分析中的应用 1 0 第1 苹绪论 毛细管电泳在分析化学、生物化学、分子生物学、药物化学、食品科学、环境科学、 医学和法医学等诸多领域，有着广阔的应用前景。 1 用于药物含量测定 毛细管电泳具有快速，准确，试样处理简单，试剂用量少等优点，广泛用于药物含 量测定汹1 。如高效毛细管电泳技术测定盐酸环丙沙星片剂的含量，利用毛细管区带电泳 快速测定氧氟沙星针剂与片剂中含量啪1 等 2 用于手性药物的拆分n 1 目前，国际上临床用的1 2 0 0 多种化学药物中，有4 8 0 种含手性因素，其中只有约 2 0 是单一对映体形式，其余8 0 是以外消旋体在临床应用。一般起治疗作用的是单一 对映体，某些对映体可能降低药效甚至引起严重毒性。随着生物工程和生命科学的发展， 手性对映体的分离也引起普遍重视，成为一个相当活跃的领域。c e 由于其高效、快速、 微量等