（分析化学专业论文）几种有机小分子与血清白蛋白相互作用的研究.pdf

西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 小分子与生物大分子相互作用是研究所有生命过程经常涉及的基本问题，该领 域己成为从事生命科学、化学和临床医学科研工作者共同关注的课题。本论文基于开 展小分子与蛋白质相互作用的重要意义，在前人工作的基础上，综合利用荧光光谱、 紫外一可见吸收光谱和傅立叶变换红外光谱研究了有机小分子与血清白蛋白的相互作 用的机理。 第一章：简要介绍了血清白蛋白的结构、功能和性质；综述了多种物质与蛋白质 相互作用的研究方法、研究现状。 第二章：在模拟生理条件下，利用荧光光谱和紫外一可见吸收光谱研究了对硝基 苯酚与牛血清白蛋白的相互作用。研究结果表明，对硝基苯酚通过静态过程淬灭牛血 清白蛋白的内源荧光，且在t r y 2 “部位与牛血清白蛋白相互作用。由同步荧光光谱可 知对硝基苯酚对牛血清白蛋白的构象产生的影响。通过计算热力学参数，分析了两者 的相互作用类型。根据非辐射能量转移机理，求算了给体与受体间的距离和能量转移 效率。 第三章：在模拟生理条件下，利用荧光光谱、紫外一可见吸收光谱和傅立叶变换 红外光谱研究了对甲氧基苯已酮与人血清白蛋白的相互作用。计算了不同温度下对甲 氧基苯己酮与人血清白蛋白相互作用的淬灭常数，并根据动力学参数确定了对甲氧基 苯己酮与人血清白蛋白反应体系的活化能。通过同步荧光光谱与傅立叶变换红外光谱 定量分析了对甲氧基苯己酮对人血清白蛋白二级结构的影响。 第四章：利用多种光谱方法研究了生物活性组分栀子苷与人血清白蛋白的相互 作用。计算了不同温度下药物对人血清白蛋白内源荧光的淬灭常数，根据热力学参数 确定了药物一人血清白蛋白之间的作用力，并通过同步荧光和傅立叶变换红外光谱分 析了栀子苷对人血清白蛋白二级结构的影响。研究结果表明，栀子苷与h s a 的相互结 合作用为单一的静态猝灭过程，通过热力学参数分析，栀子苷与人血清白蛋白之间主 要以疏水作用为主，栀子苷能使入血清白蛋白的a 一螺旋向b 一折叠转变。 第五章：在模拟生理条件下应用傅立叶变换红外光谱、荧光光谱和紫外一可见吸 收光谱方法研究了人血清白蛋白与卜( 2 一吡啶偶氮) - 2 一萘酚的相互作用。通过 s t e r n v o l m e r 方程求算出在不同温度下( 2 8 5 ，2 9 3 ，3 0 1 ，3 1 0 k ) 的淬灭常数分别为1 4 6 ， 1 1 5 ，0 9 4 和0 7 6 1 0 5l m o l l ，证实了人血清白蛋白与卜( 2 一毗啶偶氮) 一2 - 萘酚相 互结合作用为单一的静态猝灭过程，并且得到p a n 与h s a 相互作用的热力学参数h o 和 s 。分别为- 1 9 9 5k j m o l a n d2 8 9 3j m o l l k - 1 。根据非辐射能量转移理论，计算出p a n 与h s a 相互结合时其供体一受体间的结合距离( r = 3 1 0 n m ) 和能量转移效率( e = o 2 5 ) 。与 西南科技大学硕士研究生学位论文第页 1 一( 2 一吡啶偶氮) 一2 - 萘酚作用后人血清白蛋白的同步荧光光谱的发射峰蓝移的现象 说明h s a 的疏水环境增加。结合同步荧光光谱与傅立叶变换红外光谱的结果说明了二 者问的作用力主要为疏水作用，并且h s a 的二级结构发生了由n 一螺旋向b 一转角和6 一 折叠的转化。 关键词：血清白蛋白荧光光谱紫外一可见吸收光谱傅立叶变换红外光谱同步 荧光光谱 西南科技大学硕士研究生学位论文第页 a b s t r a c t t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sa n db i o m a c r o m o l e e u l e si so n eo ft h e e s s e n t i a lm a i l e r si nl i f es c i e n c e t h e r e f o r e , i th a sb e e na ni n t e r e s t i n gr e s e a r c hf i e l do ff i f e s c i e n c e s , c h e m i s t r ya n dc l i n i c a lm e d i c i n e i nt h i sp a p e r , o nt h eb a s i so ft h ep r e v i o u s r e s e a r c h ，t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , u v - v i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p ya n df o u r i e r t r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r n s e o p y ( f r - m ) w e r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o no fs e v e r a l o r g a n i cs m a l lm o l e c u l es u b s t a n c e sw i t hs e ma l b u m i n c h a p t e r1 ：t h es t r u c t u r e s , f u n c t i o n sa n d n a t u r e so f p r o t e i n sw c r es u m m a r i z e db r i e f l y t h e c o n t e n t s a n d m e t h o d s o f i n t e r a c t i o n o f d i f f e r e n t k i n d o f s m a l l l i g a n d s w i t l i p r o t e i n w e r e r e v i e w e d c h a p t e r2 ：t h ei n t e r a c t i o no f p - n i t r o p h e n o lw i t hb o v i n es e r u ma l b u m i nw a ss t u d i e d b yt h em e t h o d so f f l u o r e s c e n c ea n ：u v - v i s i b l es p e c t r o s c o p yu n d e rs i m u l a t i v ep h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s t h er e s u l t so fs p e c t r o s c o p i cm e a s u r e m e n t ss u g g e s t e dt h a tp a nc o u l dq u e n c h t h ei n t r i n s i cf l u o r e s c e n c eo fh s a b ys t a t i cq u e n c h i n g t h ed i s p l a c e m e n ts t u d ys u g g e s t e d t h a tp n pc o u l db i n dt ot h ev i c i n i t yo f1 b po fb s a 1 1 l ep r e d o m i n a n ti n t e r m o l e c u l a rf o r c e w a ss t u d i e db yt h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r so fp n p - b s a a c c o r d i n gt of l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f 1 也1 ) ，t h ed i s t a n c era n de n e r g yt r a n s f e re f f i c i e n c y ( e ) b e t w e e n d o n o r ( b s a ) a n da c c e p t o r ( p 呻w e r e c a l c u l a t e d c h a p t e r3 ：t h ei n t e r a c t i o no fp m e t h o x y a c e t o p h e n o n e ( m a r ) w i t hh u m a ns e r n n l a l b u m i n ( h s a ) w a si n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , u v - v i s i b l ea b s o r b a n c e s p e c t r o s c o p ya n df o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e d ( r r - m ) s p e c t r o s c o p yu n d e rs i m u l a t i v e p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s 皿eq u e n c h i n gc o n s t a n t so fm a pt oh s aa t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s w e r ec a l c u l a t e d , w h i c h s u g g e s t e dm a pc o u l dq u e n c ht h e i n t r i n s i c f l u o r e s c e n c eo fh s ab yd y n a m i cq u e n c h i n g t h ea c t i v a t i o ne n e r g yo ft h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nm a pa n dh s aw a sc a l c u l a t e d s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yh a s s u g g e s t e dt h a t t h ea s s o c i a t i o nb e t w e e ng a r d e n o s i d ea n dh s ac h a n g e dt h em o l e c u l a r c o n f o r m a t i o no fh s a f t - i rs p e c t r o s c o p ys h o w e dt h a tt h ei n t e r a c t i o no fm a pw i t hh s a h a sc a u s e dt h es e c o n d a r ys t r u c t u r ec h a n g e df r o ma - h e l i xa n d8 - t u mt ob - s h e e t c h a p t e t4 t h ei n t e r a c t i o no fg a r d e n o s i d ew i t hh u m a n $ e n l ma l b u m i n ( h s a 、w a g i n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ；u v - v i s i b l ea b s o r b a n c es p e c t r o s c o p ya n d f o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ( r t - m ) u n d e rs i m u l a t i v ep h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s t h eq u e n c h i n gc o n s t a n t sa n dt h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r so fg a r d e n o s i d et oh s aa t 西南科技大学硕士研究生学位论文第页 d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s w e r e c a l c u l a t e d s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y h a s s u g g e s t e dt h a th y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n to fh s a w a si n c r e a s e db yt h ea s s o c i a t i o nb e t w e e n g a r d e n o s i d ew i t hh s a t h e s er e s u l t sa n df t - i rs t u d ys u g g e s t e dt h a th y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nw a st h ep r e d o m i n a n ti n t e r m o l e e u l a rf o r c ea n dc a u s e dt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo f h s a c h a n g e df r o ma - h e l i xt ob - s h e e t c h a p t e r5 ：t h ei n t e r a c t i o no f1 - ( 2 - p y r i d y l a z o ) - 2 - n a p h t h o lo a n ) w i t hh u m a n r u m a l b u m i n ( h s a ) w a si n v e s t i g a t e db yf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , u v - v i s m l ea b s o r b a n c e s p e c t r o s c o p ya n df o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p yi f r - m ) u n d e rs i m u l a t i v e p h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s t h eq u e n c h i n gc o n s t a n t so fp a nt oh s aa tf o u rd i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s ( 2 8 5 ，2 9 3 , 3 0 1 , 3 1 0 1 0w e r c1 4 6 , 1 1 5 ，0 9 4a n do 7 6 x l 矿l m o l 1 ，w h i c h s u g g e s t e dp a n c o u l dq u e n c ht h ei n t r i n s i cf l u o r e s c e n c eo fh s a b ys t a t i cq u e n c h i n g t h e t h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r ss t a n d a r de n t h a l p yc h a n g e ( “u ) a n ds t a n d a r de n t r o p yc h a n g e ( s 0 ) o ft h ei n t e r a c t i o nb e t w e e np a na n dh s a w e r cc a l c u l a t e dt ob e - 1 9 9 5k j m o l - 1a n d 2 8 9 3j m o l 。1 k1 a c c o r d i n gt of l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) t h ed i s t a n c e ra n de n e r g yt r a n s f e re f f i c i e n c y b e t w e e nd o n o r ( h s a ) a n da c c e p t o r0 a n ) w e r e c a l c u l a t e dt ob e3 1 0 n ma n d0 2 5 ，r e s p e c t i v e l y w a v e l e n g t hs h i f t s i n s y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yh a ss u g g e s t e dt h a th y d r o p h o b i ce n v i r o n m e n to fh s aw a s i n c r e a s e db yt h ea s s o c i a t i o nb e t w e e np a nw i t hh s a t h e s er e s u l t sa n df t - i rs t u d y s u g g e s t e dt h a th y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nw a st h ep r e d o m i n a n ti n t e r m o l e c u l a rf o r c ea n d c a u s e dt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fh s a c h a n g e df r o ma - h e l i xt ob - s b e c ta n db - t u r n k e y w o r d $ ：s e r u ma l b u m i n ；f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y ；f o u d e rt r a n s f o r mi n f r a r e d s p e c t r o s c o p y ；1 1 v - v i s i b l e a b s o r b a n c e s p e c t r o s c o p y ； s y n c h r o n o u s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示了谢意。 签名：眄易 、j 日期：沙7 乒7 | | 关于论文使用和授权的说明 本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留学位论文的复印件，允许该论文被查阅和借阅；学校可 以公布该论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手 段保存论文。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此规定) 一习磊 名： 日期： 渺7 ，67 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 页 1 绪论 1 1 研究意义 生命的奥秘一直是人类孜孜探索的重大问题，从分子水平测定、 表征和阐明在生命过程中起作用的各类小分子与生物大分子的相互 作用，以及探究这些作用与生物功能之间的关系，其根本目的是探索 生命过程的奥秘。蛋白质是最基本的生命物质之一，是细胞组分中含 量最丰富、功能最多的生物大分子。探索蛋白质的构象、组成、结构， 研究药物、染料、表面活性剂、离子、量子点等小分子与蛋白质的相 互作用机理和作用过程，了解在体外小分子与对蛋白质结构与功能等 方面的影响，不仅对研究蛋白质和小分子相互作用的配位本质，以及 促进生命科学的发展有着重要的意义，而且对改进和发展检测蛋白质 的方法有着促进作用。因此，该领域己成为从事生命科学、化学、药 代动力学和临床医学科研者共同关注的课题。 1 2 研究对象 1 2 1 血清白蛋白 血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白成分，占血浆总蛋白的6 0 ， 主要由肝细胞合成，分泌进入血液循环系统，。血清白蛋白能与广泛 的内源( e n d o g e n o u s ) 物质( 如代谢产物等) 和外源( e x o g e n o u s ) 物质( 如药物等) 进行可逆性的非共价结合( n o n - c o r a l e n tb i n d i n g ) ， 从而发挥其贮存、转运以及机体保护等重要的生理功能。而且，相对 于其它生物大分子而言，血清白蛋白( s e r u ma 1 b u m i n ，s a ) 来源广 泛，尤其是人血清白蛋白( h u m a ns e r u ma 1 b u m i n ，h s a ) 和牛血清白 蛋白( b o y i l i es e r u ma l b u m i n ，b s a ) ，分子结构信息清楚，从而在相 关科学研究中作为模型生物大分子而得以广泛采用。 1 2 1 1 血清白蛋白分子的一、二级结构 ( 1 ) 蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构是指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，包括 二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质作 西南科技大学硕士研究生学位论文第2 页 用的特异性、空问结构的差异性及生物功能的多样性的基础。 h s a 是由5 8 5 个氨基酸残基组成的单链蛋白质，分子量约为 6 6 0 0 0 d a 。氨基酸到羧基端的宽度约为8 2 a ，整个分子的深度约为3 0 a 。 h s a 含有3 5 个半胱氨酸残基，仅3 4 位上有一个巯基，其余都为二硫 键。二硫键中有8 对交叉二硫键，只有接近n 端的是单个二硫键，二 硫键对维持血清白蛋白空间结构的稳定性起着重要作用。h s a 含有1 8 个酪氨酸( t y r ) ，在2 1 4 位上含有一个色氨酸残基( t r y ) ，n 端为天 门冬氨酸残基( a s p ) ，c 端为亮氨酸残基( l e u ) n ”。 b s a 是由5 8 2 个氨基酸残基组成的单链蛋白质，分子量约为 6 7 0 0 0 d a 2 氨基酸序列与h s a 非常相似，与h s a 不同的是，b s a 在13 5 位及2 1 4 位上各有一个t r p 残基。表1 1 列出了h s a 和b s a 一级结 构的氨基酸残基组成1 4 - $ 1 。 表1 - 1h s a 和b s a 一级结构组成 t a bi e1 1t h edrii l i a r ys t r u c t u r oo fh s a n db s a ( 2 ) 蛋白质的二级结构 蛋白质二级结构是指多肽链骨架中靠氢键维持的局部有规则的 构象，如。一螺旋、昼一折叠、b 一转角，还包括无规则卷曲。 h s a 的三维晶体结构己探明，有三个类似的结构域：i ( 残基 卜1 9 5 ) 、i i ( 残基1 9 6 - 3 8 3 ) 、i i i ( 残基3 8 4 - 5 8 5 ) ，每个结构域含有 两个亚结构域：a 和b ( 图卜1 ) ，以槽口相对的方式形成圆筒状结构， 几乎所有疏水性氨基酸都包埋在圆筒空腔内部，构成疏水腔。 西南科技大学硕士研究生学位论文第3 页 图1 - 1人血清白蛋白的x 一衍射晶体结构 f ig 1 1t h ex - cr y s t a il o g r a p h i cs tr u c t u r eo fh u m a ns e r u ma i b u m in ) 1 2 1 2人血清白蛋白的理化性质 人血清白蛋白在在p h = 7 4 的条件下，具有1 8 个净负电荷，离子 强度为0 1 5 时，其等电点p i 为4 7 。人血清白蛋白可溶于水和半 饱和硫酸铵溶液中，硫酸铵饱和度为6 0 以上时，可析出沉淀。对 酸较稳定，受热后可聚合变性，但还是比其它蛋白质耐热，蛋白质浓 度大时热稳定性小。在人血清白蛋白溶液中加入氯化钠或脂肪酸盐可 提高人血清白蛋白的热稳定性”w 。 1 2 1 3血清白蛋白的生理功能 白蛋白是血液缓冲系统的组分之一，具有营养作用，其主要生理 功能体现为运输功能和维持血液内环境相对稳定。如维持血液渗透 压，携带血液中多种配合运输内源性及外源性物质的重要载体一等。 ( 1 ) 血液缓冲剂 自蛋白像其他蛋白质一样具有两性性质，能与酸或碱结合。白蛋 白等电点低于正常血液p h 值，它是弱酸，一部分以酸的形式存在， 另一部分与阳离子结合成弱酸盐，这两部分形成的缓冲对构成血液总 缓冲系统的一部分。 ( 2 ) 营养作用 白蛋白的氨基酸组成包括了2 0 种受遗传密码控制的氨基酸，包 西南科技大学硕士研究生学位论文第4 页 含有较多的必需氨基酸，是均衡、齐全的氨基酸来源。滋养细胞的蛋 白质约1 3 来自肝脏合成的白蛋白。肝脏每日合成的白蛋白几乎全部 被各种组织细胞消耗，用来合成具有特殊功能的另一种蛋白质。白蛋 白离开血管系统，抵达细胞膜，进入细胞内，水解后再合成各种蛋白 质。进入细胞内的白蛋白分解能提供合成另一种蛋白质所需要的大部 分能量，又能够在同一时间提供比例合适的各种氨基酸，因此细胞能 充分利用白蛋白。 ( 3 ) 维持血液渗透压和液体交换 血浆中蛋白质浓度大于组织液，所以具有较高的渗透压，血浆与 组织渗透压之差为血浆的有效渗透压，它有使物质从组织进入血液循 环的作用。在正常人体微循环中，血浆与组织液间不断频繁的交换液 体及溶于水中的营养物质和代谢产物，在新陈代谢中起了重要作用。 ( 4 ) 运输功能 血清白蛋白具有广泛的结合能力，能结合许多内源性和外源性物 质，也能同难溶于水和溶于水的物质相结合，具有重要的生理意义和 临床意义i t t , 12 1 。这些物质与白蛋白的结合部位、结合方式及竞争作用 等，已是被广泛研究的课题，但目前尚未完全阐明。 1 2 1 4 血清白蛋白的光谱性质 ( 1 ) 紫外可见吸收光谱 在组成蛋白质常见的2 0 种氨基酸中只有芳香族氨基酸如色氨酸 ( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 、苯丙氨酸( p h e ) 和含硫氨基酸有吸收。蛋 白质的紫外吸收主要可分为三个吸收区域m ，：a 、2 5 0 2 8 0 n m ，来源于 芳香族的氨基酸残基；b 、2 1 0 - 2 5 0 n m ，是由于多种因素，如芳香族和 其他残基的吸收，和某些氢键的吸收或与其他构象和螺旋有关的相互 作用；c 、2 1 0 n m 左右，是由于肽键的吸收及诸多构象方面的因素，。 ( 2 ) 荧光光谱 蛋白质分子中的色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 以及苯丙氨酸( p h e ) 三种芳香族氨基酸残基能发射荧光，所以蛋白质属于内源性荧光物 质。三种氨基酸( t r p 、t y r 以及p h e ) 由于其侧链生色团的不同， 其荧光激发和发射光谱特征不同及在相同条件下的荧光强度之比约 为1 0 0 ：9 ：0 5 “”。t r y 残基对微环境极性的变化很敏感，可用来研 究蛋白质分子的构象变化以及研究白蛋白的变性等。 西南科技大学硕士研究生学位论文第5 页 ( 3 ) 红外光谱 蛋白质二级结构的酰胺带在红外有特征吸收。酰胺i 带 ( 1 7 0 0 1 6 0 0 c m 。) 主要是蛋白质骨架链羰基伸缩振动吸收，对其二级 结构的变化非常敏感：酰胺带( 1 6 0 0 1 5 0 0c m l ) 包含了c - n 的伸 缩振动和n h 的变形振动，由于酰胺i i 带较弱，对二级结构变化的敏 感程度次于酰胺i 带；酰胺带( 1 3 2 5 - 1 2 2 5c m 。) 也能反映蛋白质 的二级结构变化，并且它不受水吸收峰的影响，因此可以把它和酰胺 i 带相结合对蛋白质的二级结构进行定量分析。 1 2 2 小分子 1 2 2 1 药物 药物与人类的生活和健康密切相关。一般来讲，药物通过各种生 物膜从血液转移到各组织器官，并在不同程度上与血清蛋白结合，形 成药物一蛋白复合物，这是一个迅速可逆的过程。药物一蛋白复合物可 以看作是药物在生物体内的暂时贮存形式，可以有效地避免药物被迅 速代谢而消除，从而可以维持血浆中血药总浓度和有效浓度的持续。 此外，生物体对药物毒副作用的瞬时耐受与游离药物浓度直接相关， 药物一蛋白结合也被看作是蛋白对生物体天然自我保护功能，的重要 体现。所以，药物一蛋白结合直接影响着药物在生物体内的分布、贮 存、转运、药效、药物代谢以及毒副作用等方面的性质i i ，, jj ，。目前药 物与蛋白作用研究主要包括结合常数、结合位点数、结合位置及作用 力类型等内容，其研究方法涉及到几乎所有的现代测试方法。与蛋白 作用的药物主要有抗癌药物 j t - ：s 一、抗病毒药物m 一、镇静药物15 5 - ，7 ，、心 血管类药物”t 、抗氧化药物“”、农药及杀虫剂m 一，等。此外，这些 药物绝大多数属于人工合成药物，随着对人工合成药物的毒副作用认 识水平越来越深入，近年来许多文献报道了中药活性成分14 - 4 1 ，与蛋白 的作用。 1 2 2 2 有机毒性物质 所谓毒性物质，是指较小量就可通过侵袭组织和细胞，破坏机体 的正常生理功能，甚至导致机体死亡的一类物质。有机毒性物质可简 单分为食品中存在的毒性物质m 一，、环境污染物14 b , $ 6 , $ 7 ，、工作环境中 的污染物”，和代谢产生的毒物一。有机毒性物质进入人体后，蛋 西南科技大学硕士研究生学位论文第6 页 白质中含硫氨基酸如甲硫氨酸、胱氨酸和半胱氨酸等能提供一s h ，部 分毒物和一s h 结合后，被转运到其它组织释放出来，产生危害作用。 有机毒性物质与血清白蛋白相互作用的研究对揭示毒性物质在体内 蓄积、代谢及危害机理有着重要意义。 1 2 2 3 有机染料 染料是常见的分析试剂，蛋白质的临床分析中研究最多、应用最 广、操作较为简便的分子光谱法就是基于染料与蛋白质的相互作用而 建立起来的。蛋白质与染料通过氢键、静电力、疏水作用力、范德华 力等作用力结合生成复合物，这些复合物能够在特定光波区域有特异 性吸收或发射，因而能够借助简单的分光光度法进行蛋白质、d n a 等 生物大分子的快速定量测定”1 ，因此，关于染料小分子与蛋白质的 相互作用研究( i , 6 3 - h l 一直是生物化学与分子生物学、医学特别是分析 化学等学科领域的热门课题之一。但到目前为止，蛋白质与普通染料 分子间是否以化学计量定量结合、结合方式如何、形成复合物的物种 是否单一等问题尚未解决，这些悬而未决的问题一方面极大地制约了 生物大分子快速定量分析方法的建立，同时也为该方向的深入研究提 供了广阔的空间。 1 2 2 4 表面活性剂 表面活性剂具有增溶、增敏、增稳的分析化学特征，随着表面活 性剂的特征研究的进展，表面活性剂与蛋白质相互作用在生物科学和 生物技术领域中得到广泛的应用，这一领域的研究主要集中于以下方 面：( 1 ) 表面活性剂一蛋白质复合物结构( 项链模型、棒状模型和柔 软的螺旋模型) 研究及蛋白质结构的变化；( 2 ) 表面活性剂一蛋白质 混合溶液的相行为；( 3 ) 表面活性剂一蛋白质混合液的界面吸附。常 用的体系为牛血清蛋白( b s a ) 和十二烷基硫酸钠( s d s ) 1 9 , 7 0 - 7 ，等。 实验获得了表面活性剂与b s a 的结合参数和热力学参数，并建立了血 清白蛋白构象改变与表面活性剂浓度之间的关系。蛋白质在表面活性 剂反相胶束溶液中所表现出来的生物活性，给蛋白质一表面活性剂的 研究又注入了新的内容。同时，新型表面活性剂的不断出现和应用也 为这一领域的发展创造了更大的空间。 西南科技大学硕士研究生学位论文第7 页 1 2 2 5 金属离子 金属离子广泛存在于生物体内并积极参与着各种生命活动，尤其 是各类内源和外源金属离子广泛参与甚至是调控着生命活动过程。它 们能与生物分子产生各种键合作用，从而在生物体内承担各种各样的 功能，如电子转移、载氧、酶的活性中心等。体内金属离子过多或多 少都将导致人体正常生理功能的紊乱，从而导致各种各样的疾病。各 类金属离子与蛋白质的相互作用研究已经成为生物无机化学的主要 内容。当前，国内外学术界普遍比较关注的是金属离子17 5 - $ ，阴离子 n ”与蛋白的相互作用，近来，复杂多酸阴离子m ，乃至电解质溶液n 一” 等与蛋白的相互作用也有报道，这些研究均有助于人们深入了解无机 离子的生物学效应。 1 2 2 6 纳米无机材料 由于纳米材料有其独特的优点，导致其不同于传统的材料又异于 分子原子等微观物质的独特性能，因此在许多领域得到了广泛的应 用。如何将纳米技术与生命科学结合起来是当今科学面临的重要问 题，备受关注。目前，纳米无机材料如半导体纳米粒子、金纳米、纳 米银粒子和纳米发光材料等已用于蛋白质的标记和分析检测”。 量子点由于粒径很小( 约1 1 0 0 n m ) ，电子和孔穴被量子限域， 连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与一些有 机分子很相似，可以发射荧光。相对于传统的荧光染料量子点具有许 多优点，其荧光激发光谱和发射光谱可以通过改变纳米粒子的尺寸和 组分来进行控制，并且发射光谱有窄的半峰宽。 1 3 小分子与蛋白质相互作用的研究内容和现状 1 3 1 小分子与蛋白质相互作用模型 不同情况下，获取小分子一蛋白质相互作用定量关系参数的数学 模型已经初步建立，广为采用的有s c a t h a r d 模型n ”，、专一性和非专 一性模型“”，、相分配模型”等。我国学者杨频基于某些离子探针物 质对蛋白质内源性荧光具有荧光敏化的现象，提出了新的理论计算公 式，该公式先由最小二乘法拟合获得结合位点数n ，再作 l i n e w e a v e r b u r k 双倒数图可获得k 。另外，由杨频基于s c a t h a r d 西南科技大学硕士研究生学位论文第8 页 模型提出的荧光猝灭方程 io s ，通过l i n e w e a v e r - b u r k 双倒数作图， 可以获得药物一蛋白质复合物的解离常数结合常数k 。n ”，但不能同时 获得结合位点数n 的信息。 s c a t h a r d 模型将小分子配体与蛋白质等大分子的结合看作是小 分子配体与大分子特定部位的结合，这些结合部位完全一样，并且这 些结合部位与配体的作用是独立的，不存在相互作用。无论是单一或 者是多部位结合，根据s c a t h a r d 模型均可得出蛋白质与小分子配体 的结合常数以及结合数。 t a i t a l l $ 1 提出了专一性与非专一性模型，认为血清白蛋白和配体 之问存在专一性结合和非专一性结合两种作用。专一性结合遵循 s c a t h a r d 模型，其特点是高亲和性以及较小的结合位点数：非专一 性结合就像在水相和有机相中的分配，特点是低亲和性，对配体的结 合容量是无限的，即不存在最大结合数，两种作用之间不存在协同作 用。 相分配模型”认为血清白蛋白对阴离子染料的吸收光谱和质子 化常数的影响类似于表面活性剂胶束的作用，没有特定的专一性的结 合位点。血清白蛋白可作为一个不同于水的微相，微相分散在水相中， 配体分子在微相和水相中分配，最后达到平衡。 1 3 2 小分子与蛋白质的结合部位 生物大分子与有机小分子的结合，主要是通过一些非共价键的结 合。它们之间的相互作用力，主要是指受体的活性位点周围的氨基酸 残基中的原子与对应此活性位点的配基中的原子之间的相互作用力。 这些相互作用力主要包括静电相互作用力，氢键，疏水相互作用和范 德华力等。 ( 1 ) 将蛋白质分割片段 蛋白质可以被某些特殊试剂分割为不同的片断，根据各药物与片 断作用情况来确定药物的结合部位。但是蛋白质分割为小片段后，他 的构象将发生变化，药物与蛋白质的作用也会改变，使其应用受到局 限。 ( 2 ) 用具有特定已知结合部位的探针与猝灭剂发生置换作用 某些荧光探针对蛋白质不同区域有特异性的结合，根据标准物加 入后对猝灭剂的影响可以确定猝灭剂的结合部位，并可计算给体与受 西南科技大学硕士研究生学位论文第9 页 体之间的结合距离 ( 3 ) 对蛋白质上的氨基酸残基进行修饰 将某种氨基酸残基进行修饰后，再与小分子进行作用，比较修饰 前后的变化就可以判断出这种氨基酸在药物与蛋白相互作用中起多 大作用，药物是否结合在这种氨基酸的周围等信息。 1 3 3 小分子与蛋白质作用体系的热力学参数及作用力类 型 将相对成熟的化学基本理论应用于研究小分子一蛋白质的相互作 用过程，不仅可以将传统化学理论的应用领域拓展，而且可以不断丰 富某些新兴领域理论体系的构建。小分子与蛋白质相互作用过程的 h 、s 以及g 等热力学特征参数的实验直接测量n ，和理论推算o ， 已经成为研究的内容之一。在蛋白质不发生变性的温度范围内，测得 不同温度下的结合常数，利用v a n th o f f 方程，可获得配体与蛋白质 作用的热力学常数。 小分子配体和蛋白质之间的作用力包括氢键、范德华力、疏水作 用力和静电引力等非共价作用力t t lo - i i ，。可以根据热力学参数判定不 同探针小分子与蛋白质的作用类型。r o s s 等n - ”根据大量的实验结果， 总结出判断生物大分子与小分子结合力性质和生物大分子自身结合 力性质的热力学规律，即疏水作用力有可能使体系的h 和s 增大； 氢键或者范德华力有可能使体系的h 和as 减小；静电作用力使h 。0 ，s o 。而在实际体系中，小分子与蛋白质相互作用过程中存在 多种作用力。 1 3 4 小分子与蛋白质的结合距离及能量转移 在荧光能量的给予体和接受体分子问可以发生电子激发能的非 辐射转移，因为蛋白质的内源性荧光主要是t r p 发出的，利用f s r s t e r 能量转移理论可以求出和蛋白质作用的小分子与蛋白质分子中t r p 残基之间的距离，由此可以推测小分子与蛋白质分子的结合部位。 根据f s r s t e r 型偶极一偶极无辐射能量转移机理m ”w ：转移效率 与给体一受体间距离r 及临界能量转移距离r 。有关，给体与受体间能 量转移效率e 为 e = r o ( r 0 6 + r 6 )( 卜1 ) 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 0 页 其中r o 是转移效率为5 0 时的幅界距离 r 0 6 = 8 8 1 0 。5 ( k 2 n - 4 j )( 卜2 ) 式中k 2 是偶极空间的取向因子，n 为介质的折射指数，中为给体的光 量子率，j 为给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱问的重叠积分 j = f ( ) 毛( ) 九4 入f ( ) ( 1 3 ) 式中f ( - ) 为荧光给体在波长 处的荧光强度，( 为受体在波长x 处的摩尔吸收系数，能量转移效率可由下式给出 e = l f f o( 1 4 ) 其中f 和f o 分别为能量接受体存在和不存在时的能量给予体的荧光 发射强度。 1 3 5 蛋白质的构象变化及二级结构含量的测定 蛋白质( 尤其是具有复杂生理功能的蛋白质) 能够根据自身所处 环境的微小变化，自发地进行分子构象转变是体现蛋白质生理活性的 重要特征，也是活性生物大分子与一般化学大分子的根本本质区别之 所在。血清白蛋白在溶液中存在同分异构体m ”。p h 在4 5 - 7 5 之间 为n 型，p h 在3 o 一4 5 之间转变为部分酸膨胀f 构象，p h 8 时为另 一种膨胀的b 构象。3 种构象能可逆转换。蛋白质在溶液中存在多种 空间结构，其特定的生理活性在很大程度上由其构象决定”。小分 子配体与蛋白质作用后，或多或少会对蛋白质构象产生影响，从而诱 导蛋白质结构发生一些变化。测定蛋白质二级结构的变化是蛋白质与 小分子相互作用研究的重要内容。目前，研究蛋白质二级结构变化的 主要方法有荧光和紫外光谱法、红外及拉曼光谱法、圆二色谱法等。 童义平等”利用f t i r 研究了固体b s a 及其水溶液的红外光谱， 通过对其酰胺i 带进行傅立叶去卷积谱分析，对固态及部分水溶液中 的二级结构构象进行了指认。实验结果显示，b s a 溶液状态与固态时 的二级结构不完全相同。对于溶液中的b s a ，存在明显的溶剂化效应， 随着b s a 溶液浓度的降低，酰胺i 带二级结构峰存在明显的位移现 象，说明溶剂水对蛋白质结构链上的氢键产生了影响，从而造成了蛋 白质的二级结构构象的变化。文献“w 比较了h s a 与药物作用前后的 红外光谱，结果发现作用后的蛋白质的酰胺i 带和酰胺i l 带的最大吸 收峰发生了位移，说明蛋白质的二级结构发生了变化，远紫外圆二色 谱法证明与药物作用后蛋白质的n 一螺旋含量减少。谢孟峡等利用衰 西南科技大学硕士研究生学位论文第1 1 页 减全反射傅立叶红外光谱结合荧光光谱和紫外一可见吸收光谱研究了 氯原酸、阿魏酸与h s