（微生物学专业论文）耐热果胶酸裂解酶编码基因pel9a的克隆与表达.pdf

摘要 摘要 果胶酸裂解酶可用于香料油和类胡萝h 素等医用原料的提取，咖啡和茶的发酵，含 有果胶质废水的处理以及原油的提取过程。近年来又发现了果胶酸裂解酶还可用于植物 病毒的纯化、纸浆漂白和以纺织品的生物精炼等。 利用p c r 技术从耐热梭状芽孢杆菌c 协s 一砌“s 把陀d 阳，m m 中扩增得到产耐热果胶 酸裂解酶的结构基因p 8 ，鲥，并将其克隆于表达载体p e t 2 8 a 中，构建表达型重组质粒 p p e l 9 a 。将此重组质粒转化到受体菌e ，fb l 2 1 中进行表达，经3 7 培养2 h ，在o 8 m m o l l 的i p t g 存在下，于3 7 诱导5 h ，经s d s p a g e 分析表达的蛋白质的分子量为 1 3 0 k d a ，与预期分子量相符。细胞经超声破碎，测的果胶酶的比酶活为1 5 u m g 粗蛋白。 对质粒稳定性的研究表明，ec d ，fb l 2 l ( p p e l 9 a ) 在无选择压的情况下3 7 连续转接5 次，质粒丢失率仅为1 5 ，说明质粒基本稳定。 通过单因素和正交试验，优化得到用于培养重组菌e ，fb l 2 1 ( p p e l 9 a ) 产酶培养基 组成为葡萄糖1 0g l ，硫酸铵2g l ，蛋白胨2g 几，柠檬酸1 0g l ，磷酸二氢钾1 2 5g ，l ， m g s 0 4 7 h 2 01g l ，氯化钠2g l ，t e s5m l 厄，p h 为7 0 。经优化后，摇瓶培养得到 菌体量为2 6 9 6g l ( d c w ) 。在5l 台式搅拌发酵罐中，研究了补加碳源对重组菌生长的 影响。控制溶氧在3 0 以上，初始葡糖糖1 0 9 l ，在对数生长期补加1 0 9 l 的葡萄糖， 培养至8 h ，菌体量达到6 3 8 8g l ( d c w ) ，果胶酸裂解酶活性为3 5 u m l 培养液。 粗酶液经h i t r a pc h e l a t i n gh p 镍亲合柱和s u p e d e x 2 0 0 凝胶柱进行了纯化。对部分 纯化的耐热果胶酸裂解酶的酶学性质研究表明，其最适p h 为7 0 ，将酶液在不同p h 缓 冲液中于4 处理1 2 小时后测定的酶活表明其在p h 5 9 范围内稳定，酶的最适温度为 6 5 ，温度稳定范围为4 0 7 5 。不同的金属离子对酶活的影响不同，f e ”能完全抑制 酶的活性，m g ”、k + 、c o ”、n i 2 + 和n a 十对酶活有不同程度的抑制作用，c a 2 + 在 o 0 1 o 2 m m o l l 的范围内对酶有明显的激活作用，最高的激活浓度为0 0 5 i i l i n o l l 。 关键词：耐热果胶酸裂解酶；c f o s 护触“ms 耙w o m r f “m ；重组；质粒；培养；表达；纯化 酶性质。 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t p e c 诅t el y a s ec a nb eu s e df o r t h es 印a r a t i o no ff l a v o ro i la i l dc a m t e n 0 1 d ，t h ef b 肌e m a t i o n o fc o 艉ea i l dt e a ，t l l ed i s p o s i n go fw a s t ew a t e ra n dt h ed i s t i l l i l l go f b a s eo i l i tw a sa l s of b 咖d r c c e m l y 也a tt l l ep e c t a t el y a s ec o u l db eu s e df o rt h ep 耐f i c a t i o no fp l a n tv i r u s ，b l e a c l l i n go f p a p e rp u l pa n dm eb i o r e f i n i n go f t e x t i l e se t c t h ep p ，9 爿g e n ee n c o d i n gp e c t a t el y a s ew a s 锄p l i f i e db yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n u s i n gc f 伽一砌“棚j 陀，c o ，四。f “埘c l l l o m o s o m a ld n a 嬲at e m p l a t e ，a n dm e ni tw a sc l o n e di n t o p e t 2 8 at o r e c o m b i n eae x p r e s s i o np l a s m i dp p e l 9 a ，f i n a l l yt h ep l a s m i dp p e l 9 aw a s 位m s f o h n e di i l t oe c o “b l 2 la n de x p r e s s e du n d e rt h ec o n t r o lo ft 7 f d cp r o m o t e ra t3 7 、v i t l l0 8 m m o l li p t ga si n d u c e rf o r5h o u r s s d s - p a g ea 1 1 a l y s i sr c v e a l e dt h a tt h e r e c o m b i n a i l ts t r a i nb e a r i n gt 1 1 ep l a s m i dp p e l 9 ac o u l de x p r e s sm et a r g e tp r o t e i n ( 13 0 k d ) ，谢t h t h em o l e c u l a rw e i g h ta sm es 锄eo fe x p e c t e dp e c t a t el y a s ep m t e i n t b es p e c i f i ca c t i v i t yo f p e c t a t el y a s ew a s1 5 u m gc m d ep r o t e i n 1 1 1 ec o n d i t i o n sf o re ，fb l 2 1 ( p p e l 9 a ) c e l lg r o w t hi nn a s kw e r eo p t i l l l i z e d 1 1 1 e o p t i i i l i z e dm e d i u mi sc o m p o s e do f g l u c o s e1 0g l ，( n 1 4 ) 2 s 0 42g l ，p e p t o n e2g l ，c i t r i c a c i d1 啦，k h 2 p 0 41 2 5g 几，m g s 0 4 7 h 2 01 0 l ，n a c l2 l ，仃a c ee l e m e n t ss 0 1 u t i o n ( t e s ) 5m l ，l 2 6 9 6 叽o f d r yc e l lw e i 曲tw a so b t a i l l e d n ee a e c to f d i s s o l v e do x y g e n ( d o ) c o n c e n t r a t i o na 1 1 dt h ef e e d i n go f c a r b o ns o u r c ef o rm eg r o w mo f e ，fb l 2 1 ( p p e l 9 a ) w e r e s t i l d i e da ta5 0 lf 宅r i l l e n t o lw h e n 血ed ow a sc o n 廿0 1 1 e da b o v e3 0 ，m ei n h i a lg l u c o s e c o n c e n t r a t i o nw a s1 0 9 ，la 1 1 dl o g lo f 9 1 u c o s ew a sf 曲d e da tl o gp h a s eo f c e l lg m w m ，d r yc e l l w e i 出r e a c h e d6 3 8 8g l 心e r8 hi n c u b a t i o n ，a 1 1 da c t i v 时o f p e c 诅t el y a s ew a s3 5u m lc e l l c u n u r e t h er e c o m b i l l 卸tp e c t a t el y a s ew a s p u r i f i e d w i t l lh i t r a pc h e l a t i n gc o l 咖a n d s u p e r d e x2 0 0c o l m n 1 1 1 ep a n i a lp 耐f i e dr e c o m b i n a l l tp e c 诅t e1 y a s ew a sc h a r a c t e r i z e d t h e o p t i m u mp hw a sf o u n d t ob e p h 7 ow h e n t 1 1 e e r i z y m ea c t i v i t y w a sa s s a y e di n b r i t t i o n - r o b i i l s o n su 1 1 i v e r s a lb u 仃e rs o l u t i o na tv 撕o u sp h s 1 1 1 ee n z y r n ew a ss t a b l ei 1 1m e m n g eo fp h6 5t o8 0 ，w h e ni n c u b a t e di nt h es 锄eb u 舵rs 0 1 u t i o na tv a r i o u sp h sa t4 f o r 1 2h r s t h ee 1 1 z y m ew a so p t i m a l l ya c t i v ea t6 5 a r i ds t a b l ei nm er a l l g e do f 4 0 7 5 u 1 1 d e r h e a tt r e a t m e n tf o r1om i n t h ee n z y m ea c t i v i t yw a sc o m p l e t e l yi n h i b i t e db yo 1m m o l ，lf e p ， a i l dw a sp a n l yi n l l i b i t e db ym g “，k + ，c 0 2 + ，n i 2 + a n dn a + t h ee 1 1 z y m ew a sa c t i v a t e d t h r o u 曲o u tar a n g eo fc a c l 2c o n c e n 仃a t i o nf r o m0 o l t o0 - 2m m o l l ，a n dt h eo p t i m a la c t i v i t y w a so b s e r v e da to 0 5 m m o l ，lo fc a c l 2 k e yw o r d s ：p e c t a t el y a s e ，c ，d 5 护枷“ms f p r c d r 删f 甜m ，r e c o m b i n a n t ，p l a s m i d ，c u l t i v a t i o n ， e x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n 2 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：重i ! 亟日期：丸。6 年6 月勺日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江 南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：重强盔，通导师签名：刍i ：土 日期： 如o5 年6 月f o 日 第一章绪论 1 - l 研究背景 第一章绪论 1 1 1 果胶质及果胶酶 果胶质广泛存在高等植物中，是植物细胞间的胞问层和初生壁的重要组分。果胶质 在植物的细胞组织中起着“粘合”作用，一旦植物组织中的果胶质分解便引起细胞的离 散，果胶质按其分子中d 一半乳糖醛酸羧基的酯化度，可分为果胶、果胶酸和原果胶三 种不同类型”j 。 果胶酸( p e c t i ca c i d s ) 又叫聚半乳糖醛酸( p o l y g a l a c t u m n i ca c i d ，p g a ) ，是由d 一 半乳糖醛酸脱水缩合、以口一1 ，4 糖苷键连接而成的直链状聚合物。 果胶( p e c t i n ) 又叫聚甲氧基半乳糖醛酸( p o l y m e t l l o x y g a l a c t u r o n i ca c i d ，p m g a ) ， 是由p g a 分子c 5 上所带的羧基与甲醇酯化而成。在过去的七十年，人们逐步建立起了 对果胶结构普遍接受的认识【2 】。新近的研究表明，天然果胶不是线型分子而是多分支分 子，是由鼠李糖与多个p g a 连结成的鼠李糖一半乳糖醛酸聚糖为主链，由d 半乳糖、 l 邛可拉伯糖及木糖等分别组成长短不同的侧链。目前已有三种果胶多糖从初生胞壁中分 离出来。它们是均一的聚半乳糖醛酸( h g ) 、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖一i ( r g i ) 及取代 半乳糖醛酸聚糖( r g i i ) 。 p m t o p e c t i n 即是通常所说的原果胶。它不溶于水，而不溶于水的原因较为复杂【3 】， 一般可分为以下几种：( 1 ) 果胶分子与细胞壁的其他组分连接在一起，如半纤维素或纤 维素等，其中果胶分子上的羧基可能与这些组分分子上的羟基形成酯键；( 2 ) 果胶分子 与多价金属离子连接在一起，如c a 2 + 、f e 2 + 、f e 3 + 及m 矛+ 等；( 3 ) 果胶分子的羧基与蛋 白质分子的碱基通过盐的形式架接在一起；( 4 ) 果胶分子间及果胶与其他胞壁组分间以 次价键形式相互缠绕在一起；( 5 ) 与一般的果胶分子相比，原果胶的分子量较大。 果胶酶是可以作用果胶质的一类酶。通常情况下，可根据以下标准对果胶酶进行分 类：( 1 ) 果胶、果胶酸或低聚半乳糖醛酸是否为其优先底物；( 2 ) 这些底物是被反式消 去作用还是水解；( 3 ) 切割方式是任意的( 内切酶) 还是发生在末端方向的( 外切酶) ； ( 4 ) 作用适宜p h ( 酸性或碱性果胶酶) 【4 】。通常，果胶酶可分为以下三种类型： 1 果胶甲酯水解酶( p e c t i n e s t e m s e ，p e ) 切割果胶上的甲氧基基团形成果胶酸。 2 果胶质降解酶( d e p o l y m e r i z i n ge 1 1 z y m e s ) ，分为两种类型： 第一类降解酶专一性水解底物的a 1 ，4 糖苷键，可分为： ( 1 ) 聚甲基半乳糖醛酸酶( p o l y m e m y l g a l a c t u m n a s e ，p m g ) ，包括内切酶( e n d o p m g ) 与外切酶( e x o p m g ) ，作用底物为果胶。 ( 2 ) 聚半乳糖醛酸酶( p o l y g a l a c t u r o n a s e ，p g ) ，包括内切酶( e n d o p g ) 与外切酶( e x o p g ) ， 作用底物为果胶。 江南大学硕士学位论文 第二类降解酶则通过反式消去作用切割n 一1 ，4 糖苷键，在半乳糖醛酸非还原末端形 成c 4 和c s 不饱和键，可分为： ( 1 ) 聚甲基半乳糖醛酸裂解酶( p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a s el y a s e ，p m g l ) ，包括内切酶 ( e n d o p m g l ) 与外切酶( e x o p m g l ) ，作用底物为果胶。 ( 2 ) 聚半乳糖醛酸裂解酶( p o l y g a l a c t u m n a s el y a s e ，p g l ) ，包括内切酶( e n d o p g l ) 与外切酶( e x o p g l ) ，作用底物为果胶酸，也叫果胶酸裂解酶( p e c t a t el y a s e ) 。 3 原果胶酶( p r o t o p e c i n a s e ，p p a s e ) 将原果胶分解为水溶性的高聚合度果胶。可分为【5 j ： ( 1 ) a 型原果胶酶( a p p a s e ) ，作用于原果胶内部区域的聚半乳糖醛酸部位。 ( 2 ) b 一型原果胶酶( b p p a s e ) ，作用于与聚半乳糖醛酸链和胞壁组分( 如纤维素等) 相连的多糖链。 1 1 2 果胶酸裂解酶的工业应用 酶制剂是一类具有生物催化能力的蛋白质，它以用量少、催化效率高、专一性强为 特点，在生物技术领域备受瞩目。长期以来，人们从动物、植物、微生物中进行具有酶 活力的酶制剂的提取，其应用领域已遍及轻工、食品、化工、医药、农业以及能源、环 境保护等诸多方面。近十年来，酶制剂产业已经成为生物工程的重要组成部分，它的发 展非常迅速。 果胶酸裂解酶可用于香料油和类胡萝h 素等医用原料的提取，咖啡和茶的发酵，含 有果胶质废水的处理以及原油的抽提过程。近年来又发现了果胶酸裂解酶新的用途，如 植物病毒的纯化、纸浆漂白和纺织品的生物精炼等【6 工。 棉花外面的保护层为细胞壁，其中含有以果胶质为主的各种杂质，对棉纤维起到一 定的保护作用，但同时这也给棉织物的加工带来了一定的困难。在棉织物的进行精炼的 工艺中，果胶质及其他一些杂质是主要的处理对象。棉纤维中的天然杂质主要集中在初 生胞壁和角质层中，由于产地及气候等多方面因素的影响，其组分也会有所差异，各组 分的具体含量见表1 1 【9 j 。 表1 1 棉纤维中各组分的含量 t h b l e1 1c o n t e n to fi n g r e d i e n t si nc o t t o nf i b e r s 第一章绪论 在传统的棉纺织品精炼工艺中，一般使用氢氧化钠的强碱溶液在高温下，有时甚至 在超过水沸点情况下，对退浆后的棉织物进行处理，以除去其表面的非纤维成分。在此 过程中，棉纤维会因形成氧化纤维素而遭到损伤。另外一方面，棉纤维表面因去除了大 量起润滑作用的腊质而失去应有的手感。传统碱精炼工艺中除了要加入大量强碱，还要 加入湿润剂、鳌合剂、还原剂和软化剂，并且由于碱精炼残液具有很高的p h ，需要加 入硫酸或二氧化碳进行中和，二者都会增加排除废水的盐浓度，使生产排出的废水具有 较c o d b o d 【l 。对于生产而言，还将耗费大量的时间及工艺用水，而且中和碱形成的 盐类物质会对织物的色泽产生影响，更为重要的是，上述处理方式对环境产生的负面影 响更应该引起我们的重视。 利用酶法进行生物精炼就是实现绿色纺织品生产的趋势之一。利用生物酶处理方法 可大大改善棉纺织预处理工艺对产品质量及环境的影响【“】。例如，可节约大量工艺用水、 生产时间、能耗、原料及对废水的处理费用，减少对环境排放水中的盐含量及c 0 d 等。 1 1 3 耐热酶的应用价值 在细胞中，酶参与生物化学反应，如能量的转化、新陈代谢和遗传过程。在一些极 端的环境下( p h ，温度) ，酶参与反应有着诸多的限制。而且现在许多酶和微生物工业 过程都是在高温下进行的，在高温下进行反应过程的主要优点在于反应速率较高，同时 多数化学物质的溶解度、流动性和扩散度都有提高，还可以阻止微生物污染，所以耐热 酶在工业生产中有着很大的应用价值。高温细菌是耐热酶包括耐热果胶酶的主要来源。 1 1 4 国内外研究动态 果胶酶具有广泛的微生物来源，细菌汜引、真菌1 5 ，1 棚和放线菌都可以产果胶酶。 但能产生果胶酸裂解酶并具有工业化使用前景的细菌却不多【1 8 ，19 1 。1 9 7 2 年，h o i k o s h i 第一次用嗜碱细菌制得了碱性果胶酶2 0 1 。此后，不同的研究表明【2 1 - 2 3 】，芽孢杆菌作为生 产果胶酸裂解酶用菌较为理想。日本近年来开发出了用于生物精炼的果胶酶。另外，随 着n o v on o r d i s k 公司于1 9 9 9 年推出用基因工程改造菌种生产的果胶酶，将人们的注意 力更多的集中到基因工程菌上来。 国外科技工作者利用果胶酶及其伴生物，在印染前处理方面做了大量的研究，除了 普通果胶酶以外、原果胶酶和果胶酸裂解酶成为最近研究的重点和热点。 国外报道的微生物产果胶酶主要产品见表1 2 【3 5 】。 我国从9 0 年代初也开始对果胶酶进行了研究，一般均停留在菌种筛选及对酶特性 研究阶段【17 ，”j ，而且对发酵方面研究不多，同时也尚未见有国内外自行开发果胶酶在棉 纺织预处理应用方面的研究报道。 江南大学硕士学位论文 酸性果胶酶 a s p e r g l h mn i g e rc h 4 p e n i c 钍n u m 帝e q u e n t a n s s c l e r o “n mm i 盎i i r h i z o c f o n i as o t n m m w 0 7p m n m c l o c 抒i d i 蜊幽e r m o s a c c h n r o l y t i c h m 碱性果胶酶 丑j 7 j s p r k 9 b 珊s p n t 3 3 b a c i t l p o l y m y x n b m t sp t 讲s 爿m w d 髓s p 肋n 椭d 搬d n 琊c d 坍p p s 挣缸 b m n o p 4 n b 口c m t l ss 把a r o t h e m o p h 锄u s n ”耙f 盯f 啪豇口如跏c e c t2 2 9 4 1 b a c i n l | ss p d n l 肋c 删ws u b t i l i s p 枷f d 研o h 甜置矿f ，曙韶p v g 1 y c i n e a e n d 0 - p e c t i n a s e e n d o p o l y g a l a c t u r o n a s e ( e n d o p g ) e n d o p g e n d o p g p g p o l y g a l a c t u r o n a l eh y d m l a s e p g l p g p g p a t e p e c 诅t e1 y a s e 口a l ) p a t e p g p a t e p e c t ml y a s e p e c t i nl y a s e p a l p a l 4 5 6 0 3 5 5 o 3 5 4 8 50 5 5 7 o b e l o w5 0 5 0 5 5 5 0 4 0 3 0 一4 0 1 2 立题背景及意义 国内对果胶酸裂解酶的研究比较少，同时也未见国内自行开发果胶酸裂解酶在棉纺 织预处理应用方面的研究报道，所以面对国外产品的竞争，必须加紧筛选出能生产适合 我们本国需要的菌种，同时在优化发酵工艺条件的基础上，尽快生产出拥有自主知识产 权及低成本的果胶酸裂解酶。 传统酶制剂的生产技术主要是通过微生物的初级发酵产品来生产商品，需要通过各 种理化因素的改变或对菌种进行突变，但往往提高产量的幅度有限。相对于传统方法， 利用基因工程的方法，我们可以通过人工增加编码该酶的基因的拷贝数从而制造出高产 量的菌株。本实验室通过克隆技术获得产耐热果胶酸裂解酶的结构基因，并将其转入表 达菌体中，以期获得能高效表达的高产菌株。 4 o 5 o稻加”“为如嘶叫 2 6 3 由5：2筋o m o o o ，o加m抖吣m吼吣口：& 第一章绪论 1 3 课题研究内容 论文主要思路：利用基因工程技术，构建重组大肠杆菌，进行耐热梭状芽孢杆菌 ( c f f r 访坍s 鲫o 阳r m m ) 果胶酸裂解酶编码基因的克隆和表达，通过优化培养、表达 条件，提高果胶酸裂解酶的产量。主要内容如下： 1 、用p c r 的方法扩增得到耐热梭状芽孢杆菌( c 0 j 驴胁姗陇! 阳d ，f “m ) 中编码果胶酸 裂解酶9 a ( p e c t a t el y a s e9 a ，p e f 9 a ) 的结构基因卵，姐片段，并将其连接到带有t 7 启 动子的载体p e t 2 8 a 上构建重组表达质粒p p e l 9 a 。然后将p p e l 9 a 转化e ，fb l 2 1 ，获 得重组菌株e 疗b l 2 1 0 p e l 9 a ) ，通过对诱导培养条件的控制使重组菌p g l 活性得以表 达。 2 、对构建好的重组大肠杆菌进行合成培养基的优化，并在台式发酵罐中对重组菌e c o z f b l 2 l ( p p e l 9 a ) 的培养条件进行初步研究。 3 、耐热果胶酸裂解酶部分纯化及性质的研究。 江南大学硕士学位论文 第二章耐热果胶酸裂解酶编码基因p e 娩i 的克隆与表达 2 1 引言 根据报道，c f o j 护油“mj 把，阳r f “埘果胶酸裂解酶基因卵，9 a 为一个由3 7 2 0 b p 组成 的开放读框( o p e nr e a d i n g 丘锄e ，0 r f ) 【”j ，其编码的酶蛋白由1 2 4 0 个氨基酸残基组成， 蛋白分子量在l3 0k d a 左右。本研究首先通过p c r 扩增技术，以c o s ，r 幼“聊盯p o 阳r m 脚 染色体d n a 为模板，以人工合成的寡核苷酸为引物，经l a 一勋口d n a 聚合酶扩增果胶 酸裂解酶p p ，鲥基因；然后，将扩增的d n a 与t 载体p t 7 b l u e 连接，经蓝白斑法筛选 含有目的基因的阳性转化子；最后，将目的d n a 连接到表达载体p e t 2 8 a ，构建表达型 重组质粒p p e l 9 a 。由于该质粒上具有t 7 强启动子，在i p t g 诱导下具有大量表达目的 基因产物的能力，由此，期望获得高表达果胶酸裂解酶蛋白的重组大肠杆菌。 2 2 材料与方法 2 2 1 菌株与质粒 耐热梭状芽孢杆菌c f d s 加油“ms 把”d r r f “m 由日本三重大学生物资源学部提供；t 载体质粒p t 7 b l u e 购于n o v a g e n 公司；ec d ，fx l lb 1 u e ，ec d ，fb l 2 1 、质粒p e t - 2 8 a 由本研究室保藏。 2 2 2 培养基 l b 培养基( g l ) ：胰蛋白胨1 0 ，酵母粉5 ，n a c l l o ，p h7 2 ；固体l b 培养基添加 1 5 的琼脂。 2 2 3 酶与试剂 溶菌酶购于s i g m a 公司，限制性内切酶、t 4 d n a 连接酶、l a 乃g d n a 聚合酶购于 日本1 酞a r a 公司，核酸和蛋白质分子量标准购于p m m e g a 公司，i p t g 购于日本n a c a l a i t e s q u e 公司，丙烯酰胺，n ，n 、一亚甲基双丙烯酰胺，低蛋白分子量标准均为f l u i 【a 公司 产品。其余试剂均为国产分析纯。 溶菌溶液：5m g m l 溶菌酶、5 0 姆m lr n a 酶溶于含有0 3m o l l 蔗糖、2 5 m m o l l o l lt r i s h c l 、2 5m m o i i 。0 1 ，le d t a 、p h 8 o 的溶液中。 t e 缓冲液：1 0m m o l 几o l lt r i s h c l ，1m m o l l o i le d t a ，p h 8 o 。 蛋白电泳试剂：a 液：丙烯酰胺( a c r ) 7 3g ，n ，n 一亚甲基双丙烯酰胺( 甲叉双丙烯 酰胺，b i s ) 2 o g ，加h 2 0 至2 5 0 m l 。b 液：1 5 m o l ，l t r i s - h c l - o 4 s d s ( 将1 8 1 7g t r i s 和o 4gs d s 用5 0 m l 去离子水溶解，然后用lm o i l h c l 调p h 为8 8 ，加蒸馏水定容 至1 0 0 m l ) 。c 液：0 5m 0 1 l t r i s ，o 5 s d s ，用h c l 调节p h 为6 8 。 电泳缓冲液( p h 8 3 ) ：t r i s2 5m m o l l 0 1 几，甘氨酸2 0 0m m o l 几o l ，l ，s d so 1 。 第二章耐热果胶酸裂解酶编码基因，鲥的克隆与表达 4 s d s p a g e 加样缓冲液：t r i so 2 5n u n o l l o l l ，s d s4 ，甘油4 0 ，b p bo 0 0 4 。 使用前按9 ：1 加入d t t ( 或巯基乙醇) 。 凝胶染色液：甲醇4 0 0m l l ，冰醋酸l o om l l ，考马斯亮蓝r 一2 5 00 2 2 。 脱色液：甲醇2 0 0 m l l ，冰醋酸5 0 m l l 。 2 2 4 培养条件 耐热梭状芽孢杆菌( c 协5 驴砌“ms r p 胛d m r f “埘) 在无氧的l b 培养基中6 0 静止培养两 天。ec o ，fb l 2 l 在l b 培养基中3 7 下培养1 2h 左右，摇瓶转速1 5 0 “m i n 。进行酶蛋 白诱导表达时所用的培养基是含5 0 “g ，m l 卡那霉素、lm m 0 1 l 异丙基硫代b d 一半乳糖 苷( i p t g ) 的l b 培养基。 2 2 5 染色体d n a 的提取 ( 1 ) 取培养至对数期的c f 护砌“ms 鲫d m r f 蜊菌液2m l 离心，再加入5m 咖l 的溶菌 酶溶液4 0 0 此，在3 7 保温3 0 m i n ，直至溶液成半透明状。 ( 2 ) 加入2 5 0 此2 s d s 充分混匀，直到溶菌溶液的粘稠度明显降低。 ( 3 ) 加入中性酚氯仿去除蛋白质，直至离心管中界面处的蛋白质残留极少。 ( 4 ) 将上清液小心移入新离心管中，加入l 1 0 体积的3m o l l 乙酸钠，混合后加入等体 积( 与d n a 溶液比) 的异丙醇，混匀后室温静置5 分钟以沉淀d n a ；离心2 分钟，弃 上清。 ( 5 ) 溶解d n a 于5 0 0 此t e 缓冲液中，加入2 5 此1 0 0 m m o l l 的精胺一盐酸，混匀 后室温静置5 分钟，离一心，弃上清。 2 2 6 引物设计及目的基因p c r 方法扩增 根据c f d s ，r 油j 陀r c o ，甜f “m 中p e ，9 a 基因的d n a 序列设计下列引物： 正向引物1 ：5 t t c c a t g g t r g a a g a a g c a g a g g c a a t g c c 3 反向引物2 ：5 g g g c t c g a g r r n a t g c l t t t l l a t t t t t g a 3 引物1 的5 端含 k o i 酶切位点，引物2 的5 端含勋o i 酶切位点。 p c r 扩增条件：5 0 止反应体系( 双蒸水3 1 5 此：l a p c r 缓冲液5 此；2 5 m m o l l d n t p s8 止；模板d n a l 此；1 0 岬o l l 正向引物2 此：1 0 岬o l l 反向引物2 止；l a 一勋q 酶0 5 此) ，9 5 变性5 m i n ，扩增反应3 0 个循环( 9 5 ，3 0s ；5 2 ，3 0s ；7 2 ，4 m i n ) ， 7 2 延伸1 0 m i l l 。 2 2 7p q p e l 9 a 的构建、转化及阳性转化子筛选 采用u n i q l o 柱式d n a 胶回收试剂盒回收p c r 扩增产物，并与t 载体p t 7 b l u e 连接( 连接体系：p c r 回收产物4 儿；p t 7 b l u e1 此：d n al i g a t i o n i 溶液5 此；1 6 保温6 0m i n ) 后转化ec o z fx l 一1b l u e 感受态细胞，通过蓝白斑鉴定挑出阳性转化子。 提取阳性转化子中的质粒并与p e t 2 8 a 分别用勘d i 七d i 双酶切，回收经琼脂糖电泳后 江南大学硕士学位论文 的酶切产物。目的片断与表达载体p e t 2 8 a 连接后转化入ec o ，fx l lb l u e 感受态细胞， 在含卡那霉素的l b 平板上涂布，3 7 静置过夜培养，提取重组质粒p p e l 9 a ，经酶切后 电泳鉴定插入片断的大小，经d n a 序列测定确认克隆基因无突变。将p p e l 9 a 转入受体 菌e c o ，fb l 2 1 感受态细胞，在含卡那霉素的l b 平板上涂布培养，挑取阳性转化子e ，f b l 2 1 ( p p e l 9 a ) 。 分子克隆操作参照文献 2 4 。 2 2 8 租酶液的制备及酶活测定 接种e ，fb l 2 1 ( p p e l 9 a ) 于含卡那霉素的l b 液体培养基中，1 5 0r m i n 振荡培养后 离心收集菌体，用2 0m m o l l ，p h8 o 的t d s h c l 缓冲液洗涤细胞两次，离心后用2 0 f 1 1 l n o l 几，p h8 0 的h s h c l 缓冲液2m l 重悬菌体进行超声波破碎( 破碎时间1 s ，间歇 时间3 s ，3 0 0 次循环，功率2 0 0 w ) ，破碎后离心( 1 2 ，0 0 0r m i n ，1 0m i n ) 。离心所得上 清液即为粗酶液，用于目的酶蛋白分析和酶活测定。 酶反应体系的组成： 0 4 的聚半乳糖醛酸1m l ，2 0 0m m o l l 而s h c lo 5m l ，o _ 2 5m m o l lc a c l 2o 4m l ， 粗酶液o 1m l ，总体积为2m l 。于6 0 恒温水浴反应1 0m i i l 后加5 0 衄o l l h c l2m l 终止反应。在紫外分光光度计a 2 3 5 下测吸光度。酶活测定方法参照文献 2 5 。 根据朗一比尔定律可得：酶活= o n 4 1 0 3 6 + s 2 3 5 其中：a 2 3 5 为溶液的吸光度值； b 为比色皿厚度( c m ) ： 2 3 5 为半乳糖酸在2 3 5n m 处的摩尔吸光系数( c m 。+ m 。1 ) ，为4 6 0 0l m o l 。1 c m ： n 为酶液的稀释倍数 酶活定义：每分钟裂解聚半乳糖醛酸产生l 岫o l 的不饱和半乳糖二酸( i l i l s a n 哟t e d d i g a l a c t u r o n i d e ) 所需要的酶量为一个酶活单位f 3 4 l 。 酶液蛋白浓度测定：以牛血清白蛋白作为标准，用b r a d f - o r d 方法【2 6 】测定。 2 2 9s d & p a g e 蛋白电泳检测酶蛋白表达 s d s p a g e 垂直板蛋白电泳( 分离胶浓度为l o ，浓缩胶浓度为4 ) 检测外源蛋 白的表达情况【2 7 】。 2 2 1 0 重组菌株质粒稳定性实验 将重组e ，fb l 2 l ( p p e l 9 a ) ，接种至不含卡那霉素的l b 培养基中，连续转接5 代， 分别取样稀释涂布含有5 0 m l 卡那霉素的l b 培养基和不含卡那霉素的l b 培养基平 板进行菌落计数，计算质粒丢失率，质粒丢失率计算公式如下： 质粒丢失率( ) = ( 不含卡那霉素平板菌落数一卡那霉素菌落数) 不含卡那霉素平板 菌落数+ 1 0 0 第二章耐热果胶酸裂解酶编码基因p p ，朗的克隆与表达 2 3 结果 2 3 1 克隆及重组质粒p p e d a 的构建 p c r 扩增产物经琼脂糖电泳检测表明在3 7k b 左右有一明显条带，与期望扩增得 到的p e ，鲥结构基因片断( 3 7 2 0b p ) 长度相符，见图2 1 。质粒p p e l 9 a 的构建过程如图 2 2 所示。 l m a r k e r 2 p c r 产物 f i g u r e2 1e l e c 仃o p h o r e s i so f p c rp m d u c t 图2 1p c r 扩增片断纯化电泳图 兰! 堑查兰堡圭兰! 妻! 璧： 图2 2 重组质粒d p e l 9 a 的构建 f i g u r e 2 2c o n s 仇l c t i o no f r e c o m b i n a i l tp l a s m i dp p e l 9 a 1 0 怒ll荨j| 第二章耐热果胶酸裂解酶编码基因p p 舰4 的克隆与表达 2 3 2p p e l 9 a 的酶切鉴定 接种e ，f x l 1b 1 u e ( p p e l 9 a ) 于含卡那霉素的l b 液体培养基中培养1 0h 后进行质 粒提取。小量制备所获的重组质粒p p e l 9 a 经砌o i ，o i 双酶切后，琼脂糖凝胶电泳得到 长度分别为5 3 k b 的载体d n a 片段和大约3 7 k b 的目的基因的插入片段，酶切分析结 果与预期的大小一致。见图2 _ 3 。重组质粒p p e l 9 a 中的p p 丹a 基因的序列经测序确认无 突变存在，具体序列及其编码的氨基酸序列见附录。 l m a r k c n2 一口p e l 9 a d l 十c o i 图2 _ 3 重组质粒d p e l 9 a 的砑o i ， k o i 酶切鉴定 f i g u r e 2 3r e s t r i c t i o ne n 纠m ed i g e s t i o no f t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp p e l 9 a 2 3 3 p 坍a 基因在e 盯b l 2 l 中的表达 将重组质粒p p e l 9 a 转化入受体菌e ，f b l 2 1 感受态细胞中，并通过抗生素( 卡那 霉素) 平板挑取阳性转化子e c d ，fb l 2 1 p e l 9 a ) 。 2 3 3 1 重组菌的生长曲线 图2 4 重组大肠杆菌生长曲线 f i g u r e2 4t h e 盯o 、订hc o u r v eo f r e c o m b i n a n te c o ，f 从图2 4 可以看出2 小时后生长进入对数生长期，1 0 小时后进入稳定期，培养至1 0 江南大学硕士学位论文 小时时菌体浓度最高，a 6 0 0 达到1 7 3 。 2 3 3 2 诱导温度对果胶酸裂解酶活性的影响 温度是影响微生物生理活动的重要因素。它通过影响微生物膜的液晶结构、酶和蛋 白质的合成和活性，以及r n a 的结构及转录等影响微生物的生命活动1 2 。有时，微生 物生长与产物生成所需的最适温度并非一致。为了探讨大肠杆菌的最适表达温度，在3 7 培养e ，fb l 2 1 ( p p e l 9 a ) 2 小时，加入i p t g ( 终浓度1m m o l 几) ，分别于2 4 、2 8 、 3 7 、4 2 下诱导5h 。不同诱导温度下果胶酸裂解酶活性表达情况见图2 5 。由图2 5 可知，在3 7 下果胶酸裂解酶的活性达到1 2 2 2u m g 为所有试验温度下的最高值。这 是由于较高的诱导温度造成酶过快积累而使酶活降低，过低的诱导温度导致酶积累的太 慢而影响酶活。 1 4 一 喜1 1 一 藿8 丑 5 2 02 53 03 5 4 0 4 5 温度( ) 图2 5 诱导温度对果胶酸裂解酶活性的影响 f 噜u r e2 5e 脓to fi n d u c t i o nt e m p e r a t u r co np e c 协el y a s ea c t i v 酊 2 3 3 3i n g 浓度对果胶酸裂解酶活性的影响 本实验构建的质粒包含有乳糖操纵子，可以使用诱导物异丙基硫代一b d 一半乳糖苷 ( i p t g ) 作为诱导剂诱导重组基因的表达，当i p t g 加入后，使阻遏蛋白不能与操纵基 因肠c 结合，致使耐热果胶酶可以大量表达，所以诱导剂i p t g 的不同的添加量往往对 外源蛋白的表达有较大影响，为此，本实验讨论了3 7 培养菌体2h 后不同浓度i p t g 对酶活的影响。分别加入i p t g 至终浓度0 1 、0 3 、o 5 、0 8 、1 0m m o l l ，于3