（基础兽医学专业论文）鸡IgY轻链可变区（ScVltLgt）基因T7+PDT文库构建.pdf

摘要 鸡i g y 轻链可变区( s c v 。) 基因 t 7p d t 文库构建 基础兽医专业硕士研究生朱萍霞 指导教师黄伟副教授 摘要 鸡的免疫球蛋白( 1 m m u n o g l o b u l i n ，l g ) 有三种：i g y 、i g m 和i g a 。i g v 与哺乳动物i g g 的抗病功能相同，但结构上存在差异，i g v 重链上没有铰链结构。i g v 由两条熏链( h e a v yc h a i n ， h ) 和两条轻链t u f tc h a i n ，l ) 构成。各有一个可变区( v a r i a b l er e g i o n ，v ) 位于h 和l 的n 端，称为v h 和v l 。与抗原表位( e p i t o p e ) 特异结合的区域就位于v 上，由v h 和v l 的 三个抗原互补决定区( c o m p l e m e n t a r i t y - d e t e r m i n i n gr e g i o n s ，c d r ) 共同形成。研究表明，编 码k yv l 的基因是v r j 鸡i g yl 的多样性是在鸡法氏囊发育期间依靠基因转换( g e n e c o n v e r s i o n ) 形成。以后在抗原刺激下发生体细胞多样化( s o m a t i cd i v e r s i f i c a t i o n ) 而获得高亲 和力( a f f i n i t y ) 。 鸡与哺乳动物进化距离大。因此鸡对哺乳动物体内的抗原物质容易产生强免疫应答，产 生出针对哺乳动物细胞抗原的高亲和力i g y 。鸡血清中的l g y 先转移到蛋黄中储存，胚胎发育 时又从蛋黄中进入鸡胚血液。利用多次免疫接种技术可以获得高效价特异i g y 的高免鸡蛋， 可以采用生化技术从中制各大量的纯i g y 。许多研究证明，鸡i g y 特异性高，亲和力可与鼠源 单抗媲美，稳定性好( 在7 0 以下和p h 4 以上活性稳定) 。高免鸡蛋生产简便，批量大，无 须采血，符合动物福利。因此，利用蛋鸡大量生产特异i g y 的技术( i g v t e c h n o l o g y ) 倍受重 视，已有产品上市。 鸡k y 技术存在不足之处。( 1 ) 鸡病太多，尤其禽流感等人禽共患病给鸡l g y 产品安全 性带来了影响，专家们呼吁要用s p f 鸡生产l g y 。不难想象，其成本很高，在动物药品市场上 缺乏竞争力。( 2 ) 抗原量大( 多次免疫) ，有些抗原对鸡群健康有危害。( 3 ) 鸡l g v 具有强抗 原性，在哺乳动物上应用时受抗抗体和血清病影响，难以发挥作用。 m c c a f f e r t y ( 1 9 9 0 ) 首次报道出利用p d t 构建抗体基因文库。由于抗体蛋白表达于噬菌 体的表面，采用抗原抗体特异结合的亲和淘洗技术可以获得抗体基因的重组噬菌体克隆。从 这些克隆中提取抗体基因可以在酵母细胞中高效表达和工业化生产。重组噬菌体技术能有效 的模仿免疫多样性和选择性的特征，能很容易的通过测序、突变和筛选来提高重组噬菌体抗 西南大学硕士学位论文 体对抗原的结合力，无限量的合成和表达实际上可针对任何抗原的抗体分子。因此，本研究 的目的就是利用噬菌体表面展示技术构建一个鸡单链抗体基因文库，这为快速研制新抗体奠 定基础。 研究方法：( 1 ) 根据g e n b a n k 报道的鸡i g yv l 框架区( f r a m e w o r k ，f r ) f r l 和f r 4 设 计v h 、v l 的上下游引物，并引入克隆位点；设计亲水性的( g l y 4 s e r ) 3 多肽d n a 接头( l i n k e r ) ； ( 2 ) 从8 周龄鸡脾脏中提取总r n a ，以o l i g o ( d t ) 为引物反转录合成c d n a ，作为模版， 在v h 、v l 上下游引物作用下p c r 扩增获得v h 和v l 基因，利用重叠( o v e r l a p ) p c r 将v h 和v l 通过人工合成的l i n k e r 连接成v w l i n k e r - v l ，即s c f v 基因；( 3 ) 通过s a d 和n o t i 酶切 重组入t 7 s e l e c t1 0 - 3 b 中，经体外包装后转染e c o l ib l t 5 4 0 3 株即获得鸡s c f v 基因t 7p d t 文库；( 4 ) 通过噬菌斑计数库容量，任取6 个噬菌斑进行p c r 鉴定，纯化p c r 产物，测序， 并与g e n b a n k 中鸡i g v 基因序列比对。( 5 ) 选择4 种抗原进行生物淘洗；( 6 ) a i v 和g p v 两 种抗原生物淘洗阳性克隆噬菌体液进行e l i s a 竞争阻断试验：( 7 ) 抗g p vs c v l 砸克隆到表 达载体p e t 2 8 b ( + ) 中，转染t u n e r 进行诱导表达，纯化表达蛋白，采用竞争e l i s a 检测表 达蛋白的抗体活性。 研究结果：( 1 ) 意外获得鸡i g y 轻链可变区基因p d t 文库，命名为鸡i g y 单轻链抗体可 变区( s i n g l ec h a i n o f l i g h t v a r i a b l er e g i o n ，s c v l ) 基因t 7 p d t 文库。测得库容为4 5 x 1 0 6 p f l l ， s c v l 片段大小为4 5 0 b p ；( 2 ) s c v l 序列包含有鸡l g y v l 基因、l i n k e r 序列、未知序列( 2 t o p ) 及重链可变区上游h 5 引物序列。( 3 ) a i v 和o p v 抗原生物淘洗均获阳性克隆s c v l a i v 和 s c v l g p v ，四轮淘洗后噬菌斑回收率分别增加了1 6 3 9 和6 1 倍。( 4 ) s c v d a i v 和s c v i g p v 噬菌体培养液e l i s a 竞争阻断试验的抑制率分别为1 7 6 和1 4 6 。( 5 ) s c j g p v 克隆在 ec o l it u n e r 中表达产物为可溶性蛋白质，分子量为2 3 k d ，竞争e l i s a 检测抑制率达到2 8 ， 说明g p vs c v l 具有抗体亲和性。 结论：构建起了鸡i g ys c v l 基因t 7p d t 文库。从该文库中成功筛选到抗g p v 的s c v l 基因 克隆在ec o l it u n e r 中表达。 关键词：鸡i g y 轻链可变区噬菌体展示基因文库 c o n s t r u c t i o no f s i n g l e c h a i nl i g h tv a r i a b l e r e g i o n ( s c v l ) l i b r a r yo fc h i c k e ni g y g e n e s b yt 7p h a g ed i s p l a yt e c h n o l o g y c a n d i d a t ez h up i n g x i a s u p e r v i s o rh u a n gw e t ( c o l l e g eo f a n i m a l t e c h n o l o g y , s o u t h w e s tu n i v e r s i t y , c h o n g q i n g , c h i n a4 0 2 4 6 0 ) a b s t r a c t t h r e ei m m u n e 。g l o b u l i nc l a s s e sh a v eb e e ns h o w nt 0e x i s ti nc h i c k e n i g y 1 9 ma n dl g a t h e a n t i m a l a d i e sf u n c t i o no fl g yi ss i m i l a rt om a m m a l i a n1 9 g b u tt h es t r u c t u r eo fl g yi sd i f f e r e n tt o m a m m a l i a nl g g 1 9 yi sc o m p o s e do f t w oh e a v yc h a m sa n dt w ol i g h tc h a i n s ，b u tn oh i n g er e g i o n0 1 1 t h eh e a v yc h a i n t h ea n t i g e nb i n d i n gr e g i o n sa r ef o r m e db yt h ei n t e r a c t i o no ft h ev a r i a b l el i g h t ( v 1 ) a n dv a r i a b l e h e a v y ( v h ) d o m a i n s a tt h em n i n ot e r m i n io ft h ec h a i n t h et h r e e c o m p l e m e n t a r i t y - d e t e r m i n i n gr e g i o n s ( c d r s ) ，l o c a t e di nt h ev a r i a b l er e g i o n , a r et h es p e c i f i cb o u n d r e g i o n sw i t ha n t i g e ne p i t o p e i th a sb e e ns h o w nt h a tv lo fi g yi se n c o d e db yt h ev x a n dj xg e n e s t h em e c h a n i s mo fi g yl i g h tc h a i nd i v e r s i t yi nc h i c k e nd e p e n d so ng e n ec o n v e r s i o nd u r i n gb u r s ao f f a b r i c i u sm a t u r i t y , a n dt h ea f f i n i t yo fi g yf o ra n t i g e nw i l li n c r e a s et h r o u g hs o m a t i cd i v e r s i f i c a t i o n s t i m u l a t e db ya n t i g e n d u et og r e a t e rp h y l o g e n t i cd i f f e r e n c eb e t w e e na v i a na n dm a m m a l i a ns p e c i e s ，t h ei m m u n e r e s p o n s eo f c h i c k e n st om a m m a l i a np r o t e i n si ss t r o n g t h a ti st os a y ，i ti se a s yt oo b t a i ns p e c i f i ci g y f r o mc h i c k e ni m m u n i z e dw i t he v o l u t i o n a r yc o n s e r v e dm f i l n m a l i a np r o t e i n sa sa n t i g e n s 1 9 yi s t r a n s p o r t e df r o mt h es e r u mt ot h ee g gy o l ka n ds t o r e di ni t ，a n dt h e nt r a n s m i t t e dt ot h ed e v e l o p i n g e m b r y of r o me g gy o l k h i g hi m m u n i z e de g g sc a nb eo b t a i n e da f t e rs e v e r a lt i m e si m m u n i z a t i o n ，a n d t h ei g yc a l lb ee x t r a c t e da n dp u r i f i e df r o me g gy o l kw i t hb i o c h e m i c a lm e t h o d s m a n ys t u d i e sh a v e i n d i c a t e dt h a tc h i c k e nl g yh a sh i g hs p e c i f i c i t y ，w h i c ha n a l o g u e st om o u s em o n o c l o n a la n t i b o d y c h i c k e ni g yi ss t a b l ea g a i n s th e a ta n da c i d m o s to f t h ea n t i b o d ya c t i v i t yw i l lr e m a i nu n d e r7 0 。co r a tp ha b o v e4 u s i n gc h i c k e n st op r o d u c ea n t i b o d i e sb r i n g sm o r ea d v a n t a g e st h a nm a m m a l i a n ： c o l l e c t i o na n ds t o r a g eo fh i g hi m m u n i z e de g g si sv e r ys i m p i e ，a n dp r o d u c i n gl a r g e ra m o u n t so f a n t i b o d i e si se a s y i ta l s om a k e si tp o s s i b l et oe l i m i n a t et h ec o l l e c t i o no fb l o o da n dn e e d i n gw h i c h h a sa na d v a n t a g ec o n c e r n i n gt h ew e l f a r e s i n c ei ti sv e r yp o p u l a rt op r o d u c el g y t h e r ea r el g y p r o d u c t so nt h em a r k e t u s i n g1 9 yh a si t sa d v a n t a g e sb u tt h e r ea r ed i s a d v a n t a g e s ( 】) t h e r ei st o om a n yd i s e a s e si n c h i c k e n s ，p a r t i c u l a r l yt h ea v i a nb i r di n f l u e n z a , t h ed i s e a s ei n f e c t i n gb o t hp e o p l ea n da v i a n t h eh i g h d e m a n d i n gi ns a f e t yi sr e q u i r e da b o u tc h i c k e ni g y e x p e r t ss u g g e s t e dt h a ts p fc h i c k e n ss h o u l db e u s e dt op r o d u c et h ei g y i tc a n n o tb ed i f f i c u l tt 0i m a g i n et h a tt h ec o s to f i g yp r o d u c i n gw i l lb ev e r y i i i 西南大学硕士学位论文 h i g h ，r e s u l t i n gi nl a c k i n go ft h ec o m p e t i t i v e n e s si nt h ea n i m a lm e d i c i n em a r k e t s ( 2 ) al a r g e r n u m b e r so fa na n t i g e na r en e e d e dt oi m m t m i s ec h i c k e n s w h i c hw i l li m p a c to nt h ec h i c k e n s h e a l t h ( 3 1i g yi sas t r o n gi m m u n o g e na n di se a s ye l i c i t e db ya n t i - l g yi nr o a m m a l i a na n i m a l s m c c a f f e r t y ( 1 9 9 0 ) f i r s tp r o p o s e dt h ec o n s t r u c t i o no fa n t i b o d yp d tg e n e t i cl i b r a r y t h i s a p p r o a c hr e l i e so nap h a g e - d i s p l a ys y s t e mi nw h i c hf r a g m e n t so f a n t i b o d i e sa r ee x p r e s s e da sf u s i o n p r o t e i n sa n dd i s p l a y e do nt h ep h a g es u r f a c e i t i sp o s s i b l et oe n r i c hf o rr e c o m b i n a n tp h a g e e x p r e s s i n gs p e c i f i ca n t i b o d i e sb ya f f m i t ys e l e c t i o n w i t ht h i sa p p r o a c h ，t h eg e n eo fa n t i b o d i e sw i t h d e f i n e ds p e c i f i c i t ya n da f f i n i t yc a nb es e l e c t e d , a n dt h ea n t i b o d yg e n ec a nb ee x p r e s s e dw i t hh i g h e f f i c i e n ti ny e a s tc e l l sa n dc a nb eu s e dt op r o d u c ei ni n d u s t r i a l i z a t i o n i tp r o v i d e dt e c h n i c a ls u p p o r t f o rp r o d u c i n gc h i c k e nm b n o c l o n a li g y r e c o m b i n a n tp h a g ea n t i b o d yt e c h n o l o g yh a st h ep o w e ra n d v e r s a t i l i t yt om i m i ct h ef e a t u r e so fi m m u n ed i v e r s i t ya n ds e l e c t i o n p h a g ea n t i b o d yg e n e sc a nb e e a s i l ys e q u e n c e d ，m u t a t e da n ds c r e e n e dt oi m p r o v ea n t i g e nb i n d i n g w i t ht h em e t h o dw ec a n s y n t h e s i z ea n de x p r e s st h ea n t i b o d i e sa g a l n s t e da n ya n t i g e n sw i t h o u tl i m i t a t i o n t h e r e f o r e ，t h ea i m o ft h ep r e s e n ts t u d yw a st oc o n s t r u c tac h i c k e ns c f vg e n ep d tl i b r a r yb yr e c o m b i n a n tp h a g e a n t i b o d yt e c h n i q u e w h i c hw i l lp r o v i d eab a s i sf o rr a p i dd e v e l o p m e n to f n e wa n t i b o d i e s m e t h o d s ：( 1 ) ap a i ro fp d m e mw e r ed e s i g n e dw i t hr e s t r i c t i o ns i t e sf o rv ha n dv l r e s p e c t i v e l y ，r e f e r t o t h es e q u e n c e o f f r la n d f r 4o f c h i c k e n i m m u n o g l o b u l i n g e n e ，w h i c ho b t a i n e d i ng e n b a n kaf l e x i b l ep e p f l d ew i t hs e q u e n c ec o d i n g ( g l y 4 s e r ) 3w a sd e s i g n e da s t h el i n k e r ( 2 ) t h e t o t a lr n aw a se x t r a c t e df r o mi s o l a t e ds p l e e no f a8 - w e e k - o l du n i m m u n i z e dc h i c k e n ，a n dt h ee d n a f i r s tc h a i nw a ss y n t h e s i z e dw i t ho l i g o d t l 2 t 8p r i m e r t h ep r i m e r so fv ha n dv l w a sa d d e di n t ot h e e d n at e m p l a t ea n dt h es p e c i f i cf r a g m e n to fv ha n dv lw a sa m p l i f i e d ，r e s p e c t i v e l y t h ev h ，t h e l i n k e ra n dt h ev lw e r ea s s e m b l e dt 0t h ev h - l i n k e r - v lg e n eb yo v e r l a p p i n ge x t e n s i o np c i 乙t h e p r o d u c tw a ss c f vg e n e ( 3 ) t h es c f vg e n ew a sd i g e s t e dw i t hs a c ia n dn o t l ，a n dc l o n e di n t o s i m i l a r l yd i g e s t e dv e c t o rt 7 s l e e t1 0 - 3 bg e n e t h ec h i c k e ns c f vg e n el i b r a r yc o u l db eo b t a i n e da r e r t h el i g a t e dd n aw a sp a c k a g e di nv i t r o ( 4 ) t h en u m b e r o f s c f vc o n t a i n i n gc l o n e si nt h el i b r a r yw a s e s t i m a t e dt h r o u g hp l a t i n g s i xp h a g ea n t i b o d yc l o n e sw e r er a n d o m l ys e l e c t e da n di d e n t i f i e db yp c r a f t e rt h ep h a g ed n aw a se x t r a c t e d t h ep o s i t i v ec l o n e sj u d g e db yp c rw e r es e q u e n c e d ，a n dt h e s e q u e n c eo f s c f vg e n ew a ss u b m i t c e di n t oo e n h a n kt od ob l a s t h ( 5 ) t h el i b r a r yw a sp a n n e d4t i m e s b y4 k i n d so fa n t i g e n sa n dd e t e c t e db yb l o c k i n ge l i s a ( 6 ) af e wa g - b i n g i n gc l o n e sw e r e i d e n t i f i e db yd n as e q u e n c i n g ( 7 ) t h es p e c i f i cs c f vg e n ew a si n s e r t e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o r p e t 2 8 b ( + ) ，a n dt r a n s f o r m e di n t oe c o l is t r a i nt u n e r t h er e c o m b i n a n tg e n ee x p r e s s i o nw a si n d u c e d b yt h ea d d i t i o no fi p t g t h ee x p r e s s e ds p e c i f i ca n t i b o d yw a sd e t e c t e db yc o m p e t i t i v eb i n d i n g i n h i b i t i o ne l i s aa s s a ya f t e rp n r i f i c a t i o n r e s u l t s ：( 1 ) ap h a g ed i s p l a yl i b r a r yo f4 5 x1 0 。c l o n e se x p r e s s i n gt h ec h i c k e nl g yl i g h t c h a i nv a r i a b l er e g i o n ( s c v l ) w a sc o n s t r u c t e d t h es i z eo fi n s e r ts e v li sa b o u t4 5 0 b p ( 2 ) t h e s e q u e n c i n gd a t as h o w e dt h a tt h el i b r a r yi sat r u n c a t e dl i b r a r y , a n dt h ef o r e i g ng e n ec o n t a i n sa c h i c k e nv l g e n e ，t h el i n k e r , t h eh 5p r i m e ra n da nu n k n o w ns e q u e n c eb u tn ov hg a n e ( 3 ) a f t e rt h e i v l i b r a r yw a sp a n e df o u rr o u n d sa g a i n s ta i va n dg p va n t i g e n ，t h ep h a g e d i s p l a y e da n t i b o d i e sw e r e e n r i c h e db y1 6 3 9a n d6 1t i m e sr e s p e c t i v e l y ( 4 ) b l o c k i n ge l i s ad a t ac o n f i r m e dt h a tt h eb l o c k i n g r a t eo fa n t i - a i vp h a g ea n t i b o d yi s17 6 a n dt h eb l o c k i n gr a t eo fa n t i - g p vp h a g ea n t i b o d yi s 1 4 6 ( 5 ) i s o l a t e da n t i g p va n t i b o d yg o n ef r o ml i b r a r yw a se x p r e s s e db yec o l it u n e r ，a n dal a r g e a m o u n to fs o l u b l ea n t i b o d i e sw a sp r o d u c e d t h ei n h i b i t i o nc a p a c i t yo f t h es o l u b l ea n t i b o d i e si so v e r 2 8 d e t e c t e db yc o m p e t i t i v eb i n d i n gi n h i b i t i o ne l i s aa s s a y t h er e s u l t so b t a i n e dh e r es u g g e s tt h a t c h i c k e ns c v lh a v ea g - a f f i n i t ya n dc o u l db i n dt ov i r u s c o n c l u s i o n ：t h es i l l d yh a so b t a i n e dac h i c k e ni g vs e v lg e n ep d tl i b r a r y , a n df r o mw h i c h w es u c c e s s f u l l ys c r e e n e dt 7m c o m b i n a n t sw i t ha n t i - a i va n da n t i - g p vs c v lg o n e k e yw o r d s ：c h i c k e ni g y v a r i a b l ef i g h tc h a i n p h a g ed i s p l a y g o n e l i b r a r y v 独创性声明 学位论文题目： 整! g 羔整鲑豆变区( 墨! y ) 基固! z 里旦! 塞庄的掏建 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：糯签字日期：2 0 0 6 年6 月1 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：糯 签字日期：2 0 0 6 年6 月1 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：箩 签字日期：2 0 0 6 年6 月1 日 邮编： 第1 章文献综述 抗体( a n t i b o d y ，a b ) 分子是由抗原( a m i g e n ，a g ) 诱导机体产生的并与a g 发生特 异性反应的免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ，i g ) 。i g 是一种多功能域( d o m a i n ) 蛋白，是最复 杂的分子之一。a b 分子作为机体防卫系统的重要组成部分，以特有的基因结构和重排形成多 样性，高亲和力高分辨率地与各种不同的抗原特异性结合，为机体有效清除不利抗原物提供 了保障。 大规模生产抗体技术经历了三个发展阶段。第一代抗血清为多克隆抗体u 1 ( p o l y c l o n a l a n t i b o d v ，p a b ) 。早在1 8 9 0 年，德国人e a d o l f v o nb e h r i n g 等用白喉外毒素以非致死剂量注 射动物后，得到的动物血清具有中和白喉外毒素的作用，称为抗毒素( a n t i t o x i n ) 。从这些动 物分离获得的血清经注射转移可以保护未被免疫的动物，即被动免疫( p a s s i v ei m m u n i z a t i o n ) 。 抗毒素后来被称为抗体。以后，溶血素等相继被发现，e a d o l f v o nb e h r i n g 抗毒素治疗方法在 医学临床上广泛应用。e ：a d o l f v o nb e h r i n g 在1 9 9 0 年获得了首届诺贝尔生理和医学奖。第二 代抗体为单克隆抗体( m o n o c l o n a la n t i b o d y ，m a b ) ，是上世纪7 0 年代中期由德国学者k o h l e r 和英国学者m i l s t e i n l 2 1 利用细胞融合技术首次成功地制各出了第一株m a b ，它在疾病的诊断、 治疗、预防和蛋白质的提纯等方面发挥了重要作用。m a b 制备方法须将鼠源性分泌抗体的b 细胞与骨髓瘤细胞融合，经过复杂的筛选过程获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。这一方 法操作烦琐，且获得的鼠源性抗体在人体内应用后可能产生严重的副作用，在临床应用上有 一定的局限性。1 9 8 4 年国外首次报道人鼠嵌合抗体p l 在骨髓瘤细胞中成功表达，开创了基因 工程抗体技术，标志着第3 代抗体基因工程抗体的诞生。基因工程抗体包括三种，即嵌 合抗体，改形抗体和抗体库技术制备的抗体。其中前两者为部分人源化抗体，抗体库技术可 以制备出属全人源化抗体，即用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来， 重组到原核表达载体，通过在大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，筛选特异性的可变 区基因。 k i i p f i y a n o v ( 1 9 9 9 ) 1 4 成功地研究出重组抗体的生产方法，即噬菌体展示技术( p h a g ed i s p l a y t e c h n o l o g y ，p d t ) 。p d t 是将抗体蛋白以融合蛋白形式展示在噬菌体的表面。由于展示的抗 体仍然保持着抗原结合活性，因此可以通过固相免疫亲和层析( h n m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ) 【5 】筛选富集并表达特异性抗体的重组噬菌体。重组噬菌体技术能有效的模仿 免疫多样性和选择性，能很容易的通过测序、突变和筛选来提高抗原的结合力。从而利用细菌 来代替动物免疫和杂交瘤制备，无限量的合成和表达抗体分子【o j 。 1 噬菌体展示技术 1 1 噬菌体展示技术( p d t ) 的原理 s m i t h 等( 1 9 8 5 ) 【7 1 首次报道了将e c o r i 酶切基因克隆到丝状噬菌体f d 外壳蛋白基因 中，与外壳蛋白融合表达并展示在噬菌体表面上，宣告了p d t 的诞生。p d t l 8 j 是以噬菌体 核酸为载体，将外源基因插入噬菌体衣壳蛋白基因中，编码多肽的d n a 片段与噬菌体表面蛋 白的编码基冈融合后，以融合蛋白的形式在噬菌体的表面表达出多肽序列。p d t 不但可以i i 西南大学硕士学位论文 来筛选针对几乎任何靶标的亲和性多肽，而且能够用来分析蛋白质间相互作用。其优点是： 外源多肽或蛋白被展示于噬菌体表面，具有空间上的可接近性；噬菌体农壳内具有外渊多肽 或蛋白的编码序列，由此建立了表型和基因型的物理联系，可进行大规模的有效筛选研。 1 2 噬菌体展示系统( p h a g ed is p i a ys y s t e m ，p d s ) p d t 载体可分为丝状噬菌体、 噬菌体、t 4 噬菌体及t 7 s e l e c t 噬菌体四种系统，各有优 势和缺点。 1 2 1 丝状噬菌体展示系统 丝状噬菌体属于单链d n a 病毒，其基因组为闭合环状的单股正链d n a ( s s d n a ) 。丝状 噬菌体主要包括m 1 3 、f d 和f l 丝状噬菌体三种。这类嘴菌体只能通过大肠杆菌的性菌毛才能 将其d n a 注入细菌，因此它只感染含有f 因子的雄性大肠杆菌。丝状噬菌体呈长丝状，外壳 蛋白围绕基因组呈规则螺旋排列，其基因组由约64 0 0 个脱氧核苷酸组成，但丝状噬菌体的长 度可以随插入d n a 片段大小的不同而发生变化。基因组共1 0 个基因，编码1 0 种蛋白质，这 些蛋白在分子量与拷贝数上有很大差别。5 个衣壳蛋白( p i 、p v i 、p 、p 、p i x ) ，3 个 是合成d n a 所必需的( p i i 、p v 、p x ) ，2 个组装蛋白( p i 、p i v ) 。在电镜下，噬菌体颗 粒呈细长、易弯曲的管状，由约27 0 0 个拷贝的p w 蛋白包装它的正链d n a 。在管形的一端是 衣壳蛋白p i i i 、p ，另一端是p v i i 、p i x 、e i i i 蛋白是噬菌体感染所必需的。e i i i 、p v i 蛋白对于 噬菌体的稳定性很重要，而p v l i 、p i x 是噬菌体包装所必需的l l 。 ( 1 ) p i 基因编码病毒次要外壳尾丝蛋白，每个病毒颗粒有4 - 5 个拷贝。p i i i 区有两个位 点可供外源基因片段插入，即g 基因氨基端( n 端) 或近n 端可屈伸臂区内，表达的融合蛋 白在辅助病毒超感染后，与野生性g p l i i 蛋白一起竞争性地组装至9 噬菌体表面，形成“杂合” 噬菌体。目前主要应用于抗体库的构建、生物大分子的表达和功能分析等方面研究。 ( 2 ) p w 及其它展示系统p 基因编码丝状噬菌体主要农壳蛋白，每个病毒颗粒约有2 7 0 0 个拷贝。扩的n 端可融合表达短肽，而较长的肽链则因形成空间障碍而影响噬菌体装配， 使其失去感染力，但有辅助噬菌体援救时，可通过提供野生型妒蛋白，降低重组农壳蛋白 拷贝，因此可融合较大的多肽甚至抗体片段。由于扩的拷贝数多，该系统一般用于筛选亲 和力较低的抗体。 1 2 2x 噬菌体展示系统1 噬菌体展示系统是将外源序列插入噬菌体主要尾部蛋白p v c 端折叠区( 非功能区) ， 或噬菌体头部组装必需的d 蛋白n 端或c 端，实现外源蛋白的表面展示。根据其融合位点不 同，可分为n 端展示和c 端展示两套系统”“。x 噬菌体与丝状噬菌体不同，无需e c o l i 的分 泌系统，其病毒颗粒是在宿主细胞内完成装配，通过裂解宿主菌而释放，可用来展示有活性的 大分子蛋白( 1 0 0 k d 以上蛋白) 及对宿主细胞有毒性的蛋白，适用范围极广。 1 2 3t 4 噬菌体展示系统 t 4 噬菌体展示系统 1 3 j ( h o n ga n db l a c k ，1 9 9 3 ) 是将外源肽，蛋白质与t 4 噬菌体的d , ，l - 衣 2 第】章文献综述 壳蛋白( s m a l lo u t e r c a p s i d p r o t e i n ，s o c ) c 端融合而被展示。s o c 是一个分子最为9 k d 的小 蛋白，是t 4 衣壳组装非必需的。而且，不论在体内还是体外，它都具有与成熟衣壳表面特定 位点( 主要衣壳蛋白g p 2 3 ) 高亲和力的专一结合能力。t 4 噬菌体与x 噬菌体相同，是在宿主 细胞内组装而不需要通过分泌途径，因而其表面展示多肽和蛋白的范围广，尤其适用于研究那 些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质。t 4 噬菌体展示系统容量大( 3 5 k d 以上蛋白质) 、拷贝 数高，在分析抗原表位、细胞因子、受体等方面有相当大的应用潜力。 1 2 4t 7 s e i e c t 噬菌体展示系统”4 1 ”1 t 7 s e l e c t 噬菌体展示系统是n o v a g e n 公司基于t 7 噬菌体开发的一种新型的展示系统，t 7 噬菌体为双