四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备.ppt

,第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备,第一节杂交瘤技术的基本原理一、杂交瘤技术二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存,第二节单克隆抗体的制备一、单克隆抗体的产生二、单克隆抗体的纯化三、单克隆抗体的性质鉴定四、单克隆抗体的特性,第三节基因工程抗体制备一、人源化抗体二、小分子抗体三、抗体融合蛋白四、双特异性抗体五、噬菌体抗体库技术,第四节单克隆抗体的应用一、检验医学诊断试剂二、蛋白质的提纯三、小分子抗体的应用四、抗体融合蛋白的应用五、双特异抗体的应用六、抗体库技术的应用和前景,思考题小结,第一节杂交瘤技术的基本原理,杂交瘤技术原理：聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗体,抗体种类：第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody),B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单克隆抗体,流程,一、杂交瘤技术,不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同,（一）小鼠骨髓瘤细胞,动物：BALB/c小鼠712周龄20g25g体重,（二）免疫脾细胞,细胞性抗原：（12）107/只，不加佐剂，23周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加强免疫,免疫小鼠,。,淋巴细胞,。,淋巴细胞发育,。,浆细胞,。,抗原接种,培养液：RPM1640培养液DMEM培养液,（三）细胞融合,细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同,培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80或液氮及干冰中,免疫脾细胞的制备：1108的淋巴细胞无菌手术,饲养细胞：细胞密度过低不利于细胞生长繁殖常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞其中MQ还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化,。,饲养细胞,骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3)50%PEG1min内加完;2min内加10ml培养液,融合方法,SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：251ml50%的PEG（无菌，预温37）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.51.5）105个。融合后7天，换用HT培养液,细胞融合,1020天出现克隆HAT筛选挑克隆,融合细胞的早期培养,HGPRT酶与TK酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶,（四）杂交瘤细胞的选择性培养,应用液：8-杂氮鸟嘌呤聚乙二醇,HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA,HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，57天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，57天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻,SP2/O:HGPRT-，TK-;长命脾细胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)杂交瘤细胞:HGPRT+，TK+;长命,骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞,杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力,有限稀释法(limitingdilution)显微操作法(micromanipulation)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法(softagarmethod),二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存,特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含0.51个细胞,有限稀释法,效率最高价格昂贵,FACS,配制方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml)+细胞冻存液(30%40%牛血清，50%60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻，30-70液氮“快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复苏,杂交瘤细胞的冻存与复苏,防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡,细胞冷冻的意义,第二节单克隆抗体的制备,经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。,一、单克隆抗体的产生,动物体内诱生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（510）105/只体外培养法：中空纤维培养系统单抗含量不高，牛血清Ab难以去除,腹腔注射法,前5天进行,预先腹腔注射pristane（15）106细胞13w形成腹水,高滴度腹水,可溶性抗原：ELISA抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）,二、单克隆抗体的纯化,ELISA,ELISA,多头加样枪,。,免疫荧光法,盐析沉淀亲和层析离子交换层析,McAb的纯化,Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物的交叉反应效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞争抑制法，相加指数法及微机集群分析亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条McAb靶抗原分子量：常用westernblot,三、单克隆抗体的性质鉴定,四、单克隆抗体的特性,高度特异性高度的均一性和可重复性弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性,（一）单克隆抗体的特性,优点：在体外“永久”地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗,（二）单克隆抗体的优点与局限性,局限性：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高,McAbPcAb抗原要求可以不纯纯度高得量高低特异性高低稳定低高沉淀反应无有成本高低,McAb与PcAb的比较,McAbandPcAb,第三节基因工程抗体制备,基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。,将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体,一、人源化抗体,方法：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力,（一）嵌合抗体,嵌合抗体,定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗,（二）改型抗体,Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段SdAb：单区抗体,二、小分子抗体,小分子抗体,其它生物活性蛋白融合,三、抗体融合蛋白,许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。,四、双特异性抗体,分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。,化学交联BsAb,将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤(quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应(HAMA)，因此不适用于临床。,细胞工程BsAb,多采用抗体分子片段,如Fab，Fv或ScFv,经基因操作修饰后,或体外组装为BsAb,或直接表达分泌型的BsAb。,基因工程BsAb,定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性,五、噬菌体抗体库技术,用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人,（一）基本原理和程序,噬菌体抗体库,从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA；应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surfacedisplayantibodylibrary)常用载体；表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。,构建噬菌体抗体库,模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA通用引物具有人的种属普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性,（二）噬菌体抗体库技术的特点,避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体,第四节单克隆抗体的应用,检验医学诊断试剂蛋白质的提纯小分子抗体的应用抗体融合蛋白的应用双特异抗体的应用抗体库技术的应用和前景,病原微生物抗原、抗体的检测肿瘤抗原的检测免疫细胞及其亚群的的检测激素测定细胞因子的测定,一、检验医学诊断试剂,病原体测定：肝炎病毒HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒，单纯疱疹病毒,细胞表面CD测定：CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型,激素的测定：内分泌疾病的诊断,药物测定(TDM)：抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛,研究工作中的探针：越来越多未知功能cDNA的克隆对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加,免疫沉淀,二、蛋白质的提纯,单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。,MACS,定义：分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段优点：分子量小,穿透性强,抗原性低不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不良反应少可在原核系统表达及易于基因工程操作半衰期短，有利于及时中和及清除毒素,三、小分子抗体的应用,应用：用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗细胞内抗体：在细胞内表达特异性识别某一基因产物可干扰该基因产物的生物活性研究基因结构与功能的关系,肿瘤的体内显像诊断单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布指数较完整抗体分子高放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，显像的本底较低理想的显像定位诊断载体病毒的诊断和抗病毒感染血液性疾病的诊断白血病的免疫诊断及分型,四、抗体融合蛋白的应用,在体外免疫检测中的应用自身红细胞凝集试验快速检测HBV和HIV病原体等避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫检测的敏感度用双特异抗体作为二抗，检测限达1ng/ml,五、双特异抗体的应用,在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用方法：双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半抗原螯合剂，后者可选择性地与放射性核素结合，利用二次导向系统显示特点：更高的的灵敏度和清晰度,在体内免疫治疗中的应用抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内运输和药代动力学,六、抗体库技术的应用和前景,在肿瘤