（动物学专业论文）聚合血红蛋白的稳定性研究.pdf

中文摘要 血红蛋白是红细胞中具有载氧功能的蛋白。聚合血红蛋白( p o l y h b ) 是由血红蛋 白用多官能团交联剂聚合而得的。p o l y m 是经过病毒灭活的，因而可避免常规临床 输血相关的疾病传播和异型输血反应。此外，聚合血红蛋白以过期或废弃的血液为 原料，减少血源浪费、缓解血液紧张。因此，p o l y h b 成为一类重要的红细胞代用品。 稳定性是聚合血红蛋白作为红细胞代用品的一个重要指标，因此本论文着重研究了 聚合血红蛋白稳定性。同时制备了各项指标合格的纯化血红蛋白，建立了以血红蛋 白为基础的红细胞代用品p 5 0 的测定方法。 对人脐带血纯化血红蛋白及其聚合血红蛋白用改进后的氧合曲线测定方法进行 研究。结果表明：氧合曲线呈s 形，纯化血红蛋白样品的p 5 0 为( 7 1 7 士0 0 7 ) m m h g ， 5 磷酸毗眵醛( p l p ) 修饰的聚合血红蛋白的p 5 0 为( 2 0 5 0 士o 2 5 ) m m h g 。 以p h 、血红蛋白与硼氢化钠的摩尔比、聚合时间对戊二醛聚合血红蛋白稳定性 进行三因素三水平正交试验。结果表明：各组分予量分布在前两个月都有定变化， 到第三个月时分予量分布都趋于一致。其中p h 为9 3 、聚合时间为2 h 、血红蛋白与 硼氢化钠的摩尔比为l ：1 5 的实验组分子量分布变化为最稳定。 关键词：血红蛋白聚合血红蛋白稳定性分予量分布 a b s t r a c t h 锄。百o b i n i sa no x y g e i l c a 力矶n gp r o t e i l li l lr e db l o o dc e l l s p o l y m e r i z e d h 锄。酉o b i i l( p o l y h b ) i sd 耐v e df - m m h e m o g l o b i nb y m u l t i m n c t i o n a l g r 0 1 l p c r o s s l i i l l ( i n ga g e n t p o l y h bh 鹪b e 吼v i m si i l a c t i v a t e d ，也u si tc 觚a v o i dt l l e 印i d e i i l i c s p r e a d i n g 锄dn l eh e t e r o t y p i c 仃a l n s m s i o nr c a c t i o nc a u s e db yt l l er o u t i n cc l i l l i c a l t r a n s f h s i o n ha d d i t i o 玛p o l y i n e r i z e dh e m o g l o b i nu s e sn l ee x p i i i c do r0 b s o l 酏eb l o o d 嬲 m e r t i a l s ，s o 鹬t 0r e d u c e 吐1 eb l o o dw 鄱t a g e 狮de 嬲et h eb l o o ds o u r c es 仃a i n t h e r e f 0 r e ， p o l y 量玷b e c o m e s 趾i i n p o r t a n tr e db 1 0 0 dc e us u b s t i t i l t e s t a b i l i t ) ro ft h ep o l y m e 比e d k ；m o g l o b i ni sa ni m p o r t a mi i l d i c a t o r 硒ar e db l o o dc e l ls l l b s t i t u t e ，c o n s e q u e i l t l y ，t l l i s t l l c s i sw a s 舭u s e d0 n 也es 协b i l i t yo fp o l y i i l e r i z e d h e m o g l o b i n m e a l l w 恤l e ，吐l ep 嘶f i e d h e i n o g l o b i i io fq u a l i f ；i e dq u a l 毋w 觞o b t a i l l e da n dt h ed e t e m i i n 撕o no fp 5 0f o rt h e r e dc e l l s u b s t i n n eb a s e do nh e m o 酉o b i nw 镐e s t a b l i s h e d t h ei m p r o v e dd e t 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图书馆可以采用数字化或其它手段保存论文； 因某种特殊原因需要延迟发布学位论文，按学位论文保密规定处理，保 密论文在解密后遵守此规定。 敝作者躲酪墙燧名： 日期：矽口一妨；1 日 1 1 血红蛋白 1 1 1 血红蛋白的结构 第一章综述 血红蛋白是红细胞中具有载氧功能的蛋白，呈球形结构，分子量为6 4 5 l 。经 过p e m t z 等人的多年研究，目前对血红蛋白的结构和功能已经有了较为透彻的了解。 血红蛋白由四条多肽链( 亚基) 组成，它们以非共价键相互作用结合在一起。人全 血中主要成分为血红蛋白a ，结构为叱p 1 2 ，其中a 链含有1 4 1 个氨基酸残基，而p 链含1 4 6 个氨基酸残基，伍链和p 链以较紧密的方式结合成二聚体，2 个仅p 二聚体 以较为松散的结合方式形成了血红蛋白分子。 1 1 2 血红蛋白的生理功能 血红蛋白在体内的丰要功能是运送氧气，部分二氧化碳和氢离子。四个亚基中 每一条链都含有一个可以以可逆方式结合氧的血红素辅基。一个h b 四聚体共可以 结合四个氧分子。四个血红素的位置处于贴近分子表面的裂隙内，除了两个组氨酸 残基外，围绕血红素的几乎都是非极性残基。血红素中的铁原予在血红素的平面中 心和原卟啉环的四个氮原予结合，在血红素平面的两侧，铁原予还能形成两个结合 键，这称为第五和第六配位。血红素中铁原予的第五配位键和位于血红素平面一侧 f 8 组氨酸残基( 在仅链中是8 7 位h i s ，在b 链是9 2 位h i s ) 结合，这f 8 h i s 就是 近心h i s 。另一组氨基酸残基e 7 h i s ( 在a 链是5 8 位h i s 在b 链是6 7 位h i s ) 处于血 红素平面的另一侧铁原予的第六配位附近，即远心h i s ，e 7 h i s 并没有和铁原予结合， e 7 h i s 和铁原了之间的空隙就是氧气结合的位置，在脱氧血红蛋白相应位置空着， 0 2 能扩散进入到此空间，结合到铁原了的第六配位，而e 7 h i s 则与氧气可通过氢键 相连。血红蛋白中的血红素铁，可以有f c 2 + 和f e 3 + ，只有f e 2 + 才能结合氧，以f e 3 + 存在的血红蛋白称为高铁血红蛋白( m 甜 b ) ，无结合0 2 的功能。血红蛋白分孑中各 个结合0 2 的位点之间有协同作用，一个亚基上结合0 2 后能促进这个四聚体的其余 亚基与0 2 的结合，反之，氧合血红蛋白的一个亚基释放的0 2 能促进其余亚基释放 出0 2 ，这种协同效应称为希尔效应。在成熟的红细胞中氧合血红蛋白的相互作用可 以用氧解离曲线( 又称氧合曲线) 来描述，在标准条件下，总血红蛋白饱和度为5 0 时的氧分压为p 5 0 。在正常生理条件下，全血p 5 0 大约为2 6 t o r r 。当血红蛋白的氧亲 和力上升使氧分子难以从血红蛋白上解离时，氧合曲线左移且p 5 0 下降，即5 0 血 红蛋白被氧饱和所需要的氧气减少，但氧气更难从血红蛋白上解离。若血红蛋白的 氧亲和力下降且氧气能更快的从血红蛋白上解离时，氧合曲线向右移，饱和5 0 血 红蛋白所需的氧气增加。 1 1 3 血红蛋白氧亲和力的调控 血红蛋白的氧亲和力受到多种因素影响，如p h 、c 0 2 浓度和细胞内分子2 ，3 d p g 调控作用等。随着p h 的降低，血红蛋白的氧亲和力降低，氧合曲线右移，这种变 化称为“波尔效应”。p h 的降低有利于向运动组织传递氧。c 0 2 也可以与血红蛋白结 合并通过取代血红蛋白上的氧使其的氧亲和力下降及氧合曲线的右移。血红蛋白不 仅是0 2 的载体，同样也是c 0 2 的载体，在运输c 0 2 过程中起着重要的作用。c 0 2 与血红蛋白的n 末端氨基反应生成氨基甲酸血红蛋白，红细胞周围介质中的c 0 2 分压( p c 0 2 ) 对血红蛋白的氧亲和力有影响，p c 0 2 的增加，氧亲和力下降，氧合 曲线右移，这一生理现象是波尔效应的一种形式。另外，由于血红蛋白结合旷的能 力比氧合血红蛋白强，血红蛋白结合氧会导致h + 的释放，使血液的p h 降低，即 h + 的浓度增加，也会使血红蛋白的氧亲和力下降，这一现象是波尔效应的另外一种 形式。 波尔效应有下列的牛理意义：当血液流经组织时，由于组织比血液的p h 低， c 0 2 分压高，因而有利于氧合血红蛋白分了释放0 2 ，使组织能比单纯的0 2 分压下 降时获得更多的0 2 ；同时0 2 的释放又促进脱氧血红蛋白分了与h + 、c 0 2 的结合。 当血液流经肺部时，由于肺气泡的0 2 分压较高，促使脱氧血红蛋白分了释放h + 、 c 0 2 。 2 2 ，3 二磷酸甘油酸( 2 ，3 d p g ) 能够显著影响血红蛋白的氧亲和力，它在人体和 其他许多动物的红细胞中存在，浓度大约与血红蛋白相同( 和5 伽n o l l ) 。在没有 2 ，3 d p g 存在时，血红蛋白对氧的亲和力很高，p 5 0 很低。相反，有2 ，3 d p g 存在时， 血红蛋白对氧的亲和力大为降低，氧合曲线右移，p 5 0 升高。2 ，3 d p g 是一个高极性 分子，分予量并不大，却带有5 个负电荷，是代谢中间物中一个少有的荷电密度高 的分子，它与血红蛋白以l ：l 的比例结合，结合于血红蛋白分子轴对称的中心空穴， 正好填满原有的空隙。2 ，3 一d p g 是通过和与脱氧血红蛋白的结合来影响血红蛋白的 氧亲和力的。血红蛋白处于氧合状态时，两条p 链的h 螺旋相互接近，以至中心空 穴变小，排斥2 ，3 d p g ，从而降低了2 ，3 d p g 分子通过盐健连接两条d 链，并以此 稳定脱氧血红蛋白的四聚体结构于紧张态( t 态) 。血红蛋白氧合过程的协同效应 是通过别构现象来表达的，2 ，3 d p g 影响血红蛋白的构象，使血红蛋白趋向于紧张 态( t 态) ，降低对0 2 的亲和力。 p e n n z 等比较了牛血红蛋白和人血红蛋白的分子结构，提出c l 对血红蛋白作用 的机理。他认为c l 。对哺乳动物血红蛋白作用的机理是相同的，c l 。降低哺乳动物血 红蛋白氧亲和力的原因是中和了血红蛋白中心空穴处过量的正电荷，降低了静电排 斥，进而稳定了血红蛋白的脱氧态( t 态) 。中心空穴处过量的正电荷的静电排斥增 加了t 态血红蛋白的自由能，从而增加了血红蛋白氧亲和力；相反，进入中心空穴 处的c l 。降低了t 态血红蛋白的自由能，因此降低了血红蛋白的氧亲和力。由于血 红蛋白在红细胞中不会施加额外的渗透压，所以红细胞中血红蛋白的浓度可达 3 5 d l ( 在全血中为1 4 d 1 ) ；在红细胞膜的保护下，血红蛋白的寿命一般1 2 0 天左 右。【l 】 1 2 红细胞代用品研究概况 据2 0 0 2 年统计，全世界每年献血量超过7 亿5 千万单位，世界卫牛组织( 共1 9 1 个成员国) 仅有4 3 个对献血者进行了乙肝病毒( h b v ) 、丙肝病毒( h c v ) 和艾滋病病 毒( h ) 检测。不安全的输血或注射每年导致8 1 6 万人感染h b v ，2 3 4 7 万人感染 h c v ，8 1 6 万人感染h i v 【2 1 。此外，需血量增多和献血量减少的矛盾、错误输血导致 溶血甚至死亡、人类红细胞储存时间短以及自然灾难和战争等原因迫使人们去寻找 一种能代替血液的用品红细胞代用品。 理想的红细胞代用品除了具有携氧能力外，还应具备以下特点【卜5 j ：a 在氧和 二氧化碳的运送能力上与天然血红蛋白相似；b 无抗原性，无需交叉配血或相容性 检验；c 循环中能存活较长时间；d 能维持动脉血压；e 安全；f 室温下保持稳定， 能长期储存；g 无毒，不产生毒性代谢物；h 能进行灭菌处理，不含病原体。 目前在全世界范围内得到广泛研究的红细胞代用品主要有两大类，即：( 1 ) 全氟 碳化合物类红细胞代用品，( 2 ) 血红蛋白类红细胞代用品。 1 2 1 全氟碳化合物( p f c ) 类红细胞代用品 全氟碳化合物是一类完全由化学合成的具有溶解氧功能的惰性物质，因为氟碳 化合物不溶于水，所以需要经过乳化变为乳剂。6 0 年代c l a r k 和g o l l 一6 】发现小鼠 能够在溶解氧的硅油或液态氟碳物化合物中呼吸。同年，c h a n g 【7 】发现用硅橡胶材料 成膜的人工细胞在血液循环中会很快被除去。1 9 6 7 年s o l v i t e r 和k 锄i m o t o 【8 】用乳化 过的氟碳化合物对小鼠进行灌流，发现可以维持小鼠的心脏功能达数小时。 g e y m o n r o e 和t a y l o r 于1 9 6 8 年用氟碳乳剂将小鼠的血液完全置换，结果小 鼠复苏并长期存活。p f c 的优点是可以直接用化学方法合成，价格低廉，而且不受 生物来源的影响，避免因异体输血而造成的交叉感染，同时适用于因为宗教原因不 能输血的病人，是一种很有前途的红细胞代用品。其缺点是氧气在氟碳化合物中只 是单纯的物理溶解，而且在肺泡中正常的氧分压下p f c 的氧溶解量远低于人全血， 所以在输注时必须同时呼吸9 5 以上的高纯氧，提高氧分压来增加p f c 中的氧溶解 度，这样会造成肺组织损伤，不利于紧急救护。另方面，p f c 化学性质极为稳定， 在体内代谢极为缓慢，例如全氟叔丁胺在网状内皮系统( i 违c ) 中的半衰期( t t ，2 ) 长达 8 0 0 天以上。除了一小部分由呼吸系统排出体外，大部分要被r e c 摄取，可能造成 病人的长期免疫力低下。 1 9 7 8 年n a t i o 等【9 】首次将第一代氟碳化合物产品f l u s 0 1 d a 2 0 t m 用于临床试 验。该产品是将全氟萘烷与全氟叔丁胺以7 ：3 混合，然后加入卵磷脂而成的2 0 ( v v ) 乳液。其平均粒径为0 1 1 8 微米，t l 陀达7 2 天，1 9 8 9 年被f 【埴批准在美国用于冠 状动脉术后灌流【1 0 1 。f l u s 0 1 d a 2 0 t m 的临床试验取得了一定的结果，但也有一些缺 点如：携氧能力低、形成的乳剂稳定性较差，而且组分中的全氟叔丁胺的体内半衰 期( t l ，2 ) 长达6 4 7 天，所以临床应用比较有限。 a l l i a n c e 制药公司研制的o x y g e n 。m 是以蛋黄卵磷脂为主要原料的第二代全氟碳 化合物。其使用浓度达到了6 0 ( w v ) ，相当于1 5 d l 的血红蛋白的载氧量。因此较 第一代产品，浓度更高，携氧能力更强，更加稳定，而且体内代谢效率更高，可有 效地避免补体激活。现在已进入i i 期临床试验阶段，未发现明显的临床副作用。但 当输入量达到1 8 班g 时，部分病人可能会在输入后的4 小时至1 4 小时出现低烧， 发冷以及恶心等类似流感的症状。所以国际上一般把1 8 k g 作为临床最高安全用 量，且很少使用。 1 2 2 血红蛋白类( h b ) 红细胞代用品 血红蛋白类红细胞代用品是以血红蛋白为基础的具有载氧功能的生物药物。血 红蛋白类红细胞代用品可分为三类，即以人血为基础的红细胞代用品、以动物血为 基础的红细胞代用品及以基因重组血红蛋白为基础的红细胞代用品。 l 以人血为基础的红细胞代用品 ( 1 ) 以成人外周血为基础的红细胞代用品 n o n h f i e l d 公司一直从事戊二醛聚合磷酸吡哆醛化人血红蛋白方面的研究。其主 要产品p o ly _ h e m e 在制备过程中除去了大部分未聚合的血红蛋白( 四聚体及以下血红 蛋白浓度低于1 ) 。这不但有效地避免了未分予内聚合的血红蛋白在体内迅速离 解成二聚体而引起的。肾毒性，同时消除了由于游离血红蛋白强烈结合毛细血管中 n o 引起的血管收缩、血压升高及胃肠反应等临床副作用。浓度为1 4 0 l 的p o l y h e m e 胶体渗透压为2 0 一2 5 m m h g ，p 5 0 为2 8 3 0 m m h g ，均与全血指标相近。狒狒的换血试 验表明，血红蛋白浓度和血液动力学特征在置换前后基本保持不变，平均动脉压无 明显升高。g o u l d 等针对外伤和紧急外科于术病人进行i 期临床试验，在输入2 单 位聚合血红蛋白后，受试者没有出现明显的临床副作用，心、肾及其他器官功能正 常，无血管收缩和胃肠反应。目前，该产品已完成i i i 期临床试验。f l l 】 加拿大的生物技术公司h e m o s 0 i 公司主要进行开环棉籽糖聚合人血红蛋白方面 的研究，产品名称为h 锄o l i n k t m 。棉籽糖经高碘酸氧化开环，得到含有6 个醛基的 产物开环棉籽糖( o r a m n o s e ) 。开环棉籽糖的醛基与血红蛋白上的2 ，3 d p g 结合 空穴中的氨基发生特异反应，把0 【p 亚基交联起来，最终生成约4 0 的分子内交联 ( 6 4 k d ) 和6 0 分子间聚合( 1 2 8k d 6 0 0 k d ) 的交联混合物。h 锄o s o l 开发的血红蛋白 氧载体( h b o c ) 在i i i 期临床试验研究中达到其预期疗效，但由于临床研究中的副作 用只能暂停。【1 2 】 1 9 7 9 年w a l d 一1 3 】等用双延胡索酸酯( 3 ，5 二溴代水杨基) 作为交联剂，将血红 蛋白分子的2 个a 亚基交联。b a ) 【t e r 公司对这类交联剂进行了广泛的研究，并将其 产品称为h e i i a s s i s t ，又称为双阿司匹林交联血红蛋白。1 9 8 5 年美国军方开始与该 公司合作研究双阿司匹林交联血红蛋白d c l h b 。虽然d c l h b 成为第一例被f d a 批准进行i i i 期临床试验的红细胞代用品，但是患者出现皮肤黄染、无症状血尿、肠 梗阻发生率显著高于对照组、c p k 及血压显著升高、再输入异体红细胞的人数显著 高于对照组等症状，从而导致死亡率增加，因而于1 9 9 9 年终止临床试验。【1 4 l ( 2 ) 以人胎盘血为基础的红细胞代用品 目前国际上只有中国天津协和生物科技发展有限公司研究所对以人胎盘血为 基础的红细胞代用品进行研究。杨成民教授从事牛物医学工程、输血医学和药学研 究已有四十多年。杨教授在我国首先对“人造血携氧药物”进行研究，在技术上取得 重大突破，试品质量己达到国内外同类产品文献报告水平，目前进入中试阶段。【l 卜 2 l 】 2 以动物血为基础的红细胞代用品 ( 1 )以牛血为基础的红细胞代用品 聚合牛血红蛋白因其来源广泛，而且无需2 ，3 d p g 类似物的修饰时p 5 0 值即可 接近2 6 m m h g ，因此成为各国科学家研究开发的丰要对象。 1 9 9 1 年，b i o p u r e 公司的戊二醛聚合牛血红蛋白产品h e m o p u r e ( h b o c - 2 0 1 ) 经 f d a 的批准开始进行i 期临床试验。1 9 9 8 年1 月，f d a 批准该公司研制的兽用红 细胞代用品上市。2 0 0 1 年4 月，b i o p u r e 公司研制的红细胞代用品获准在南非上市， 6 成为第一个上市的用于人体治疗的红细胞代用品。但由于伦理观念、人畜病毒交叉 感染和异原性蛋白免疫等复杂问题，目前进程迟缓，临床试用已趋停顿。阎 北京凯正生物工程发展有限责任公司和中国科学院过程工程研究所苏志国教授 联合研制了聚乙二醇修饰牛血红蛋白偶联物( p e g b h b ) ，是以牛血红蛋白为基质的 携氧剂与血容量扩容剂，主要用于治疗急性失血、贫血等，该项目于2 0 0 5 年进入l 期临床试验。临床前动物实验证明：一方面输入p e g - b h b 在提升血压、改善微循环、 增加组织供氧等方面有较好的效应，可以使失血动物的早期存活率接近全血回输； 另一方面p e g 修饰有效地遮蔽了牛血红蛋白的免疫原性，血清抗体测定未检出 p e g b i b 抗体，未引起实验动物产生过敏反应【2 3 列 ( 2 ) 以猪血为基础的红细胞代用品 2 0 0 3 年1 1 月，陕西西北大学北美基因股份有限公司用戊二醛聚合猪血红蛋白 制备而成了具有携氧、释氧和扩容功能的红细胞代用品。其主要用于治疗创伤等导 致的各类失血性休克、外科围手术、体外循环、严重贫血、血液疾病等危重疾病。 经过大量试验，该公司的戊二醛聚合猪血红蛋白红细胞代用品已获得显著进展，现 已进入中试阶段。【2 5 2 7 】 3以基因重组血红蛋白为基础的红细胞代用品 基因工程重组技术的发展为开发人造血液提供了有效的方法。基因工程产品具 有性能稳定、可大量生产、不易被污染和易于保存等优点。n a g a i 【2 8 】等1 9 8 4 年报道 了在e c o l i 中高效表达人血红蛋白的p 亚基，从而迈出了以基因工程方法牛产重 组人血红蛋白( r e c o m b i n 锄th u m a nh e m o 酉o b i l l ，r h h b ) 的第一步。此后，n a g a i 等将这 种p 基因表达产物与从人血中纯化的血红蛋白的a 亚基组合，构成的血红蛋白四聚 体的功能接近正常的血红蛋白。这种四聚体一度被称为“半合成血红蛋白”。在n a g a i 试验室从事研究的t 锄e 采用类似方法高效表达了a 亚基，至此r h h b 的实验室工艺 全部完成，这也为基因工程牛产红细胞代用品奠定了基础。h o f m a n 【2 9 】等将a 和p 基因构建于同一表达载体，使用一个操纵予实现共表达，使a 和b 亚基在表达过程 中即形成c c 2 p 2 四聚体。此后不久，c o g i l l a n 【3 0 】等也在啤酒酵母中表达了具有一定功 能的衄b 。1 9 9 2 年，l 0 0 k e ，1 】等在大肠杆菌中将两个重复a 珠蛋白基因首尾融合， 同时在珠蛋白基因中引入了1 0 8 位的a s n l y s 突变，这样表达出的血红蛋白有效地 防止了解聚并降低了氧亲合力。这表明将定点突变技术用于改造d 岫的研究是成 功和可行的，同时启发着人们利用定点突变技术从各个方面改造血红蛋白，使之成 为能够实用的红细胞代用品。s t o m a t o g e n 公司与英国医学研究委员会( m r c ) 合作， 进行基因工程重组血红蛋白的研究。1 9 9 1 年s t o m a t o g e n 公司于对其产品o p n 0 m 进 行i 期临床试验，结果与分子内交联血红蛋白相类似。o p t r 0 诩对n o 的吞噬作用导 致了一定程度的胃肠反应【3 2 】。s t o m a t o g e i l 在0 p 仃0 t m 中加入促红细胞生成素( e p o ) ， 通过刺激骨髓造血机能，用来治疗患严重贫血的病人。此外，该产品也用于病人手 术后输血。 基因工程方法可以在大肠杆菌中表达人血红蛋白，但该方法受到的制约主要在 于蛋白的表达产量太低、蛋白质折叠的异常以及产物分离纯化困难等方面。转基因 动物是己知的生产r h h b 的另一途径。转基因动物表达人血红蛋白在鼠和猪中均获 成功，小鼠内表达可高达7 0 - 8 0 ，并对小鼠无不良影响。美国d n x 公司在1 9 9 1 年成功地培育出产人血红蛋白的转基因猪，人血红蛋白量占猪总血红蛋白的 1 0 1 5 ，并可望继续提高。基因工程修饰血红蛋白优于化学修饰，它避免了血源污 染的可能性，可经微生物发酵大量生产，且无须进一步修饰，不会引起免疫反应。 总体来看，它极有希望成为一种安全红细胞代用品。现已建立了简便易行的技术， 对保证临床使用的安全性也做了大量研究。 4微囊化血红蛋白( e n c a p s u l a t e dh 锄o g l o b i n ) 人们一般习惯把早期的无载氧功能的血浆扩容剂称为第一代红细胞代用品，将 全氟碳化物、化学修饰血红蛋白及基因重组血红蛋白等正在进行动物及临床试验的 氧载体称为第二代红细胞代用品。目前正在研制第三代红细胞代用品是采用微囊化 技术在血红蛋白外包裹层半透性膜，所以又称为人工红细胞( a n i f i c i a lr e db 1 0 0 d c e l l s ，r b c ) 。 1 9 5 7 年c h a n g 首次研制出微囊化人工红细胞。与前两代产品只能部分替代红细 胞功能的代用品相比，r b c 有如下优点：( 1 ) 可以同时把2 ，3 一d p g 和h b 一起包入微 囊中，使h b 的氧亲和力与协同作用与在红细胞中的h b 基本相同；( 2 ) 加入天然红 细胞中存在的各种辅酶( 如高铁血红蛋白还原酶、过氧化氢酶以及超氧化物岐化酶 等) ，减少高铁血红蛋白的牛成；( 3 ) 微囊膜起到了免疫隔离的作用，同时延长了在 8 体内的半衰期，消除了肾毒性；( 4 ) 降低渗透压，提高h b 的浓度。早期的成膜材料 有硅酮、聚乙烯醇、右旋糖苷和海藻酸钠等。由于这些膜材料在体内代谢缓慢并有 较强的毒副作用，目前广泛采用无毒性的脂质体( 1 i p o s o m e ) 作为成膜材料。 当前对微囊化血红蛋白的研究主要集中在对微囊尺寸的控制，成膜材料的通透 性的调节以及膜表面性质与体内代谢途径的研究等方面。早期研制的微米级人工红 细胞存在的主要问题是输入体内后很快被代谢掉。c h a i l g 【3 3 洲等发现直径小于l 微 米的人工细胞可以在体内保留较长时间，不会像前者那样在肺部毛细血管中沉积， 而是经过网状内皮系统代谢。1 9 8 0 年，c h a n g 等首次报道合成出直径为o 2 微米的 微囊，动物实验证实能有效延长体内保留时间。此后，各国科学家在延长人工细胞 在体内的保留时间方面进行了大量的研究，除了对微囊尺寸控制外，还对膜表面进 行修饰，增加表面电负性。到目前，体内半衰期已提高到3 0 小时，为进行临床试验 提供了可能。人工红细胞丰要计划用于心脏搭桥手术输血以及失血性休克病人的抢 救。 为了进一步提高r b c 的性能，c h a n g 用聚乳酸等生物可降解材料制成了平均直 径为8 0 2 0 0 纳米的人工细胞，同时提高了膜强度和通透性能。聚乳酸最终降解产物 为水和二氧化碳，降低了毒副作用。c h 姐g 还尝试把过氧化物岐化酶( s o d ) 一起包 入r b c 中，从而有效地减少了氧自由基的形成，降低了细胞毒性和高铁含量。目 前正在研制的新一代i c 中的h b 浓度己达天然红细胞的水平，p 小h i l l 系数和 b o l l r 系数也与人全血基本相同。 应该看到，虽然最为接近人天然红细胞的人工红细胞取得了很大的进展，但是 距离临床应用还有一定的距离。这是因为工艺条件比较复杂，牛产成本远高于人全 血。不过，人工红细胞在未来有十分广泛的发展前景。 1 3 聚合血红蛋白大分子化技术概述 从红细胞中分离纯化出的血红蛋白由于丢掉了2 ，3 。d p g ，所以氧亲利力较高， 在组织中难于将结合的氧分予释放，因此不能作为红细胞代用品直接应用。同时， 游离血红蛋白失去了红细胞膜和细胞内还原酶系统的保护，会迅速离解成为二聚体 9 并被氧化成高铁血红蛋白，然后经肾脏排出体外，引起血红蛋白尿，严重的还会造 成肾功能衰竭。此外，游离的血红蛋白会施加额外的胶体渗透压，在正常的生理渗 透压( c o p ) 下，血红蛋白的浓度仅7 9 d l ，携氧能力大大降低。为了增加血红蛋白的 稳定性，防止四聚体的快速离解，以消除肾毒性，同时降低氧亲和力，减小免疫源 性，人们尝试用各种化学试剂对血红蛋白进行化学修饰【3 5 】。目前较为成熟的修饰方 法主要有聚合血红蛋白、交联血红蛋白、共价结合血红蛋白。 1 3 1 多聚血红蛋白( p o i y h e m o g i o b i n ) 1 9 7 5 年b e s c h 【3 6 】等用2 3 d p g 的类似物：5 磷酸吡哆醛对血红蛋白上的 2 ，3 d p g 空穴进行共价修饰，使p 5 0 提高到3 0 m m h g 以上。但是磷酸吡哆醛的修饰 并不能提高血红蛋白的稳定性，所以各国研究者尝试使用各种双官能团的交联剂与 血红蛋白的表面的活性基团( 主要是赖氨酸侧链的氨基) 反应，把4 个亚基交联起 来，增加四聚体的稳定性，同时还可以进行分子间的聚合，使血红蛋白大分子化， 生成多聚血红蛋白，以达到增加稳定性、提高携氧力、降低胶体渗透压的目的，目 前最广泛使用的交联剂丰要有戊二醛和开环棉籽糖。 n o r n l f i e l d 公司一直从事戊二醛聚合磷酸吡哆醛化人血红蛋白方面的研究。他们 的丰要产品p 0 1 y h e m e ( p 0 1 y - s f h p ) 在制备过程中除去了大部分未聚合的血红蛋白， 使四聚体血红蛋白浓度低于l ，从而有效地避免了游离血红蛋白在体内迅速离解 成二聚体而引起的肾毒性，同时消除了由于游离血红蛋白强烈结合毛细血管中n o 的引起的血管收缩、血压升高及胃肠反应等由于四聚体存在引起的临床副作用。 p o l y h e m e 的血红蛋白浓度为1 4 鲥l ，已达到正常人全血总血红蛋白的值：胶体渗透 压为2 0 2 5 m m h g ，p 5 0 为2 8 3 0 m m h g ，均与全血指标相近。用狒狒进行的血液置换 试验表明，用能够维持血液中血红蛋白浓度和血液动力学特征在置换前后基本保持 不变，平均动脉压无明显升高。g o u l d 掣了7 】针对外伤和紧急外科于术病人进行期临 床试验，在输入2 单位聚合血红蛋白后，受试者没有出现明显的临床副作用，心、 肾及其他器官功能正常，无血管收缩和胃肠反应。目前，该产品已完成i i i 期临床试 验。1 9 9 1 年，b i o p u r c 公司的戊二醛聚合血红蛋白产品h e m o p u r e 丌( h b o c 2 0 1 ) 经 1 0 f d a 的批准开始进行i i i 期临床试验。牛血红蛋白的主要优势在于来源广泛，而且 无需2 ，3 d p g 类似物的修饰即可达到很高的p 5 0 值。h 锄o p u r e 中血红蛋白浓度达 1 3 士l d l ，高铁血红蛋白含量小于1 5 ，p 5 0 为3 4 功i n h g ，渗透压为1 7 m m h g ，各指 标都接近人全血，而粘度只有人全血的三分之一。该产品在室温下可保存2 年以上。 通过对绵羊模型的h 锄o p u r c 全血置换试验，血浆中的血红蛋白浓度达到了 8 1 士1 4 9 d l ，体内半衰期5 2 7 士1 8 小时，红细胞压积较低( 3 2 士o 7 ) ，动物在呼吸大 气的条件下仍然保持清醒状态。临床试验中也发现输入高剂量的h c n l o p u r e ( 0 9 1 2 9 k g ) 会引起动脉收缩，平均动脉压有一定的升高。 k e i p e n 等报道了磷酸吡哆醛化人血红蛋白再经戊二醛交联为多聚血红蛋白。戊 二醛与血红蛋白上的赖氨酸游离氨基反应，生成西夫碱( s h i f rb a s e ) 键，最终形成 大分子聚合物。当反应混合物的胶体渗透压( c o p ) 为牛理水平时，用赖氨酸( l y s ) 终止反应。经戊二醛交联后，血红蛋白的稳定性大大提高，只是p 5 0 太低。c o p 接 近正常红细胞水平，但灌流后形成二聚体被迅速派出体外。在狒狒体内的血浆半衰 期为4 6 2 小时，而聚合血红蛋白只有5 9 小时。【3 s 】 h e m o s o l 公司主要进行开环棉籽糖聚合人血红蛋白方面的研究，产品名称为 h 锄o l i i l l 【o m 。棉籽糖经高碘酸氧化开环，得到含有6 个醛基的产物开环棉籽糖 ( o m 伍n o s e ) 。开环棉籽糖的醛基可以与血红蛋白上的2 ，3 d p g 结合空穴中的氨基发 生特异反应，把q p 亚基交联起来，最终生成约4 0 的分子内交联( 6 4 k d ) 和6 0 分 予间聚合( 1 2 8 k d 6 0 0 k d ) 的交联混合物【3 9 删，蛋白浓度可达1 0 9 d l ，m e t m 含量小于 l o ，p 5 0 为3 4 n 1 i i l h g ，渗透压为2 4 m m h g 。 1 9 9 2 年，l j i a 等【4 1 】发现脱氧态( t ) 血红蛋白上b 9 3 的半胱氨酸能可逆结合血液中 的n o 成为n o h b ；氧合态( r ) 血红蛋白上的二价铁离子在无细胞膜的保护作用下， 迅速与n o 反应牛成铁自由基和n 0 3 。而n o 作为血管内皮舒张因予，起到舒张血管、 调节血压的作用，由于未修饰的血红蛋白对血液n 0 的吞噬作用，会引起强烈的血 管收缩、血压升高以及心律降低。l i e b e n h a l 【4 2 】等通过对比开环棉籽糖交联血红蛋白 与高纯度的无基质血红蛋白的临床效果发现，开环棉籽糖交联血红蛋白能够有效的 降低蛋白对n o 的结合几率，消除由此造成的血管收缩等副作用。h i s a 等f 4 3 】研究发 现交联产物中不同分子量的组分在小鼠体内的代谢时间有所不同，平均在l o 1 1 小 时。对开环棉籽糖交联血红蛋白的期的临床试验，没有发现免疫反应、凝结反应以 及肾毒性。目前，该产品正在进行冠状动脉搭桥手术灌流的期临床试验。 戊二醛交联的主要缺点，一是交联反应无特异性，因为血红蛋白表面约有4 0 个赖氨酸侧链氨基以及4 个链端氨基可以参与反应，反应较难控制，终产物的分子 量分布从3 2 k d 到1 0 0 0 k d 以上，终产品是非均一性的混合物。分子量的控制一直是 戊二醛交联吡哆醛化血红蛋白的一个难点，过低的分子量稳定性差，容易离解造成 肾毒性，而且携氧效率低；过高的分子量会使血液粘度增加，不利于血液的流动， 而且会沉积在血管内壁及肝和脾中。体外试验表明：分子量分布在1 3 0 k d 6 0 0 l ( d 的 中分子量产物稳定性较好，携氧效率接近人全血，有良好的临床应用前景。 1 3 2 分子内交联血红蛋白( i n t r a m o i e c u i a rc r o s s - i n k e dh e m o g i o b i n ) 与聚合血红蛋白不同，一些交联剂的活性比较低，交联反应主要发牛在分子内， 产物大部是分子量为6 4 5 k d 的分子内交联血红蛋白。1 9 6 8 年，b u i l n 和j a n d 】用双 n 甲基顺丁烯二酸乙酯作为分子内交联剂，增加血红蛋白四聚体的稳定性以及在循 环系统中的存留时间，降低肾毒性，同时也降低了氧亲和性。这类产品的优点是产 物均质性较好，不会像分子间聚合产物包括不同分子量的混合物，产物的粘度较低， 血液流动性较好。缺点是在牛理渗透压下血红蛋白的浓度只有5 6 d l ，携氧能力相 对较低。 1 9 7 9 年w a l d e r 等用双延胡索酸酯( 3 ，5 二溴代水杨基) 作为交联剂，将血红蛋白 分予的2 个a 亚基交联。b a x t e r 公司【4 5 1 对这类交联剂进行了广泛的研究，并将其产 品称为h e m a s s i t ，又称为双阿司匹林交联血红蛋白( d c l h b ) 。1 9 8 5 年美国军方与 公司合作开始d c l h b 的研究，由于血红蛋白经过分子内交联，稳定性大大增加， 使交联后产品可以直接用加热方式灭毒。虽然d c l h b 成为第一例被f d a 批准进行 期临床试验的红细胞代用品，但是在动物试验和对失血性休克病人复苏的试验中， 均表现出明显的临床副作用，丰要是四聚体血红蛋白对n o 的吞噬作用造成了血管 的强烈收缩和血压的升高以及明显的胃肠反应【4 6 1 。1 9 9 8 年b a ) 【t e r 宣布终止有关的 研究。 1 3 3 共价结合血红蛋白( c o n j g u a t e dh e m o g l o b i n ) 血红蛋白与天然或合成的可溶性高分子反应，形成共价结合物，这样可以大大 增加血红蛋白的稳定性，有效地防止四聚体解离，同时包裹在血红蛋白周围的高分 子链覆盖了抗原位点，起到了降低免疫源性的作用。由于共价修饰后的血红蛋白大 部分为单个四聚体，所以产物的渗透压较高而携氧较低；另一方面，大量的合成高 分子进入人体后代谢缓慢，而且会导致病人长期免疫力低下。用来共价结合血红蛋 白的高分予包括右旋糖苷、羟乙基淀粉、聚氧化乙烯( p o e ) 、聚乙二醇( p e g ) 等，其 中p o e 和p e g 共价结合血红蛋白目前已经进入临床试验。 c o n o v e r 等人【4 7 】对p e g 结合的牛血红蛋白进行了研究。发现修饰后血红蛋白的 稳定性有很大的提高，在小鼠体内的半衰期为2 0 小时，在家兔体内高达5 0 小时。 通过对猪血液等体积置换模型的研究发现，p e g 胁使心脏的每搏输出量明显增加， 同时血液中的氧结合量也有所提高，