（植物学专业论文）茉莉酸甲酯诱导拟南芥保卫细胞h2o2的产生及其调节的研究.pdf

中文摘要 茉莉酸甲酯( m e t h y l 一j a s m o n a t e ，m j ) 作为植物体内一种内源信号分子，可诱导气孔关闭。 但保卫细胞中m j 信号转导的分子机制还不是十分清楚。所以，本实验在表皮条生物分析基础 上，主要利用激光扫描共聚焦显微成像技术，以野生型拟南芥叶片下表皮为材料，研究茉莉酸 甲酯诱导拟南芥保卫细胞h 2 0 2 的产生及其被c a 2 + 和m a p 激酶调节的研究。 结果表明，1 0 一1 0 。m o l l 的m j 和h 2 0 2 都能诱导拟南芥气孔关闭，其中，1 0 m o l l 是二者 的最适浓度。1 0 0 u m lc a t 、1 0 。m o l ld p i 和5 m m o f lv c 均能不同程度地逆转1 0 。5 m o l lm j 诱导的气孔关闭。用1 0 4 m o l lm j 处理负载有h 2 0 2 荧光探针( h 2 d c f - d a ) 的表皮条5 r a i n 时，胞质d c f 荧光有明显地增强，而单独缓冲液处理的荧光却没有变化。1 0 0 u m lc a t 、 1 0 5 m o l ld p i 和5 m m 0 1 lv c 均能不同程度地减少m j 诱导的h 2 0 2 产生。这些结果说明，h 2 0 2 在m j 诱导气孔关闭中起重要作用。 当1 0 。m o l l m j 与o i m m o l l a 2 m 7 共同处理负载有h 2 0 2 荧光探针( h 2 d c f - d a ) 的表皮 条时，胞质d c f 荧光有明显地增强。1 0 5 m o l lm j 先诱导胞质d c f 荧光产生后，分别加入 o 5 m m o l l e g t a 和l m m o l l l a c l 3 时，胞质d c f 荧光都有不同程度地减弱；同样，当1 0 - s m o l l m j 与1 0 - 5 m o l l h 2 0 2 共同处理负载有c d + 荧光探针( f l u o 3 a m ) 的表皮条时，胞质荧光有明 显的增强。l f f 5 m o l l m j 先诱导胞质c a 2 + 荧光产生后，分别再加1 0 0 u m l c a t 、1 0 4 m o l l d p i 和5 r m n o l lv c 时，胞质荧光都有明显地减弱。由此推测。在m j 诱导拟南芥保卫细胞气孔关闭 的过程中，有胞质h 2 0 2 和c a ”参与，且二者在该过程中有一定的依赖关系，即二者相互促进， 相互影响。 m e k u 2 专一抑制剂p d 9 8 0 5 9 抑制m j 诱导保卫细胞内啦0 2 的产生和气孔的关闭。 当 m j 和h 2 0 2 诱导气孔关闭后，再用p d 9 8 0 5 9 处理，可使关闭的气孔重新开放，同样p d 9 8 0 5 9 使m j 诱导增强的d c f 荧光强度有所降低。因此，p d 9 8 0 5 9 通过抑制m j 诱导的h 2 0 2 产生并 清除其积累，从而阻断了m j 诱导的气孔关闭。也就是说m a p k 可有效促进m j 诱导的h 2 0 2 产生。 综上所述，在m j 诱导拟南芥保卫细胞气孔关闭过程中，h 2 0 2 起第二信使的作用。胞质 h 2 0 2 和c 矿在该过程中有一定的依赖关系，t t l - - 者相互促进，相互影响。而且m a p k 可有效 促进m j 诱导的h 2 0 2 产生。 关键词：茉莉酸甲酯胞质h 2 0 2 胞质c a 2 + m a p k 拟南芥保卫细胞气孔关闭 a b s t r a c t m e t h y l - j a s m o n a t e ( m j ) i s a l le n d o g e n o u s s i g n a lf o ri n d u c i n gs t o m a t a lc l o s u r e b u tu n t i ln o w w eh a v e n ts e e na l l yr e m a r ko nt h em e c h a n i s mo f t h i sp h e n o m e n o nf r o mt h ep o i n to f v i e wo f s i g n a l t r a n s d u c t i o n w ef o c u so nt h es t u d yo ft h em j i n d u c e dh 2 0 2g e n e r a t i o nm e d i a t e db yc a 2 + a n d m a p k g u a r dc e l l so f a r a b i d o p s i st h a l i a n ab ya p p l y i n ge p i d e r m i ss t r i pb i o a s s a ya n d l a s e rs c a n n i n g c o n f o c a lm i c r o s c o p y e p i d e r m a lb i o a s s a yd e m o n s t r a t e dt h a t1 0 - 71 0 一m o l lm j a n dh 2 0 2c a ni n d u c es t o m a t a lc l o s u r e i na r a b i d o p s nt h a l i a n ag u a r dc e l l s a n d1 0 4 m o l li st h eb e s te f f e c to ns t o m a t a lc l o s u r e c a t ( 1 0 0 u m 1 ) ，a s c o r b i ca c i d ( 5 m m o l l ) a n dd p i ( 1 0 9 r u e l l ) a l lp a r t i a l l ym i m i ct h ee f f e c to fm j o n s t o m a t a lc l o s u r ea f t e r3 ht r e a t m e n to f1 0 m o l lm j c o n f o c a lh 2 0 2m a p p i n gw i t ht h ep r o b e h 2 d c f d ar e v e a l st h a tm j ( t o 一5 m o t l ) l e a d st oi n c r e a s i n gi nc y t o p l a s m i ci ng u a r dc e l l so f a r a b i d o p s i st h a l i a n aa f t e r5m i n u t e s ，b u tt h ef l u o r e s c e n c eo f c o n t r o lh a sn o tc h a n g e a n dc a t , a s c o r b i ca c i d a n dd p ic a na l lp a r t i a l l yr e d u c et h ep r o d u c t i o no fm j - i n d u c e dh 2 0 2 t h e s er e s u l t s i n d i c a t et h a th 2 0 2c a nb ei n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no f m j i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e f u r t h e rm o r e ，1 0 一m o f lm ja n d0 1 m m o l la 2 3 1 8 7c a nm a k et h ef l u o r e s c e n c eo fd c fi n t e n s e a f t e rm j ( 1 0 4 t o o l l ) l e a d st o i n c r e a s i n gi nc y t o p l a s m i c ：h 2 0 2 ，o 5 m m o l le g t a a n dl m m o l l l a c l 3c a nb o t hm a k et h ef l u o r e s c e n c eo f d c f r e d u c e a n d1 0 m o l 几a n d1 0 4 m o l lh 2 0 2c a l l m a k et h ef l u o r e s c e n c eo fc a 2 + i nc y t o p l a s m i ci ng u a r dc e l l si n t e n s e a f t e rm j ( 1 0 4 t o o l l ) l e a d st o i n c r e a s i n gi nc y t o p l a s m i cc 矿，1 0 0 u m lc a t 、1 f f 5 m o l l 、d p ia n d5 m m o l lv c c a l la l lm a k et h e f l u o r e s c e n c eo fc a 2 + r e d u c e t h e s ed a t as u g g e s tt h a th 2 0 2a n dc a 2 + c a r lb e i n t e r d e p e n d e n ta n d i n t e r a c t i v ei nm j r e g u l a t e ds t o m a t a lm o v e m e n t m j o rh 2 0 2 - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r ew a si n h i b i t e do rr e v e r s e db yt h ei n h i b i t o rp d 9 8 0 5 9o f m e k i 2i na r a b i d o p s i st h a l i a n ag u a r dc e l l s ；a f t e rm j - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e ，t h et r e a t m e n to f p d 9 8 0 5 9c o u l di n d u c ei to p e n 则n ，a n dm jc o u t dn o te m 埘1 c et h ef h l o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fh 正h p r o b e t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tm e k i 2 c o u l dm e d i a t es t o m a t a lc l o s u r eb yt h em j i n d u c e dh 2 0 2 g e n e r a t i o n a c c u m u l a t i o n 1 1 1a 1 1 t h e s ed a m s u g g e s tt h a th 2 0 2a sa ni n t e r m e d i a t ec a l lb ei n v o l v e di ns i g n a lt r a n s d u c t i o n p a i h w a y so fm j - r e g u l a t e ds t o m a t a lm o v e m e n t , a n dh 2 0 2a n dc a 2 + c a nb ei n t e r d e p e n d e n ta n d i n t e r a c t i v ei nm j r e g u l a t e ds t o m a t a lm o v e m e m ，a n dm a p kc o u l dm e d i a t es t o m a t a lc l o s u r eb yt h e m 2 - i n d u c e dh 2 0 2 g e n e r a t i o n a c c u m u l a t i o n k e y w o r d s ： m e t h y lj a s m o n a t ( m j )c y t o s o l i ch 2 0 2c y t o s o l i c c d +m a p k a r a b i d o p s i st h a l i a n a g u a r dc e l ls t o m a t a lc l o s u r e i i 主要英文缩写 a b b r e v i a t i o n s 1 前言 1 1 茉莉酸类物质的生物合成和代谢 茉莉酸类( j a s m o n a t e s ，j a s ) 物质在自然界广泛存在，其主要代表是左旋的荣莉酸及其异 构体( + ) t - i s o j a 和荣莉酸甲酯( m e t h y l - j a s m o n a t e ，m j ) 。图1 是( 一) - j a 和它的异掏体的化学结 构式t ”。 瓣卡镊蕃 ( 3 s ，幅) t 茉蒋毅l c 3 r7 s ) 粟靳敢 轭= ：卜二夏3 如毒啦 ( 3 熹7 r ) - 策糟酸 ( ( 一 - 7 - i 曲t 苯稳璃 攘l l j a 曲舁构体 c 3 r - 7 r ) - 絮蒋醴 c ( + 卜弘蝴臻嘲口i ( 宾金华等1 9 9 5 ) j a s 是许多高等植物体内产生的天然化合物，具有重要的生理功能。l a s 在自然界的分布 及其对植物生长发育的重要作用，使得人们对其代谢，尤其是合成方面的研究较多。近年来 研究发现，植物体内合成j a 有着共同的代谢途径，即脂氧合酶途径。研究证实，茉莉酸的合 成始于亚麻酸，经脂氧合酶( l i p p o x y g e n a s e ) ，氢过氧化物脱水酶( h y d r o p e r o x i d ed e h y d r a s e ) ，外 氧化环化酶( a l i e n eo x i d ec y e l a s e ) ，还原酶( r e d u e t a s e ) 及p ，氧化酶( p o x i d a s e ) 的连续作用，最后 形成( + ) _ 7 i s o - j a l 2 1 。( + ) - 7 - i s o j a 在植物体内极易异构化形成( ) j a j a 又可甲基化形成茉 莉酸甲酯( m j ) ( 图2 ) 。目前，这条生物合成途径已得到多方面的证实，j a 合成中脂氧合酶 可能起重要作用，如果抑制腊氧合酶的活性，j a 的合成便会降低1 3 1 。 在高等植物中，j a 台成的组织器官并非特异往，在未成熟的果实，萌发种子的子n 十以及 叶片中，均发现有j a 的生物合成步骤。其中，有些步骤是受叶绿体上的膜结合酶催化，但整 个途径在细胞内的定位还不清楚1 ”。 n - | i n o l e n i ea c i d ( 1 1 - 亚麻酸) il i p o x y g e n a s e ( l o x ) 0 ( 脂氧合酶) 3 - h y d r o p e r o x y l i n o l e n i ca c i d ( b 一氢过氧化亚麻酸) j h y d r o p e r o x i d ed e h y d r a s e 士( 氢过氧化物脱水酶) 1 2 ，1 3 一e p o x y l i n o l e n i ca c i d ( 1 2 ，1 3 一环氧亚麻酸) la l l e n eo x i d ec v c l a s e i( 丙二烯氧化物环化酶) t 1 2 一o x o - p h y t o d i e n o i ca c i d ( 1 2 一氧代- 植物二烯酸) n a d p h r e d u c t a s e ( 还原酶) n a d p + 用委淼用， ( ) j a l甲基化 i 菇 化 图2 茉莉酸类( j a s ) 物质生物合成及代谢途径( 参照v i c k 等1 9 8 4 ) 2 p b 在植物中j a 是最丰富的形式，而m j 则是外源施用时活性更强。具体说来，j a 的代谢有 4 条途径：( 1 ) c 1 1 ( 经常发生) 或c 1 2 的羟基化，形成1 1 - o h 或1 2 - o h 衍生物；( 2 ) c s 酮基的 还原，生成与黄瓜酸( c u c u b i ca c i d ) 有关的化合物；( 3 ) 羟基化后再糖化，或者黄瓜酸c 6 糖化；( 4 ) c ，与氨基酸结合或酯化。这些途径一些发生在植物细胞中，一些发生在细菌和真菌体中，如 在植物中没有发现c 。的糖化作用，在悬浮培养细胞中没有发现氨基酸与j a 的结合1 1 “。正 因为j a 有这样的代谢途径，自然界中也就有许多j a 的衍生物。 1 2 j 刖m j 的生理功能 通过对j a s 生理功能的研究，发现它在植物的生长发育及抗逆性方面具有广泛的生理作 用。生长发育主要是对生长的抑制作用和衰老脱落的促进作用。如抑制幼苗和根生长、种子 萌发等；促进叶片衰老、气孔关闭、叶绿索降解等过程【5 - “。抗逆性方面发现，j a m j 与植物 抗机械伤害和抗病性有密切关系。通常在多种胁迫条件( 如机械伤害、虫害、病害、干旱、高 温等) 下，植物细胞可以在短时间内积累大量的j a s ，诱导相关基因表达，使植物体产生系统获 得性抗性( s a r ) 【7 ”。由此认为j a s 是参与抗性信号传递，诱导植物防御反应，产生系统获得 性抗性的内源信号分子。而且j a m j 的生理生化作用与a b a 极为相似。 1 2 1j a m j 对植物生长发育的调节 j a m j 作为一类新的植物生长物质，在植物生长发育中的重要性已越来越为人们所认识， 主要体现在对生长的抑制作用和对衰老脱落的促进作用。例如，它对衰老、叶柄脱落、根形 成、卷须弯曲、乙烯合成、呼吸作用的升高等具有促进作用；对花粉萌发、种子萌发、愈伤 组织生长、幼苗生长、叶绿素形成、光合作用等具有抑铷作用瓯q 。概括起来，j a m j 在发挥 对植物生长发育调节作用时具有以下特点：( 1 ) 作用对象的广泛性：( 2 ) 生理作用的多效性： ( 3 ) 作用部位的多样性：( 4 ) 作用形式的多样性；( 5 ) 不同浓度对同一对象作用的不一致性 ( 浓度效应) 。 1 2 2j a m j 与植物抗逆性及作用机理 研究表明，j a m j 与植物抗机械伤害和抗病性有密切关系。当对植物、原生质体和愈伤 组织施用j a m j ，将会促进许多基因表达而合成系列蛋白质，如蛋白酶抑制剂、硫蛋白 ( t h i o n i n ) 、植物抗毒素( p h y t o a l e x j n ) 、营养性贮藏蛋l 刍( v e g e t a t i v es t o r a g ep r o t e i n s ) 等。这些蛋 3 白质统称为茉莉酸酯诱导蛋( j a s m o n a t e i n d u c e p r o t e i n s ，j i p s ) 。j a m j 诱导植物合成j i p s ，但 具体的作用机理目前仍不清楚。不过，一些研究结果可以帮助我们理解j a m j 的抗逆性作用。 如：( 1 ) 直接抗菌作用；( 2 ) 诱导蛋白酶抑制荆合成；( 3 ) 诱导硫蛋白和植物抗毒素合成；( 4 ) 提高脂氧合酶活性；( 5 ) j a m j 传递抗性信息；( 6 ) j a m j 与乙烯，水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) ， 系统素( s y s t e m i n ) 的关系。目前正积极开展j a v l j 诱导植物抗性研究，但能否作为一种具普遍 性的抗性诱导物应用于农业生产，至今尚未得到证实。有待于进一步的研究。 1 2 3 j 刖m j 与a b a 功能的相似性 j a s 不仅是一种新型的植物激素，而且在生理功能上与a b a 有许多相似之处，如在幼苗 生长、根生长、细胞悬浮培养、种子萌发、胚胎发生、花粉萌发、r u b p 羧化酶生物合成等过 程中，二者均起抑制作用；在打破种子体眠、叶片衰老、气孔关闭、叶绿素降解等过程，二 者均起促进作用：而在块茎形成、卷须盘曲及许多基因转录过程中则起诱导作用。值得注意 的是，j a m j 和a b a 都能促进气孔关闭，且二者在调节气孔运动方面也有类似的生理机制。 1 3 j a l v i j 对气孔运动的调节 1 3 1 保卫细胞气孔运动的特点 大多数陆生植物叶片的上下表皮均有一对保卫细胞构成的气孔结构。保卫细胞胞质渗透 势下降，吸水，导致气孔开放；反之，保卫细胞胞质渗透势升高，失水，引起保卫细胞膨压 降低从而气孔关闭p o l 。这一气孔结构控制着植物与大气中的气体交换。如光合作用中c 0 2 的吸收和蒸腾作用中h 2 0 的丧失等，在植物生命活动中起重要作用，尤其对植物生长发育的 调节更为显著，因而，其调节机制一直是人们普遍关注的问题。 近年来，由于细胞感应与信号转导研究的兴起，高等植物的保卫细胞已成为植物生物学 家研究高等植物细胞信号转导和离子通道的模式材料，保卫细胞有其独特的结构和生理意义： ( 1 ) 保卫细胞能对多种刺激如光、脱落酸( a b a ) 、生长素等迅速作出反应；( 2 ) 这些刺激 可迅速改变离子的运输，并伴随保卫细胞体积的改变，所产生的无机渗透势较易测定：( 3 ) 许多植物( 如蚕豆、鸭趾草) 的表皮可撕下，用表皮组织可直接观察保卫细胞的变化；另外， 模式材料拟南芥( 及其突变体) 的应用也为人们深入研究信号转导过程提供了一个新的途径。 4 1 3 2j a m j 调节气孔运动的信号转导 j a s 作为一种抗逆信号分子参与多种外界环境胁迫条件( 如干旱、水淹、冷害、病原菌等) 下保卫细胞信号转导，而且j a m j 调节气孔运动方面的研究也有所进展，如：不同浓度 ( 1 0 4 1 0 6 m o t l ) 水jj a s 都能促使许多植物叶片的气孔关闭1 “。g e h r i n gc a 等证实m j 诱导 的气孔关闭与保卫细胞胞质内k + 水平及胞质碱化有关”l ，这正与a b a 调节气孔运动的作用 机制相似【“1 ：董发才等提出胞质c a 2 + 参与了m 】对气孔运动的调节 1 4 1 这与i z u m i 等的研究 结果一致“”；虽近，d o n t a m a l a 等证实m j 可诱导拟南芥保卫细胞产生和积累h 2 0 2 1 ( 图3 ) 。 但是j a s 促进保卫细胞气孔关闭的信号转导链的中间环节至今仍不十分清楚，而且在m j 诱导 气7 l 关闭过程中胞质h 2 0 ：与胞质c a 2 + 和m a p k 的可能关系也未见报道。所以本论文就从该 方面着手，利用气孔表皮条生物分析和激光扫描共聚焦显微成像技术( c l s m ) ，研究h 2 0 2 在 m j 诱导拟南芥气孔关闭过程中的作用及其与胞质c a 2 + 和m a p k 的可能关系。 1 3 2 1 h 2 0 2 在j a m j 调节气孔运动中的作用 植物细胞在正常代谢过程中可产生活性氧( a c t i v eo x i d a t i v es p e c i e s ，a o s 或r o s ) ，包括 0 2 、h 2 0 2 o h 、1 0 2 和脂氧自由基等。随着人们对r o s 认识的深入，发现r o s 有可能作为 第二信使参与植物体内多种代谢途径。许多研究证实，h 2 0 2 的确作为第二信使参与了多 信 号转导“7 ”1 。 h z o z 在植物体内具有广泛的生理生化效应，它可直接作用于蛋白质、脂类、多糖和核酸， 参与和影响多种生物代谢体系，如增强植物的抗病性、诱导气孔关闭、促进次生壁的分化等。 尤其是植物一病原菌相互作用过程中h 2 。2 的产生及其转导机制研究的深入，拓展了人们研究 r o s 信号转导的思路。多方面的研究表明，h 2 0 2 是植物细胞内较为活跃的信号分子。目前， h 2 0 2 作为一种信号分子在j a m j 和a b a 对气孔运动调节的作用的研究工作正在进行。 m c a n i s h 等和p e t 等指出，h 2 0 2 和胞质c a + 是a b a 调节气孔运动信号转导链的关键成分“。 k o v t u n 等报道，h 2 0 2 触发了促分裂原活化蛋白激酶( m a c k ) 9 1 起的级联反应。他用外源的h 2 0 2 处理拟南芥叶肉原生质体，发现激活了与烟草细胞n p k 相似的拟南芥a n p 激酶，然后激活 m a p k 上游的因子，触发了m a p k 的级联发应，最终导致g s t 基因的表达。”。d o n t a m a l a 等 证实m j 可诱导保卫细胞产生和积累h 2 0 2 ，并研究了m j 在诱导气孔关闭过程中与a b a 信号 的级联途径“o ( 图3 ) 。 8 艇，- 1 0 酣f 1 2 j 竹f ，1 k 黝 m l 7 w z 0 l 啦i 卯d a s 辩e 卜a t t 器b o h d f t 。 a b f 2 - 1 - i li t i c a 奢+ r 一了善 ；毒 图3 保卫细胞a b a 和m j 的信号转导级联途径( d o n t a m a l a 等2 0 0 4 ) 迄今为止，人们对作为信号分子的h 2 0 2 在植物细胞中信号转导的细节及其与胞内其它信 号的时空关系还知之甚少，所以，h 2 0 2 在j a i m j 对气孔运动的调节中的作用是我们研究的主 要内容。 1 3 2 2 胞质c a 2 + 参与的j m m j 对气孔运动的调节 c 一对植物细胞的结构和生理功能有重要的作用，能维持细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白 的稳定性，参与胞内稳态和生长发育的调节过程，在细胞内起第二信使作用。”。m c a n i c h 等首先报道了植物激素a b a 诱导胞质c a 2 + 浓度升高”1 。m a n s f i e l d 等证实胞外c a 2 + 可激活 依赖c a 2 + 的磷酸酯酶，钝化k + 内流通道，从面阻挡了使气孔张开所需要的1 0 内流，抑制气 孔张开“”。因此，植物细胞和动物细胞相似，可以通过细胞内c a ”浓度的变化对外界刺激 作出反应。 自m c a n i c h 等发现h 2 0 2 通过启动胞质钙信使系统来调节气孔运动以来n 9 3 ，p e i 等叉提出 a b a 诱导产生的h 2 0 2 可能也是通过启动胞质钙信使系统来引起气孔关闭的 2 0 o 而且董发才 等提出胞质c a “可能是m j 促进气孔关闭的重要信号转导因子1 4 3 。尽管胞质c a 2 + 参与m j 对 气孔运动调节方面的研究有所进展，但在m j 诱导保卫细胞气孔关闭过程中，胞质c a 2 与胞 质h 2 0 2 可能的关系还不清楚，所以，本文也把它作为研究重点。 1 3 2 3m a p k 与植物逆境信号传递途径 植物蛋白激酶家族，根据其底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类，可将它们分为3 粪：( 1 ) 丝氢酸苏氨酸( s e r t h r ) 蛋白激酶；( 2 ) 酪氨酸( r y 0 蛋白激酶；( 3 ) 组氨酸( i i s ) 蛋白激酶。植物中 也发现了促细胞分裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n e t i c a c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e ，m a p k ) 的相似蛋白。 m a p k s 家族成员存在于所有的真核生物中，在多种信号传递中起作用，他们是一类丝氨酸， 苏氪酸( s e r t h r ) 蛋白激酶。该家族成员包括分裂原激活蛋白激酶( m a p k s 又叫m p k s ) ，分裂原 激活蛋白激酶的激酶( m a p k k s ，又叫m e k s 或m k k s ) ，分裂原激活蛋白激酶的激酶之激酶 ( m a p k k k s ) 3 种类型。在真核细胞中，这3 种类型的激酶构成一个m a p k 级联系统。通过 m a p k k k - m a p k k - m a p k 逐级磷酸化，将外来信号级联放大并传递下去“”。 蛋白激酶在植物体内的生理功能主要表现在以下四个方面：( 1 ) 调控植物发育；( 2 ) 参与 抗性作用；( 3 ) 参与激素信号传递；( 4 ) 参与光信号传递。目前已发现乙烯和生长素的信号转导 均涉及m a p k 级联系统途径1 2 1 1 。拟南芥中m a p k k k 类蛋白激酶a l m e n k k l 以及m a p k k 类激酶a t m e k k l 和a t m k k 2 是渗透胁迫m a p 激酶信号转导过程中的中间成分 2 6 1 a h 2 0 2 可激活拟南芥特异的m a p k k k 类激酶a n p l ，而a n p l 类似h 2 0 2 的作用，启动a t m p k 3 和 a t m p k 6 两种m a p 激酶的磷酸化反应”( 图4 ) 。但还有很多途径目前没有研究清楚。另外 m a p k k 类的m e k i 2 类激酶专一抑制剂p d 9 8 0 5 9 完全抑制了a b a 诱导的豌豆表皮条气孔关 闭c 2 7 。且m a p k 调节了蚕豆保卫细胞中a b a 诱导的h 2 晚产生。”。 尽管植物蛋白激酶的研究为了解植物生长发育机制提供了新的手段，也开创了植物分子 生物学新的领域。但同动物蛋白激酶的研究相比，植物蛋白激酶的研究起步较晚，因而许多问 二 题还没有答案。所以我们有关m t 诱导拟南芥保卫细胞气孔关闭过程中胞质h 2 0 2 与m a p k 可 能关系的研究。为蛋白激酶未知领域增添更多的信息。 7 o x i d a t i v es l r s s s 图4 h 2 0 2 激活拟南芥特异的m a p i c k k 类激酶a n p i 的信号转导( k o v t u n y 等，2 0 0 0 ) 8 2 选题意义及依据 逆境是世界粮食生产面临的重大问题，积极开展植物抗性生理研究，提高作物的抗逆性 是非常重要的。植物会通过气孔的关闭来调节生理过程，从而提高抗逆性。m j 是一类天然的 植物生长抑制剂，与a b a 在生理功能上有许多相似之处。在逆境条件下，植物体内产生某些 化学物质来调节和诱导其抗逆性反应，例如a b a 、m j 等，它们不仅参与植物抗逆反应，还 直接参与植物生长发育的调节。8 2 0 2 、c 2 + 及m a p k 信号分子的研究已取得了一些进展。研 究表明，h 2 0 2 可作为正调节因子参与a b a 和m j 对气孔运动的调节过程，植物细胞可通过细 胞内c a 2 + 浓度的变化对外界克q 激作出反应，并证实在a b a 和m j 诱导气孔关f i j 过程中均有胞 质c a 2 + 参与，且m a p k 在a b a 和m j 诱导的气孔关闭过程中的作用及其机理也是目前研究 的热门课题。 但是，有关m j 诱导拟南芥保卫细胞气孔关闭过程中，胞质h 2 0 2 与胞质c e + 和m a p k 的可能关系目前尚未见报道。所以，本文将从与作物产量密切相关的气孔运动着手，研究m j 信号转导中胞质h 2 0 2 与胞质c d + 和m a p k 的可能关系。有助于深入了解它们的关系及它们 在m j 信号转导途径中所处的地位，为从理论和实践上解决作物抗逆问题，提供新的手段。 9 3 材料与方法 3 1 植物材料及化学试剂 野生型拟南芥似r a b i d o p s 妇t h a l i a n a ) 种子经o 1 升汞表面消毒6 - t r a i n ，用无菌水冲洗 3 5 次，然后种植在光照充足的培养室中，生长条件为：光艏周期为1 6 8 h ，温度1 8 - - 23 。c ， 相对湿度8 0 左右，光照强度9 0 9 m 0 1 m s ，昼夜温度分别为2 3 2 。c ，生长期间无任何胁 迫。h 2 d c f - d a 和f l u o 一3 - a m 为m o l e c u l a rp r o b e ( e u g e n eo r e g o nu s a ) 公司产品。m j 和 d p i ( d i p h e n y l e n ei o d o n i u m ) 为s i g m a 公司产品，c a t a l a s e ( b o v i n el i v e r ) 为c a l b i o c h e m 公司产品， 其余为国产分析纯。h 2 d c f - d a 和f l u o 一3 一a m 以d m s o ( d i m e t h y ls u l f o x i d e ) 溶解，制成浓度分 别为5 0 m m o l , l 和2 0 m m o l l 母液，分装，- 3 0 。c 冷冻保存。 3 2 表皮条生物分析 气孔开度的测定按照m c a i n s h 等人的方法，略加修改口9 1 。取4 “周龄未抽苔的c o l ( w t ) 拟南芥叶片( 一般取第三层平展的叶片) ，用蒸馏水洗涤，撕取下表皮，毛刷刷去叶肉细胞，将 新鲜的表皮条置于不含c 0 2 的m e s k c i 缓冲液( 5 0 m m o l l k c l ，1 0 m m o l lm e s ，0 1 m m o l l c a c l 2 ，p h6 2 4 ) 中。在23 。c 光照约3 h ，诱导气孔张开，处理前在倒置显微镜( 1 0 x 4 0 ) 下用测微尺测量气孔开度大小。每个处理至少三个表皮条，每个表皮条随机选取5 个视野，每 个视野随机测1 0 个气孔开度。每个处理重复至少8 次( 不少于4 0 0 个气孔开度) 。统计其平均 值和标准误差。最后用柱状图表示不同的试剂处理前后气孔开度的变化。 3 3 荧光探针的导入 预先将h 2 d c f d a ( 2 ，7 d i c h l o r o f l u o r e s c i nd i a c e t a t e ，2 ，7 二氯二氢荧光素乙酰乙酸 盐) 配成5 0 m m o l l ，f l u o 3 一a m 配成2 0 m m 0 1 l 的d m s o 母液，分别分装冷冻保存，负载时撕 取拟南芥叶片下表皮并切成约3 m m 长的表皮条，都培养在5 m l 负载液中，然后分别加入 5 此的h 2 d c f d a 和5 9 l 的f l u o - 3 - a m 的d m s o 母液混匀，h 2 d c f - d a 的最终浓度为 5 0 9 m o l l ，f l u o 3 a m 的最终浓度为2 0 “m o l l ，h 2 d c f d a 的孵育温度和时间是：室温 ( 2 5 2 。c ) 下避光孵育1 0 - 1 5 分钟；f l u o 3 - a m 的孵育温度和时间是；先3 5 ：= 2 0 c 下黑暗培养 2 5 分钟，再转入室温( 2 5 士2 。c ) 下避光孵育4 5 分钟。 3 4 激光扫描共聚焦检测荧光 利用激光扫描共聚焦显微镜( b i o - - r a dm i c r o r a d i a n c el a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e ， c l s m ) 记录表皮条的荧光变化。将负载有h z d c f d a 或f l u o - 3 一a m 的表皮条用新鲜的负载 缓冲液漂洗两次，以洗去细胞表面多余的探针。然后用盖玻片迅速将表皮条固定在显微镜 i k o nt e 3 0 0 ) 载物台上，利用激光共聚焦扫描显微镜观察。h z d c f d a 时，c l s m 的工作条件 为：e x = 4 8 8 n m ，e r a = 5 1 5 - 5 3 0 n m ，p o w e r1 0 ，z o o m8 - 1 0 ，中速扫描，f r a m e5 1 2 5 1 2 ； f l u o 3 一a m 时，c l s m 的工作条件为：e x = 4 8 8 n m ，e m = 5 3 0 5 6 0 n m ，p o w e r1 0 ，z o o m8 - 1 0 ， 中速扫描，f r a m e5 1 2 x 5 1 2 。两种探针软件都为t i m e c o u r s e 。分析软件使用的是c o n f o c a l a s s i s t a n ts y s t e m ( c a s ) 和p h o t o s h o p 。为确保不同实验之间具有一定的可比性，所有的荧光图 像都在相同的设置下获得( 即通过人工将仪器中相关参数如i r i s ，g a i n ，o f f s e t ，p o w e r 等设置 为固定值) 。每个处理至少重复1 5 次，结果一致，取其中一个细胞进行分析。 4 结果与分析 4 1 不同浓度的m j 和h 2 0 2 对拟南芥气孔开度的影响 为找到一个合适的m j 和h 2 0 2 浓度，该浓度的m j 和h 2 0 2 即可明显诱导气孔关闭又不会 对气孔保卫细胞造成伤害，采用了不同浓度的m j 和h 2 0 2 处理拟南芥气孔保卫细胞，并用 f d a 检测m j 和h 2 0 2 处理后细胞活性情况。结果表明，m j 和1 - 1 2 0 2 都可以浓度依赖的方式诱 导气孔关闭( 图1 和2 ) 。l o - t m o l l 和l o 6 m o l l 的m j 可分别使气孔开度比对照减小约5 0 左右，而1 0 4 m o l lm j 诱导气7 l 关闭达7 0 2 主右。1 0 - 4 m o l l 和1 0 。m o l l 的m j 可分别诱导气 孔关闭5 0 v 研n1 0 。细胞活性的f d a 检测表明，当m j 浓度在1 0 。m o l l 至1 0 4 m o l l 时保卫 细胞保持良好活性；而当m j 浓度为1 0 4 m o l l 和1 0 。m o l l 时，保卫细胞稍微丧失活性，推测 m j 在1 0 4 m o l l 和1 0 4 m o l l 浓度时诱导的气孔关闭可能是由于细胞受到一定的伤害引起的。 = b 如t r e e , n e a t 图1 不同浓度的m j 对拟南芥气孔关闭的影响( n = 4 5 0 ) 在促进气孔开放的条件下把表皮条侵 不含c 0 2 的m e s - k c i 介质中诱导开放3 h 后，测量气孔开度， 作为起始值。然后把气孔已开放的表皮条转移到分别含有缓冲液，1 0 4 m o l r l 、1 0 4 m o l l 、1 0 - 5 m o l l 、1 酽m o i l 、 1 0 。m o l lm i 的新鲜介质里，继续诱导开放2 5 h ，再测量气孔开度。其中的数值是4 5 0 个( 9 次，每次5 0 个 气孔) 气孔测量值的平均值( s e ) f i g u r e1 p r o m o t i o no fs t o m a t a lc l o s u r eb ym j i s o l a t e de p i d e r m i so f a r a b i d o p s i sw a si n c u b a t e di nc 0 2 一f r e e m e s k c ib u f f e rf o r3 hu n d e rc o n d i t i o n sp r o m o t i n gs t o m a t a io p e n i n ga n dt h e nt r a n s f e r r e dt of r e s hc 0 2 f r e em e s - k c l b u f f e rc o n t a i n i n go m o l 几、1 0 “m o l l 、1 0 一m n l a ，、1 矿m o l l 、1 0 - 4 m o l l 、1 0 - m o l lm js t o m a t a la p e r t u r e sw e r e d e t e r m i n e da f t e r25 hi n c u b a t i o n e a c hv a l u ei st h em e a r to f 4 5 0m e a s u r e m 瓤c 啦s b 同样，1 0 。m o g l 和1 0 4 m o l l 的h 2 0 2 分别导致气孔开度减少约4 0 和5 0 左右， 1 0 。5 m o l lh 2 0 2 使气孔开度减少约8 0 左右，而且在此浓度范围内h 2 0 2 诱导的气孔关闭具有 可逆性，1 酽m o l l l 和1o + 3 m o l l 的h 2 0 2 导致气孔开度减少约6 0 v o 左_ 右，并伴随着细胞活性一定 的丧失。以往的研究表明，甲基紫精和h 2 0 2 对气孔开度有显著的影响，h 2 0 2 可促进气孔关闭 和抑制气孔张开，并随h 2 0 2 浓度的增加，这些促进和抑制作用加强，当浓度 1 0 。m o l l 时， h 2 0 2 所诱导的气孔关闭作用可通过洗除h 2 0 2