（植物病理学专业论文）水稻基因启动子OsBTF3p的克隆及其启动活性分析.pdf

摘要 植物启动子作为重要的转录调控元件控制着基因在特定组织、发育阶段以及环境条件下的表 达。大多数转基因研究使用组成型启动子，进行靶基因过量表达，通常情况下会影响植物生长和 发育。发掘和利用组织特异性和诱导型表达的启动子，无论对于基因表达调控机理的研究，还是 在转基因研究中加以利用都具有十分重要的科学意义。近年来，一些新型的植物启动子正在被发 掘出来，并逐步在转基因研究中加以应用，但有关水稻基因病原菌诱导型启动子的研究鲜有报道。 本实验室前期对水稻品种日本晴( o r y z as a t i v alc v n i p p o n b a r c ) 悬浮细胞与水稻白叶枯病菌 ( x a n 髓o m o n a so r y z a ep v o r y z a e ，简称x o o ) 互作后的表达谱进行了c d n a a f l p 分析，发现了一批 受x o o 调控( 诱导或抑制) 而差异表达的基因。为了从水稻基因中发掘新型的病原菌诱导型启动子， 本研究对受x o o 侵染的水稻植株水平中6 个差异表达基因的表达进行r t - q p c r 分析；对其中的 o s b t f 3 编码区上游的启动子序列( o s b t f 3 p ) 进行了分子克隆，检测了转基因水稻抗性愈伤组织和 植株中o s b t f 3 p 对g u s 表达的启动活性。本研究目的在于获得o s b t f 3 p 克隆片段，明确其对靶 基因表达的启动作用，为抗病转基因水稻研究提供理论依据和材料。 本研究利用r t - q p c r 方法，分析在受x o o 侵染过程中6 个水稻基因( 0 s 7 4 、o s 8 2 、0 s 1 6 4 、 o s l 9 0 、0 s 2 3 4 ，0 s 2 6 0 ) 的表达。其中仍刀表现为下调表达，在发病期表达量最低；0 s 8 2 表现为 显著的上调表达，在接种x o o7 2h 后，表达量达到最高值；0 s 1 6 4 和0 s 2 3 4 表现为下调表达，表 达量呈递减趋势；o s l 9 0 与0 s 2 6 0 表现为下调表达，表达趋势不呈规律性变化，以上结果与本实 验室前期对x o o 与水稻悬浮细胞互作结果相一致。由于0 s 8 2 在接种x o o 后表现显著的上调表达， 可能与x o o 诱导相关。因此，本研究选择o s 8 2 ( o s b t f 3 基因) 进行基因启动子活性及功能分析。 根据o s b t f 3 基因上游序列设计引物，以水稻基因组d n a 为模板，扩增了包括翻译起始位 点在内的上游1 3 7 8 b pd n a 片段，克隆的序列与g e n b a n k 中水稻日本晴的序列一致，命名为 o s b t f 3 p 。在o s b t f 3 p 序列中，除包含基本的启动元件及大量的c a a t 盒( 与增强转录效率有关) 外，还包含t c a 盒( 与水杨酸应答有关) 、富含t c 重复序列( 与胁迫应答相关) 、g 盒( 与信号诱导 相关) 、w 盒( w r k yd n a 结合蛋白特异识别位点) 、s p l 、i 盒、g a t a m o t i f 、c a t t 盒( 与光诱导 应答相关) 、m r e 、m b s ( m y b 结合位点) 等：在翻译起始密码子前、5 - u t r 后具有一段内含子先 导序列，其中包含c a a t 盒、t c a 盒、i 盒、g 盒等顺式调控元件。 构建o s b t f 3 p ：g u s 融合基冈植物表达载体p c a m o s b t f 3 p ，利用农杆菌介导的水稻遗传 转化：经转化子筛选和转基因植株再生等过程，成功地获得了3 9 株o s b t f 3 p ：g u s 转基因水稻 植株。 用g u s 组织化学染色法和荧光活性定量法，检测了o s b t f 3 p 在水稻转基因愈伤组织中对 g u s 表达的启动活性。与转化无启动子表达载体的愈伤组织对照相比，转化o s b t f 3 p ；：c u s 的 抗性愈伤组织表现出明显的g u s 活性，表明o s b t f 3 p 具有启动功能。对o s b t f 3 p 和c a m v 3 5 s 启动子驱动的转基因植株进行g u s 活性比较分析，发现c a m v 3 5 s f f g u s 转基因植株根部和叶部 所有组织g u s 均有高水平表达，而o s b t f 3 p ：g u s 转基因植株g u s 表达水平相对较低，只在转 基因水稻叶片维管束组织具有表达活性，表明o s b t f 3 p 表现出一定的维管束组织特异性。 用g u s 荧光活性测定法，对o s b t f 3 p 的x o o 诱导性进行了初步测定。在x o o 侵染1 2 h 、2 4 h 和7 2h 时，o s b t f 3 p 驱动的g u s 活性均表现为明显的上调表达，表明o s b t f 3 p 具有一定的病原 菌诱导活性。 关键词：o s b t f 3 p ；g u s 活性；组织特异性；病原菌诱导型；水稻 ab s t r a c t p l a n tp r o m o t e rp l a y sak e yr o l ei nt i g h t l y - c o n t r o l l i n gt e m p o r a la n ds p a t i a le x p r e s s i o no ft r a n s g e n e s i ng e n e r a l ，c o n s t i t u t i v eo v e r - e x p r e s s i o no ft r a n s g e n e si so n eo fm a j o rs t r a t e g i e st oe n g i n e e ri n c r e a s e d d i s e a s er e s i s t a n c es of a r h o w e v e r ，u s eo fs u c hp r o m o t e r sh a so f t e nl e dt ot h ef o l l o w i n gp r o b l e m s ： r e d u c e ds i z e ，a l t e r e dm o r p h o l o g y , s h o w i n gd i s e a s es y m p t o m si nt h ea b s e n c eo fp a t h o g e n si nt r a n s g e n i c p l a n t s f o rm a n ys t r a t e g i e s ，p a t h o g e n - i n d u c i b l ea n dt i s s u e s p e c i f i cp r o m o t e r si np l a n t sm i g h tb et h e m o s tu s e f u lt o o l st oe x p r e s st r a n s g e n e sw i n ld i s e a s er e s i s t a n c e t h ed e m i l e da n a l y s i so ft h e s ep r o m o t e r s i sh e l p 彻t ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s m so fg e n ee x p r e s s i o na n dt ou t i l i z ei ng e n e r a t i o no ft r a n s g e n i c p l a n t s r e c e n t l y , s o m en o v e lp r o m o t e r sh a v eb e i n ge x p l o i t e da n da p p l i e di n t h et r a n s g e n i cp l a n t s h o w e v e r , af e wa b o u tt h ep a t h o g e n i n d u c i b l ep r o m o t e r si sr e p o r t e di nr i c e e l u c i d a t i o no ff u n c t i o n so fk e yg e n e si n v o l v e di nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nr i c e ( o r y z as a g v alc v n i p p o n b a m ) a n dx a n t h o m o n a so r y z a ep v o r y z a e ( x o o ) i so fg r e a th e l pt ou n d e r s t a n dt h em o l e c u l a r m e c h a n i s m so fb a c t e r i a lb l i g h t i nt h ep r e v i o u ss t u d y , c d n a - a f l pa n a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o np r o f i l i n g o fx o o - i n d u c e dr i c es u s p e n s i o nc e l l sr e v e a l e dt h a tas e to f d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e si sr e l a t e dt ot h e s u s c e p t i b i l i t y t ob a c t e r i a lb l i g h tc a u s e db yx o o t oe x p l o i tan o v e lp a t h o g e n i n d u c i b l ep r o m o t e r , r t - q - p c rw a su s e di nt h i ss t u d yt oa n a l y z et h ee x p r e s s i o no f6d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e si l l x o o - i n o c u l a t e dp l a n t so fr i c e ( o r y z as a t i v alc v ：n i p p o n b a r e ) m o l e c u l a rc l o n i n ga n dd e t e c t i o no fg u s a c t i v i t yo fo n eg e n e ( o s b z f 3 ) p r o m o t e r , n a m e do s b t f 3 p i nt h et r a n s g e n i cc a l l ia n dp l a n t sw e r e p e r f o r m e da sw e l l 1 r t - q p c ra n a l y s i so fe x p r e s s i o no f6s e l e c t e dd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e ss h o w e dt h a t5 g e n e s ( o s z 4 ，0 s 1 6 4 ，o s l 9 0 ，0 s 2 3 4a n d0 s 2 6 0 ) a r ed o w n - r e g u l a t e d ，w h i l eo n l y0 s 8 2i su p - r e g u l a t e d i t i n d i c a t e st h a to s 8 2 ，ag e n ee n c o d i n gt h eb a s i ct r a n s c r i p t i o nf a c t o rb t f 3i nr i c ei si n d u c i b l eu p o nx o o i n f e c t i o n t h ep r o m o t e ro s b t f 3 pw a sc h o s ef o rt h ef u r t h e rf u n c t i o n a la n a l y s i s 2 a1 , 3 7 8b pd n af r a g m e n t so fo s b t f 3 pw a sp c r - a m p l i f i e d ，c l o n e di n t op m d l 8 - te a s y v e c t o ra n ds e q u e n c e d t h ed n as e q u e n c eo fo s b t f 3 pw a ss a m ea st h a tf r o mg e n o m eo fc v n i p p o n b a r ei nt h eg e n b a n kd a t a b a s e b i o i n f o r m a t i ca n a l y s i su s i n gp l a n t c a r ea n dp l a c ei n d i c a t e dt h a t t h e r ew e r es o m ep u t a t i v ec i s - e l e m e n t si nt h i sp r o m o t e r ，i n c l u d i n gc o m m o nc i s - a c t i n ge l e m e n t sa n d w - b o xe n h a n c e rr e g i o n s ，s o m ee l e m e n t si n c l u d i n gt cr i c hr e p e a ts e q u e n c e ，t c ab o x ，gb o x ，c a t t b o xi nr e s p o n s et os t r e s s ，s a l i c y l i ca c i d ，l i g h t ，s i g n a l sa n dc a a t - b o x e sa n ds oo n t h e r ew a sa l s oa l e a d e ri n t r o ns e q u e n c ei n c l u d i n gc a & t - b o x ，t c a - b o x ，i - b o xa n dg - b o xi nt h ep r o m o t e r 3 o s b t f 3 pf u s e di n 丘锄e 讯廿lt h eg u sg e n ea n dt h er e s u l t i n gc o n s t r u c t ( o s b t f 3 p ：g u s ) w a s t r a n s f o r m e di n t ot h er i c ec a l l it h r o u g ha g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n 3 9t r a n s g e n i cp l a n t so f r i c e ( t og e n e r a t i o n ) w e r es u c c e s s f u l l yo b t a i n e d 4 h i s t o c h c m i c a ls t r a i n i n ga n df l u o r o m e t r i ca s s a yi n d i c a t e dt h a tg u se x p r e s s i o ni sf o u n di nt h e o s b t f 3 p ：g u s - t r a n s f o r m e db u tn o n - t r a n s g e n i cc a l l i ( c o n t r 0 1 ) g u se x p r e s s i o ni sa l s oo b s e r v e di nt h e o s b t f 3 p ：g u s - t r a n s f o r m e dl e a fa n dr o o tt i s s u e s i n t e r e s t i n g l y , i nt h el e a ft i s s u e so fo s b t f 3 p ：g u s - t r a n g e n i cr i c e ，g u se x p r e s s i o ni so b v i o u s l yd e t e c t e do n l yi nt h ev a s c u l a rt i s s u e s ，b u tn o ti nt h e m e s o p h y l lt i s s u e s i ts u g g e s t st h a to s b t f 3 pi sav a s c u l a rt i s s u e s p e c i f i cp r o m o t e ro ff i c e 5 f l u o r o m e t r i cg u sa s s a ys h o w e dt h a tg u sa c t i v i t yi ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e di no s b t f 3 p ： g u s - t r a n g e n i cp l a n t so f r i c ea f t e ri n o c u l a t i o n 埘lx o o r s u g g e s t s t h a t o s b t f 3 p i sa p a t h o g e n i n d u c i b l ep r o m o t e ro ff i c e k e y w o r d s ：o s b t f 3 p ；g u sa c t i v i t y ；t i s s u es p e c i f i c i t y ；p a t h o g e ni n d u c t i v i t y ；r i c e 英文缩略表 英文缩写 m r n a c d n a d e p c i r i s s d s p c r m 叮r p c a m 、，3 5 s g u s n o s e d l a a m p k a n h y g 2 ，4 一d a s 6 一b a m s n b n a a a b a b p r p m o d t e m e d e b h r 英文全称 m e s s e n g e rr n a c d m p l e m e n t a r yd n a d i e t h y p y r o c a r b o n a t e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) s m i n o m e t h a n e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t c c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s3 5 sp r o m o t e r f l - g l u c u r o n i d a s e n o p a l i n es y n t h a s eg e n e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d a m p i c i l l i n k a n a m y c i n h y g r o m y c i n 2 , 4 - d i c h o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d a c e t o s y r m g o n e 6 - b e n z y l a m i n o p u r i n e m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m n 6m a c r o + b 5 m i c r o n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d a b s c i s i ca c i d b a s ep a i r r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e o p t i c a ld e n s i t y t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e e t h i d i u mb r o m i d e h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e v i 中文名称 信使r n a 互补d n a 焦碳酸二乙酯 三羟甲基氨基甲烷 十二烷基苯磺酸钠 聚合酶链式反应 脱氧核糖核苷三磷酸 花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子 伊葡萄糖苷酸酶 胭脂碱合成酶基因 乙二胺四乙酸 氨苄青霉素 卡那霉素 潮霉素 2 ，4 二氯苯氧乙酸 乙酰丁香酮 6 苄基嘌呤 m s 培养基 n 6 大量b 5 微量培养基 萘乙酸 脱落酸 碱基对 每分钟转数 光密度 四甲基乙二胺 溴化乙锭 过敏性反应 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 相毛易时间：瑚年f 月日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名：相墨易 导师签名：昊乡蛩瓤7 夕k 补 时间：瑚年月f 日 时间：上一矿年0 6 月66 日 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 水稻白叶枯病的研究概况 1 1 1 水稻白叶枯病 水稻白叶枯病是由水稻黄单胞杆菌水稻致病变种( x a n t h o m o n a so r y z a ep v o r y z a e ，x o o ) 侵染引起的重要水稻病害。在我国每年因此病造成的产量损失在1 0 以上( 方中达，1 9 9 0 ) 。 水稻白叶枯病是一种维管束病害，x o o 主要侵染水稻叶片，在自然条件下，通常由水孔或伤口 侵染，进入木质部，在其中繁殖，并向导管移动。一旦进入导管，x o o 将不断增殖，直至导管 被菌体和胞外多糖、黄原胶堵塞。如果在苗期或分蘖早期侵染，将会造成稻苗的萎蔫。如果 在后期侵染，病斑会沿着叶脉扩展，并逐渐变成灰绿色至黄色。水稻发病后，一般减产2 0 3 0 ， 在为害严重的田块，可以造成5 0 的减产( e z u k a e l 以，2 0 0 0 ) 。 在水稻白叶枯病病害诊断、病菌分离、流行学及病害防治方面都已有大量研究报导。根 据x a n t h o m o n a so r y z a e 和x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s 在卵磷脂活性、丙酸钠利用、菌体全蛋白、 脂肪酸侧链类型、寄主植物种类、寄生方式和致病表型等方面的差异，认定x o o 是禾本科植 物上的模式革兰氏阴性病原细菌( r o n a l de t a l ，2 0 0 2 ) 。 病原细菌基因组序列测定是了解病菌致病机制和限定寄主范围机制非常重要的一步。几 个重要的植物病原细菌全基因组序列已经测定，如a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ( w o o de ta 1 ， 2 0 01 ) 、p s e u d o m o n a ss y n n g a e ( b u e l le ta 1 ，2 0 0 3 ) 、r a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ( s a l a n o u b a te ta 1 ， 2 0 0 2 ) 、x a n t h o m o n a s ( a s t i d i o s a ( s i m p s o ne ta 1 。2 0 0 0 ) 。在x a n t h o m o n a s 细菌中，已经报道了 x a n t h o m o n a s a x o n o p o d i sp v c i t r i ( d as i l v ae ta 1 ，2 0 0 2 ) 全基因组序列。通过对基因组序列分析， 推测出了一些与致病性相关的基因。近年来，通过对x o o 致病相关基因的研究，人们对x o o 的致病机理以及与水稻互作分子基础的了解取得了较大进展。代表性的基因群有效应蛋白基 因、无毒基因( a v i r u l e n c eg e n e s ，a v r ) 、过敏性反应和致病性基因( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s ea n d p a t h o g e n i c i t yg e n e s ，h r p ) 、与胞外多糖和细胞壁降解酶产生有关的基因等。在植物病原细菌中， 由h r p 基因编码的i i i 型蛋白分泌系统( t y p ei i ip r o t e i ns e c r e t i o ns y s t e m ，t t s s ) 在非寄主或抗 性寄主上激发防卫反应和感病寄主上的致病性中起重要作用( l i n d g r e n ，1 9 9 7 ) 。一些h r p 蛋白 形成菌毛，推测其功能是形成通道运输效应蛋白如无毒因子进入植物( r o s s i e re ta 1 ，2 0 0 0 ) 。 除了t t s s ，i i 型分泌系统在分泌如胞外酶( 如木聚糖酶) 等其它毒性因子时起作用( x ue ta 1 ， 1 9 8 9 ；r a ye ta 1 ，2 0 0 0 ) 。与胞外多糖的合成有关的g u m 基因簇也是一种毒性决定因子 ( d h a r m a p u r i e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 随着水稻全基因组及水稻白叶枯病菌( x o o ) 全基因组测序的完成，为开展水稻与x o o 互 作机制研究奠定了坚实的基础。由于水稻与x o o 的互作符合基因对基因学说，因此也可以看作 是细菌病害的模式病害。目前对该病害的研究从理论上和应用上都取得了许多进展，主要表 现在以下几个方面：( i ) 从基因对基因学说角度解释寄主与病原菌的相互作用，通过遗传图谱 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 i l l 和物理图谱的构建，对抗性基因进行定位和克隆； ( i i ) 对克隆的白叶枯病抗性基因进行结构 和功能研究，寻找抗性基因作用的模式；( i i i ) 从分子水平研究自叶枯病抗性基因和无毒基因 的作用模式；( i v ) 从核酸水平和蛋白质水平研究白叶枯病抗性基因的形成和进化； ( v ) 利 用分子标记技术和转基因技术，针对水稻白叶枯病进行抗性育种( 刘小丰。2 0 0 6 ) 。 1 1 2 水稻抗白叶枯病基因的研究进展 抗性基因的鉴定是开展抗病育种的重要基础性工作。通过各国科学家的努力，现已经鉴 定t 3 0 个水稻抗白叶枯病基因。在这3 1 个基因中，2 2 个为显性基因) ，9 个为隐性基因； 5 个基因已经被克隆；其中x a 2 1 已经广泛应用于水稻抗白叶枯病转基因育种( 表1 ) ( 章琦，2 0 0 5 ： 金旭炜等，2 0 0 7 ) 。 表1 至2 0 0 7 年已鉴定的水稻自叶桔病抗性基因 t a b l e1 s u m m a r yo fr e s i s t a n c eg e n e st ob a c t e r i a lb l i g h ti d e n t i f i e di nr i c eu pt o2 0 0 7 鉴定基因 原命名 所骨苎尊 代表品种染色体 o r i g i n j l l( 小种) r e s et a t i v ev a r i e tchgene l d e n t i f i e dr e p r e s e n t a t i v ev a r i e t y c h r n a m e s t r a i n ( r a c e ) u s e d 物，日本菌株x 1 7黄玉，j a v a i 4 4 x d 2 x a 3 x a 4 j 函， x a 尹 x 口妒 x 口| o ) ( a l l 。 x a l 2 0 x a l 3 1 年 x a l 5 0 x a l 矿 x a l 尹 x a l 矿 x a l 少 x a 2 矿 x a 2 1 0 x a 2 2 ( t ) 。 日本x - t7 , x a - 1 4 x a w印尼菌株1 v 7 1 7 4 1 7 1 4 7 1 7 1 3 3 x a 4 b x a 6 。物9 x a 4 a x a p t x a t g 菲律宾菌p x 0 6 i ( 1 】 菲律宾菌p x 0 2 5 ( i ) 菲律宾菌p x 0 6 1 ( 1 ) 菲律宾菌p x 0 2 5 ( 1 ) 菲律宾菌p x 0 6 1 ( 1 ) 菲律宾菌p x 0 2 5 ( i ) 菲律宾菌p x 0 6 l ( i ) 菲律宾菌p x 0 6 1 ( i ) 菲律宾4 个小种 印尼菌系”1 4 7 印尼菌系x o 一7 3 0 6 ( v ) 菲律宾小种1 ，2 , 4 ，6 菲律宾小种3 ，5 日本小种i ，l i ，i i l ，l v 日本小种v 日本小种i i 缅甸菌株 6 个菲律宾小种 6 个菲律宾小种 菲律宾小种l ，2 , 4 ，6 2 r a n t a ie m a s 24 卑生爱国3 ，j a v a l 4 s e m o r am a n g g a z e n i t h s a t e n g t k m - 6 ，i r 2 0 ，i r 2 2 s i g a d i s d z l 9 2 j r l 5 4 5 - 3 3 9 d v 8 5 ，d v 8 6 ，d z 7 8 p 1 2 3 l1 2 8 c a s 2 0 9 i r 9 4 4 1 0 2 2 - 3 黄玉，j a v a l 4 b j l t n l m 4 1 诱变体 t e t e p 阿苏稔 i r 2 4 ，密阳2 3 ，丰锦 i r 2 4 的诱变体x m 5 i r 2 4 的诱变体x m 6 长药野生稻( i r b b 2 1 ) 扎昌龙 l i i l 5 6 未定位 l l 未定位 4 5 4 未定位 未定位 未定位 未定位 未定位 未定位 l l ll 中国农业科学院硕上学位论文第一章绪论 x a 2 3 菲律宾小种6 普通野生稻( c b b 2 3 ) i i x a 2 4 ( t )菲律宾小种1 , 2 , 4 , 6d v 8 5 ，d v 8 6 ，a u s 2 9 5未定位 x a 2 5 ( t ) 小粒野生稻7 8 1 5未定位 x a 2 5 菲律宾小种9明恢6 3 1 2 。 抗菲律宾小种l 、3 、4明恢6 3 体细胞 。 x a 2 5 ( t ) 。 和中国i v 型菌无性系突变体h x 3 未定位 和中国i v 型菌无性系突变体 一 x a 2 6 ( t ) 。 x a 2 6 ( t ) x a 2 7 ( t ) 以 x a 2 8 ( t ) x a 2 9 ( 矿 x a 3 0 l 阳 中抗菲律宾小种l 一3 抗菲律宾小种5 中国菌株j l 6 9 l 菲律宾小种2 、5 菲律宾小种2 菲律宾小种l p 6 ( p x 0 9 9 ) n e pb h a b o n g 明恢6 3 a r a i r a i i o t as a i l 药用野生稻 野生稻( y 2 3 8 ) 未定位 l l 6 未定位 l l i 。已克隆：成抗基因；“分蘖后期表达抗性 1 1 3 水稻白叶枯病互作感病基因的研究进展 根据基因对基因学说，人们推测与病原物毒性基因( v i r u l e n c eg e n e s ) 相对应，应该存在 感病基因。但迄今为止，有关感病基因的报道极为少见，尤其是水稻对勋d 的感病基因。y a n g 等首次报道了水稻中针对毒性基因p 胁勋朋勺感病基因傀8 留，为寄主植物与病原菌感病互作符 合基因对基因学说提供了实验证据o r a n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 。也为开展植物与病原菌的抗感病互作分 子机制研究提供了新的思路。 1 2 高等植物启动子的研究 1 2 1 引言 植物的生长发育和生命周期是不同的基因在时间和空间上有序表达的结果。因此高等植 物基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点和前沿。真核基因的表达调控是多级调 控系统，主要发生在三个彼此相对独立的水平上：转录水平的调控，决定某个基因是否会被 转录，并决定转录的频率；加工水平的调控，决定初始m r n a 转录物被加工为能翻译成多肽的 信使r n a 的途径：翻译水平的调控，决定某种m r n a 是否会真正得到翻译，如果能得到翻译， 还决定翻译的频率和时间长短( 翟中和等，2 0 0 0 ) 。其中，基因在转录水平上的调控是一个 最主要的控制点，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用。作为转录水平上的 一种重要的调控元件，启动子控制着植物基因表达的时间及空间特性。深入研究启动子的结 构和功能，建立可用于植物转基因表达的时、空、量三维调控系统，可为功能基因组学研究及 通过基因工程技术精确地调节植物代谢提供全新的思路( 李一琨等，1 9 9 8 ) 。 3 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 1 2 2 启动子的概念 植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是位于结构基因5 端上游区的d n a 序列，能指 导全酶与模板的正确结合，活化r n a 聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，并决定转录 的方向和效率以及所使用的r n a 聚合酶类型，是转录调控的中心( 路静，2 0 0 4 ；朱玉贤，1 9 9 7 ) 。 1 2 3 启动子的结构特征 高等植物启动子区域存在各种特征元件，通过r n a 聚合酶识别、结合，诱导转录过程。 在真核生物中已鉴定了多种特定的启动子序列，常常在基因转录起始位点5 近端的核苷酸序列 上游2 0 至- 2 2 0 b p 区域内，包括位于转录起始位点上游- 2 0 至3 0 b p 处的t a t a 框及8 0 至- 2 2 0 b p 处 的上游启动子元件。 1 转录起始位点 高等植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子( a t g ) 上游_ 4 0 至7 0 b p 处。j o s h i 通过对7 9 个高等植物基因启动子区d i n a 顺序的比较研究推衍出，植物a t g 密码旁侧的序列较 为保守，常为t a a a c a a l g g c t ，基因转录起始的保守顺序为c t c a t c a ，中间的a 为转录的起 始点，编号+ l ( j o s h i ，1 9 8 7 ) 。从基因转录起始点到翻译起始密码子之间的序列被称为5 端非翻 译区，该区的5 端是m r n a 前体加帽的位点。5 端非翻译区对翻译效率具有调控作用，此外在 一些植物基因的5 端非翻译区中有内含子存在，这些内含子有增强基因表达的作用。再者，转 录起始位点发生变化或缺失都会影响转录。 2 t a t a 框 t a t a 框是第一个被确定的r n a 聚合酶i i 的启动子元件，也是一些反式作用因子与d n a 相互作用的位点之一。植物启动子t a t a 框是位于转录起始位点上游一段富含a t 碱基对的序 列，与动物启动子略有不同， 其保守序列为t c a c t a t a t a t a g ( j o s h i ，1 9 8 7 ) 。t a t a 框依靠 与转录因子t f i id 的识别结合而发挥功能。介导决定r n a 聚合酶起始转录的位点，以及介导 前转录复合物的形成并起始转录；同时在一些启动子中该元件还决定转录的方向，或者介导 上下游元件对转录的调控作用。t a t a 框是绝大多数植物启动子正确启动转录所必需的，不含 t a t a 框的基因的精确转录受起始因子介导。 3 一般上游启动子元件 在真核基因启动子中普遍存在c a a t 框和c , - c 框两种元件，它们或者同时存在，或者只存 在其中之一，有时还是多拷贝的。但并非所有真核基因的启动子都存在着一般上游启动子元 件，例如在有些植物细胞中几乎不存在c a a t 框( f r i d l e n d e r e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 ( 1 ) c 丸盯框即在t a t a 框上游约5 0 b p 处的一段5 g c ( t c ) c a a t c t 3 顺序，其转录激活因 子是n f l 和c t f 等多种蛋白。c a a t 框具有增强基因转录的作用，对两个方向都可激活，而且 作用距离不定。从转录起始位点到c a a l 框附近这一区域通常被称为基础启动子。 ( 2 ) g c 框g c 框通常位于转录起始位点上游约- 9 0 b p 处，它可以处于t a t a 框与c a a t 框之 间，也可位于c a 觚框上游，位置因基因而异。其保守序列为5 g g g c c 3 ，可有多个拷贝， 4 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 并能以任何方向存在而不影响其功能。g c 框须与另一种特异的转录因子s p l 结合才能促进基 因转录。 1 2 4 启动子的类型 根据不同的分类原则，启动子可以分为以下几种类型： ( 1 ) 据启动子调控转录水平的高低可以将启动子分为强启动子和弱启动子。 ( 2 ) 从转录模式上来划分，启动子分为诱导型启动子、组成型启动子和组织特异表达启 动子( 路静等，2 0 0 4 ) 。 ( 3 ) 根据起始转录的方向可以将启动子分为双向启动子和可变启动子( 李一馄等，1 9 9 8 ) 。 双向启动子是指能以两个相反的方向启动转录，表现出双重启动子作用。 ( 4 ) 根据聚合酶能否直接识别，启动子分为r n a 聚合酶可以直接识别的启动子和需要 有蛋白质辅助因子存在才能与r n a 聚合酶结合的启动子。r n a 聚合酶可以直接识别的这类启 动子应当总是能被转录，但实际上也不尽如此。外来蛋白质可对其有影响，即该蛋白质可直 接阻断启动子，也可间接作用于邻近的d n a 结构，使聚合酶不能和启动子结合。需要有蛋白 质辅助因子存在才能与r n a 聚合酶结合的启动子在和聚合酶结合时需要有蛋白质辅助因子的 存在，这种蛋白质因子能够识别与该启动子顺序相邻或甚至重叠的d n a 顺序。 ( 5 ) 根据r n a 聚合酶的种类，将启动子分为i 类、j i 类和i i i 类启动子。由r n a 聚合酶 i 负责转录的r r n a 基因，其启动子为i 类。该类启动子比较单一。由r n a 聚合酶i i 负责转 录的i i 类基因包括所有蛋白质编码基因和部分基因，其启动子为i i 类启动子，该类启动子结 构最为复杂，不能单独起始转录，需要许多转录因子参与。由r n a 聚合酶负责转录的是 5 s r r n a 、t r n a 和某些核内小分子r n a ( s n r n a ) ，其启动子为i i i 类启动子。该类启动子组成 较复杂。 ( 6 ) 另外，在植物基因工程研究中为了增强外源基因在转基因植株中的表达效果，串联 启动子逐渐得到广泛应用，已有实践证明，用杂合启动子可以提高基因的表达效率 ( s c h m i t t - j o l m 甜a l ，1 9 9 2 ) 。 在进行启动子的分类过程中，某一启动子所属的类别并不是单一的，在不同的分类方法 中，它可能属于不同的类别。 1 2 5 启动子的克隆方法 真核基因的表达和调控是植物基因工程研究的中心内容之一，作为转录水平上一种重要 的调控元件，启动子控制着基因在特定组织、特定发育阶段以及一定环境条件下的表达。在基 因工程技术发展的今天，选择和利用合适的启动子工具，使目的基因的表达按照类似于生物体 内野生型基因的按需表达，逐渐成为植物基因工程的研究热点。用于分离、鉴别启动子的方 法主要有以下几种： 1 启动子探针质粒载体筛选启动子 启动子探针质粒载体法是一种筛选启动子的常用方法。其一般程序是：选择一种合适的 5 中国农业科学院硕十学位论文 第一章绪论 核酸限制性内切酶，消化基因组d n a ，将切割产生的d n a 限制片段群体与一种无启动子的质 粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在邻近报告基因上游的位置