（微生物学专业论文）小鼠白细胞介素17的克隆、表达及活性鉴定.pdf

i i i i ii i ii i itl l l ji i l liii y 17 8 7 3 5 8 目录 目录 中文摘要l 英文摘要i l 弓i 言1 1 1r a 的病因及治疗药物的研究进展1 1 1 1r a 的病因1 1 1 - 2r a 的治疗药物2 1 2 白细胞介素1 7 的结构特征及其生物学活性。4 1 2 1 白细胞介素1 7 的结构4 1 2 2 白细胞介素17 的受体。5 1 2 3 白细胞介素1 7 的生物学活性5 1 3 白细胞介素1 7 与疾病的关系：7 1 3 1 白细胞介素1 7 与类风湿性关节炎的关系7 1 3 2 白细胞介素1 7 与呼吸系统疾病的关系8 1 3 3 白细胞介素1 7 与神经系统的关系1 0 1 3 4 白细胞介素1 7 与器官移植后排斥反应的关系一1 0 1 3 5 白细胞介素1 7 与其他疾病的关系1 1 1 4 白细胞介素1 7 家族其他成员11 1 4 1 自细胞介素1 7 b 一1 l 1 4 2 白细胞介素1 7 c 1 2 1 4 3 白细胞介素1 7 d 1 2 1 4 4 白细胞介素1 7 e 1 2 1 4 5 白细胞介素1 7 f 1 3 1 5 小鼠白细胞介素。1 7 的结构及表达1 3 1 6 本研究的目的与意义1 3 2 材料15 2 1 实验材料1 5 2 2 克隆和表达载体。1 5 2 3 酶和生化试剂15 2 4 主要仪器和设备1 6 3 方法17 3 1 小鼠白细胞介索1 7 基因的克隆及序列分析1 7 3 1 1 经l p s 刺激的小鼠胸腺及脾脏细胞r n a 的提取1 7 3 1 2p c r 模板的制备1 7 3 1 3 小鼠成熟白细胞介素1 7 基因的p c r 扩增1 8 3 1 4p c r 产物的纯化18 3 1 5p c r 纯化产物与克隆载体的连接1 9 i r i 东北农业火学理学硕士学位论文 3 1 6 大肠杆菌感受态细胞的制备1 9 3 1 7 重组克隆载体的转化与质粒的提取1 9 3 1 8 阳性重组质粒的鉴定与测序2 0 3 2 重组原核表达质粒p h i s s u m oe x p r e s s s u m o - m l l 1 7 的构建2 0 3 2 1 目的基因片段的制备2 0 3 2 2 原核表达载体p h i s s u m oe x p r e s s 的制备2 1 3 2 3 原核表达载体p h i s s u m oe x p r e s s 与目的基因片段的连接2 2 3 2 4 重组原核表达载体的转化与质粒提取2 2 3 2 5 重组原核表达载体的酶切鉴定2 2 3 3s u m o - m l l - 1 7 融合蛋白在大肠杆菌中的表达2 3 3 3 1 阳性重组质粒转化表达宿主菌2 3 3 3 2 重组工程菌的鉴定2 3 3 3 3s u m o r a i l 1 7 融合蛋白在大肠杆菌中的表达。2 3 3 4 目的蛋白的纯化2 4 3 4 1n i n t a 纯化柱的平衡2 4 3 4 2 融合蛋白s u m o - m l l 1 7 的纯化2 4 3 4 3 成熟r a i l - 1 7 的纯化2 4 3 4 4n i - n t a 树脂的再生与保存2 5 3 5 重组原核表达质粒的p h i s s u m oe x p r e s s r a i l 17 构建。2 5 3 5 1 目的基因片段的制备2 5 3 5 2 原核表达载体p h i s s u m oe x p r e s s 的制备j 2 6 3 5 3 原核表达载体p h i s s u m oe x p r e s s 与目的基因片段的连接2 6 3 5 4 重组原核表达载体的转化与质粒提取2 6 3 5 5 重组原核表达载体的酶切鉴定及测序2 7 3 6 小鼠白细胞介素1 7 成熟蛋白在大肠杆菌中的表达。2 7 3 6 1 阳性重组质粒转化表达宿主菌2 7 3 6 2 重组工程菌的鉴定2 7 3 6 3 小鼠白细胞介素1 7 成熟蛋白在大肠杆菌中的表达2 7 3 7 目的蛋白的纯化2 8 3 7 1h i l o a d1 6 6 0s u p e r d e x7 5p g ( g e ) 柱的平衡及保存2 8 3 7 2 成熟m l l - 17 的纯化2 8 3 8w e s t e r nb l o t 检测r a i l 17 的特异性2 9 3 9 在细胞水平上检测重组成熟m l l - 1 7 蛋白的生物活性2 9 3 9 1r e a l t i m e p c r 检测引物的设计2 9 3 9 23 t 3 - l i 前体脂肪细胞的培养与刺激3 0 3 9 3r e a l t i m e p c r 鉴定蛋白活性3 0 3 1 0 在动物水平上检测重组成熟r a i l 1 7 蛋白的生物活性3 1 3 1 0 1 鸡i i 型胶原与完全弗氏佐剂混和乳化剂( c 认) 的制备3 1 目录 3 1 0 。2 大鼠i l 型胶原诱导的关节炎模型的建立3 2 3 1 0 3r a i l - 1 7 的注射3 2 3 1 0 4 踝关节组织的采集3 2 4 实验结果3 3 4 1 小鼠白细胞介素一1 7 ( m l l - 1 7 ) 成熟多肽基因的克隆3 3 4 1 1 小鼠白细胞介素1 7 成熟多肽基因的r t - p c r 扩增。3 3 4 1 2 重组克隆质粒p m d l 8 - t - m l l 1 7 的鉴定3 3 4 1 3 小鼠白细胞介素1 7e d n a 序列测定与结果分析3 4 4 2 重组原核表达载体的构建3 4 4 2 1p h i s s u m oe x p r e s s 表达载体和m l l 1 7 基因插入片段的制备3 4 4 2 2 阳性重组质粒的筛选与鉴定3 5 4 2 3 阳性重组工程菌的筛选与鉴定3 5 4 3 小鼠白细胞介素1 7 蛋白在大肠杆菌中的表达3 6 4 3 1s d s p a g e 确定s u m o - m l l 17 的表达形式及最佳诱导条件3 6 4 - 3 2s d s p a g e 确定m l l 一1 7 的表达形式及最佳诱导时间3 7 4 4 目的蛋白的纯化j 3 8 4 4 1s u m o m l l 17 融合蛋白的纯化、酶切及分离3 8 4 4 2m l l - 17 成熟蛋白的纯化3 8 4 5w e s t e r nb l o t 检测一3 9 4 6 细胞水平上检测重组成熟m l l 1 7 蛋白的生物活性3 9 4 7 动物水平上检测重组成熟m l l 1 7 蛋白的生物活性4 0 4 7 1 实验动物的临床症状4 0 4 。7 2 组织病理学变化4 1 5 讨论4 4 5 1p c r 模板的制备4 4 5 2 表达载体的选择和构建4 4 5 3 目的蛋白的纯化4 5 5 3 1 融合蛋白的纯化4 6 5 3 2 包涵体的纯化。4 6 5 4 目的蛋白的活性检测4 7 5 4 1 在细胞水平上检测重组成熟m l l 。1 7 蛋白生物活性4 7 5 4 2 在动物水平上检测重组成熟r a i l 1 7 蛋白生物活性4 7 6 结论4 8 j g 谢4 9 参考文献5 0 附录a 5 8 附录b 5 9 附录c 6 0 ol，ol【 东北农业大学理学硕j ：学位论文 附录d 6 1 攻读硕士学位期间发表的学术论文6 3 j1ij】- c o n t e n t s 皇詈暑曼曼! ! 暑! 皇! ! 皇詈皇! 曼! ! 鼍i 1 l l i i 鼍鼍曼苎詈皇 c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t i 1i n t r o d u c t i o n l 1 1a d v a n c eo f t h ec a u s eo f r aa n dt h ed r u g sf o rr a l 1 1 1t h ec a u s eo f f l a 1 1 1 2 t h e d r u g s f o r r a 2 1 2t h es t r u c t u r ec h a r a c t e r i s t i e sa n db i o a e t i v i t yo fi l 17 4 1 2 1t h es t r u c t u r eo f i l 一1 7 4 1 2 2t h er e c e p t o ro f i l - 1 7 5 1 2 3t h eb i o a c t i v i t yo f l l 一17 5 1 ：；i l ：，- 1 7a n dd i s e a s e s ，7 1 3 1t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ni l 一1 7a n dr h e u m a t i o da r t h t i t i s 7 1 3 2t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ni l 1 7a n dr e s p i r a t o r ys y s t e m _ 8 1 3 3t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ni l 17a n dn e r v o u ss y s t e m 1 0 1 3 4t l h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ni l 一17a n di m m u n o l o g i c a lr e j e c t i o n 10 1 3 5t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ni l 1 7a n do t h e rd i s e a s e s 1 1 1 z ii i 。1 7f a m i l y 1 1 1 4 1i l 1 7 b ll 1 4 2i l ，- 1 7 c ：j 1 2 1 4 3i l 1 7 d 1 2 1 4 4i l 1 7 e 1 ：1 1 4 5i l 17 f 13 1 5t h es t r u c t u r ec h a r a c t e r i s t i c sa n de x p r e s s i o no f t h em o u s ei l - 17 。1 3 1 6o b j e c t i v eo f t h i sr e s e a r c h 1 3 2m a t e r i a l s 15 2 1e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 1 5 2 2c l o n i n ga n de x p r e s s i o nv e c t o r s 15 2 3e n z y m e sa n db i o c h e m i c a lr e a g e n t 15 2 4a p p a r a t u s e s l6 3m e t h o d s 17 3 1c l o n i n ga n ds e q u e n c i n ga n a l y s i so f t h em i l 1 7c d n a 。1 7 3 1 1e x t r a c t i o no f r n a o f t h e m o u s e t h y m u s a n ds p l e e nc e l l s t h a ts t i m u l a t d e b y l p s 1 7 3 1 2p r e p a r a t i o no f p c rt e m p l a t e 17 3 1 3p c ra m p l i f i c a t i o no f m o u s em a t u r ei l 1 7 1 8 v 。l r 一 东北农业大学理学硕上学位论文 3 1 4p u r i f i c a t i o no f p c rp r o d u c t s 1 8 3 1 5l i g a t i o no fp u d f i c a t i o np r o d u c t sa n dp h i s s u m oe x p r e s sv e c t o r 19 3 1 6p r e p a r a t i o no f c h e m i c a lc o m p e t e n te c o i lc e l l s 1 9 3 1 7t r a n s f o r m a t i o na n dp r e p a r a t i o no f r e c o n b i n a n tc l o n i n gp l a s m i d 1 9 3 1 8i d e n t i f i c a t i o na n ds e q u e n c i n go f p o s i t i v er e c o m b i n a n tp l a s m i d 2 0 3 2c o n s t r u c t i o no f r e c o m b i n a n tp h i s s u m oe x p r e s s - s u m o - m l l - 1 7 一2 0 3 2 1p r e p a r a t i o no f t h et a r g e tg e n ef r a g m e n t 2 0 3 2 2p r e p a r a t i o no f p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp h i s s u m o e x p r e s s 2 1 3 2 3l i g a t i o no fp h i s s u m oe x p r e s sv e c t o ra n dt a r g e tg e n ef r a g m e n t 2 2 3 2 4t r a n s f o r m a t i o na n dp r e p a r a t i o no f r e c o m b i n a n tp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r 2 2 3 2 5i d e n t i f i c a t i o no fp o s i t i v er e c o m b i n a n tp l a s m i d 2 2 3 3e x p r e s s i o no f s u m o m l l - 1 7f u s i o np r o t e i ni ne c o l i ，2 3 3 3 1t r a n s f o r m a t i o no f p o s i t i v er e c o m b i n a n tf o re x p r e s s i o n 2 3 3 3 2i d e n t i f i c a t i o no f p o s i t i v er e c o m b i n a n te n g i n e e r i n gb a c t e r i a 2 3 3 3 3e x p r e s s i o no f s u m o m l l 1 7f u s i o np r o t e i ni ne c o l i 2 3 3 4p u r i f i c a t i o no f t h et a r g e tp r o t e i n 2 4 3 4 1p r e p a r a t i o no f n i - n t ac o l u m n 2 4 3 4 2p u r i f i c a t i o no fs u m o m l l 一17f u s i o np r o t e i n 2 4 3 4 3p u r i f i c a t i o no f m a t u r em i i 。- 1 7p r o t e i n 2 4 3 4 4r e g e n e r a t i o no f n i - n t ac o l u m n ：2 5 3 5c o n s t r u c t i o no f r e c o m b i n a n tp h i s s u m oe x p r e s s - m l l 一1 7 2 5 3 5 1p r e p a r a t i o no f t h et a r g e tg e n ef r a g m e n t 2 5 3 5 2p r e p a r a t i o no f p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o rp h i s s u m oe x p r e s s 2 6 3 5 3l i g a t i o no fp h i s s u m oe x p r e s sv e c t o ra n dt a r g e tg e n ef r a g m e n t 2 6 3 5 4t r a n s f o r m a t i o na n de x t r a c t i o no fr e c o m b i n a n tp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r 2 6 3 5 5i d e n t i f i c a t i o na n ds e q u e n c i n go f p o s i t i v er e c o m b i n a n tp l a s m i d 2 7 3 6e x p r e s s i o no f r e c o m b i n a n tm o u s em a t u r ei l - 1 7i ne c o i l 2 7 3 6 1t r a n s f o r m a t i o no f p o s i t i v er e c o m b i n a n tf o re x p r e s s i o n 2 7 3 6 2i d e n t i f i c a t i o no f p o s i t i v er e c o m b i n a n te n g i n e e r i n gb a c t e r i a 2 7 3 6 3e x p r e s s i o no fm o u s em a t u r ei l 17p r o t e i ni ne c o l i 2 7 3 7p u r i f i c a t i o no f t h et a r g e tp r o t e i n 2 8 3 7 1k e e p i n ga n db a l a n c i n go f h i l o a d1 6 6 0s u p e r d e x7 5p g ( g e ) 2 8 3 7 2p u r i f i c a t i o no f t h et a r g e tp r o t e i n 2 8 3 8w e s t e r nb l o t 一2 9 3 9b i o a c t i v i t ya s s a yo fr e c o m b i n a n tm o u s em a t u r ei l 一17o nt h ec e l l u l a rl e v e l 2 9 3 9 1p r i m e r sd e s i g nf o rr e a l t i m e p c r 2 9 3 9 2c u l t u r ea n ds t i m u l u so f 3 t 3 l 1p r e - a d i p o c y t e s 3 0 3 9 3r e a l t i m e p c rt oa s s a yt h er m l l 一1 7b i o a e t i v i t y 3 0 c o n t e n t s 3 10b i o a c t i v i t ya s s a yo f r e c o m b i n a n tm o u s em a t u r ei l 17o nt h ea n i m a ll e v e l 31 3 1 0 1p r e p a r i n gt h em i x t u r eo f c h i c k e nt y p ei ic o l l a g e na n dc o m p l e t ef r e u n d sa d j u v a n t 3 1 3 1 0 2e s t a b l i s h m e n to f t h er ar a tm o d e li n d u c e db yc h i c k e nt y p ei ic o l l a g e n 3 2 3 1 0 3j n i e c t i o no f m l l - 1 7p r o t e i n 3 2 3 1 0 4c o l l e c t i o no f t h ea n k l e j o i n t 3 2 4r e s u l t s i3 3 4 1c l o n i n go f t h eh u m a nm a t u r ei l 1bc d n a 3 3 4 1 1p c ra m p l i f i c a t i o no f m o u s em a t u r ei l 1 7 3 3 4 1 2i d e n t i f i c a t i o no f p o s i t i v er e c o m b i n a n tp l a s m i dp m d l8 t - m i l 一17 3 3 4 1 3s e q u e n c i n ga n da n a l y s i so f c d n ao f m a t u r em l l - 1 7 3 4 4 2c o n s t r u c t i o no f r e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o r 3 4 4 2 1p r e p a r a t i o no f p h i s s u m oe x p r e s sa n dt h em l l 一17g e n e 3 4 4 2 2i d e n t i f i c a t i o no f p o s i t i v er e c o m b i n a n tp l a s m i d 3 5 4 2 3i d e n t i f i c a t i o no f t h ee n g i n e e r e db a c t e r i a 3 5 4 3e x p r e s s i o no f r e c o m b i n a n tm l l - 1 7i ne c o l i 3 6 4 3 1s d s f a g ea n a l y s i so f s u m o m l l - 1 7f u s i o np r o t e i ne x p r e s s i o n 3 6 4 3 2s d s - p a g ea n a l y s i so f m i l - 1 7m a t u r ef u s i o np r o t e i ne x p r e s s i o n 3 7 4 4p u f i f i c m i o no f t h et a r g e tp r o t e i n 3 8 4 4 1p u r i f i c a t i o na n dd i g e s t i n go ft h es u m o m l l 一17f u s i o np r o t e i n 3 8 4 4 2p u r i f i c a t i o no f t h em o u s em a t u r ei l 17 _ 3 8 4 5w e s t e r nb l o t 3 9 4 6b i o a c t i v i t ya s s a yo f r e c o m b i n a n tm o u s em a t u r ei l - 1 7o nt h ec e l l u l a rl e v e l 3 9 4 7b i o a c t i v i t ya s s a yo fr e c o m b i n a n tm o u s em a t u r ei l 17o nt h ea n i m a l1 e v e l 4 0 4 7 1c l i n i c a ls y m p t o m so f t h ee x p e r i m e n t a lr a t s 4 0 4 7 2h i s t o p a t h o i o g i c a lc h a n g e s 4 1 5d h c u s s i o n s 4 4 5 1p r e p a r a t i o no f p c rt e m p l a t e 4 4 5 2e x p r e s s i o nv e c t o rs e l e c t i o na n dc o n s t r u c t i o n 4 4 5 3p u r i f i c a t i o no f t a r g e tp r o t e i n 4 5 5 3 1p u r i f i c a t i o no f f u s i o np r o t e i n 4 6 5 3 2p u r i f i c a t i o no f i n c l u s i o nb o d y 4 6 5 4b i o a c t i v i t ya s s a yo f t a r g e tp r o t e i n 4 7 5 4 1b i o a c t i v i t ya s s a yo f r e c o m b i n a n tm o u s em a t u r ei l 1 7o nt h ec e l l u l a rl e v e l 。4 7 5 4 2b i o a c t i v i t ya s s a yo f r e c o m b i n a n tm o u s em a t u r ei l - 1 70 1 1t h ea n i m a l1 e v e l 4 7 6c o n c l u s i o n s 4 8 a c k n o w l e d g e m e n t 4 9 r e f e r e n c e s 5 0 a p p e n d i xa 5 8 r i ， a p p e n d i x b 5 9 a p p e n d i xc 6 0 a p p e n d i xd 6 1 p u b l s h e da n c l ed u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e e o f s t e r 6 3 一】 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论支作者签名：承璜疋日期：州d 年石月g 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：孤蒋l 日期：2 相年多月日 导师签 日期：少办年歹月罗日 一 摘要 白细胞介素。1 7 是近些年来发现的一种强大的前炎症细胞因子，它与受体结合后可诱导 表达多种细胞因子和粘附分子，而这些分子在造血、炎症、免疫的不同阶段具有不同功能。 i l 1 7 同时也是炎症反应的微调因子，它的过量和不足均会引起疾病。研究发现它除了参与 机体免疫调节外，在很多不同疾病( 类风湿性关节炎、肠道炎症、系统性红斑狼疮、移植后 免疫排斥反应等) 尤其是在类风湿性关节炎中发挥了重要的作用。目前虽然有一些针对类风 湿性关节炎( r a ) 的药物，但并不能达到完全抑制病程发展的效果，因此研制更有效的治疗 药物将是医药工作者的迫切任务，鉴于i l 1 7 在炎症疾病中的重要作用，因此对i l 1 7 的研 究工作也就更显其深远意义。 本实验是研制治疗类风湿性关节炎新型抗体药物的一部分，目的在于表达出具有生物学 活性的r o l l - 1 7 蛋白，为动物药理学实验做好准备工作。 本研究我们利用逆转录p c r 技术从经r h i l 1b 免疫的小鼠胸腺e d n a 中克隆得到了 m l l 1 7 成熟蛋白基因，测序分析结果表明其开放阅读框为4 0 2 b p ，编码1 3 4 个氨基酸。与 g e n b a n k 上