（草业科学专业论文）近红外光谱技术在燕麦种子活力测定中的应用研究.pdf

摘要 种子质量问题是我国牧草种子生产的主要限制因素之一，牧草种子劣变是导致牧草种子质量 下降的主要原因由于牧草种子劣变涉及到牧草育种、牧草种子生产管理措施、牧草种子加工贮 藏技术等多方面的内容，并且种子活力与种子劣变具有相关性，种子活力随种子劣变程度的加深 而降低一些常规的牧草种子活力测定方法不仅需要对种子进行一系列的前处理，操作繁琐，周 期长，而且种子本身也被破坏，无法再利用，在不同程度上限制了牧草种子活力的快速检验因 此，建立牧草种子活力的快速、非破坏的测定方法，无论是基于生产实际，育种、种子的贮藏都 有重要的意义 试验利用t h c r m oe l e c t o n ( 美国) 的傅里叶变换近红外光谱仪( a n 协r i s ) 获得燕麦种子的近红 外光谱，采用主成分分析一马氏距离模式识别方法建立模型，对不同活力水平的燕麦种子进行聚 类分析，并探讨了不同的预处理方法、不同的主成分个数及不同光谱谱区对模型的影响试验主 要包括2 个方面的内容：采用人工加速老化处理燕麦种子，筛选出燕麦种子的老化条件即获得不 同活力水平的燕麦种子；探讨近红外技术测定牧草种子活力的测定程序，从而建立测定牧草种子 活力的数学模型以致确定测定种子活力的近红外技术要求 试验采用人工加速老化方法来使种子产生不同程度的劣变，获得不同劣变程度的燕麦种子， 井筛选出适合燕麦种子的老化条件，在4 2 下老化处理3 6 h 为最佳条件选定两个序列来获得不 同老化程度的种子来采集光谱，一为时间序列。在4 2 下将燕麦种子分别老化处理o h 、4 8 h 、9 6 h i 一为温度序列，在4 0 、4 2 、“、4 6 将燕麦种子分别老化处理3 6 h 试验利用近红外光谱结合主成分分析与马氏距离模式的识别方法对不同活力水平的种子进 行定性分析，能够迅速对样品做出正确归属根据模型的误判数指标来选择模型的谱区范围、处 理方法及主成分个数，最后确定了在鉴别分析4 种不同活力水平种子的谱区范围、处理方法及主 成分个数分别为4 0 0 0 c m l 6 9 0 0 c m a 、s n v 处理、1 1 个主成分；鉴别分析3 种不同活力水平种子 的谱区范围、处理方法及主成分个数分别为4 0 0 0 c m - 1 6 9 0 0 c m 1 、s n v 处理、6 l o 个主成分； 鉴别分析2 种不同活力水平种子的谱区范围、处理方法及主成分个数分别4 0 0 ( ) c l n 1 6 9 0 0 c m 1 、 s n v 处理、3 6 个主成分本试验利用近红外光谱技术为快速准确无损测定种子活力提供了一 条新途径 关键词。燕麦，种子活力，近红外光谱，主成分分析，马氏距离 a b s 仃a c t o n co ft l a em a i nl i m i t i n gf i l e t o r sf o rf o r a g e | c e dl , r o d u i st h es e o dq i | a l i t yp r o b l e m s e e d d 删。瑚舢i s 由cm a i n 代黾蛳w h i c h u s 臀t b es e e dq t l a l i t yd e e r e a s 缸b c c l l u s ct l a c 翱矧d c t c r i o n a t i o n i n v o l v e sf o r a g eb r e 目l i n gs c c dl l _ o d u c l j o nc o n t r o lm c a 目l r oa n ds e e dl x o e , e s sh o a r d i n gt c e l a n i q u e t h e i sr e l a t i o m l a i pi 僦 w c c ns e e dv i g o u rw i t hs e e dd e t e a i o r a l i o n , a n d | e e dv i g o u rd o a 屯硼w i t hi e e d d e t n r i o t a t c d 啊地g a a e r n l m e t h o d o f t h es e e d v i g o u r t e s t n o t o n l y n e e d t o c i t i t y o n as e r i e s t r e a m a a a t , a n d t e d i o u s 叩a a l 岛l o n g e r d m a l i o n , l i n t a l s o t l a o s e e d w i l l b e b r o k e n 1 n l i s 。e e dv i g o m t e s t l i m i t f o r a g os e e d f a s tt e s to f v i g u o r t l a e r e f o r e , i ti si m p o r t e rf o rf o r a g eb r e e d i n g8 e e dp l _ o ( 1 u c l i o n 锄ds e e dh o a r d i n gt o b u i l du par a p i dn n da o n - d e s t r a e t i wm e t h o do f f o r a g e 鲥v i g o u rt e s t i n t h i s m a y , n e a r i l f f r a r e d s p h 雠m o r d s o n o a ts e c d s u s i n g f r ( f i l t e r t r a 珊f o r m n e a r h 丘砌 s l 埒曲m e t a 嘎t h cd i f f e a tv i g o u to fo a ts e e d s 啪b eq u a l i t a t i v ed u s t e rb ym o d e l sw h i c h 峨i t l e 删p a lc o m l a e n t sn n a l y s i sa n dm a h a l a n o b i s d i s t a n c et om o d e l se s t a b l i s h e d t h e s i sd i s c u s s d i f f e m n t l , z i n e i p a l c o m p o j l e t l t f a e t o m 、p _ q 蚋) c e 铝i n g m e t h o d s 、o p t i m l l i nr a n g e o f s l ，c c i m m l i n f l u e l a o f t h em o d e l 1 kt h e s i si n c l u d et w oc o n t e n t s e s ：o p c i m i t h en e e e l e r a t e da g i n gc o n d i t i o no f t h eo a ts e e d s a n dn e q u i r e sd i f f e a e t l tv i g o u ro a ts e e d s ；b u i l du pq u a l i t a t i v em o d e io fv i g o u rt e s ta n ds t u d yt h e v i g o u r t e s tp l o d i l b y n i r s t h es u i t a b l et e m p e r a t u r eo f 从( a c c e l e r a t e da g i a g ) t r e a t m e n tf o ro a ts e e d sw a s4 2 f o r3 6 1 1 1 o a c q u i r e 嘶d i f f e t 吼tc x t e l l td e t e r i o r a t e ds e e d s ，s e e d s ：p e dt oa at r c a t m c n l sa td i f f e r e n tt e m 球拍脚 a n dt l , n e s t m a e s 嗍溉迅w c i es e p a r a t ca c c e l e r a t e da g e df o ro h4 8 1 a9 6 ha t4 2 。t e a p e r n t u r c s e q u e n c e , s e e d sm s e l m a t ea e e e l e r a t la g e df o r3 6 ha t4 0 4 2 4 4 1 24 6 1 2 t h er e s t t l ts h o wt h a tp r i n c i 础c o m p o n e j t l t sa n a l y s i sa n dm a h a l n o b i s d i s t a n c et e c h n i q u em p r o v i d e t h er e a s o t l a b l cc l u s t e r i n go ft h ed i f l 砌v i g o u ro fo a ts e e d sa n dc b eu s e dt oa n a l y z em ed i f f e - r e t l t v i g o t t ro a ts e e d sq u a l i t a l i w t h er e s u l ts h o w e dt h a ti nt l a cs p e c t r a lr e g i o nb e t w e 4 0 0 0a n d6 9 0 0 , z m 。 p r e p r o e e s s i n go fs n v ( s t a n d a r d n o n m lv a r i a t c ) t h cm o d e lo fd i s t i n g u i s h e do ff o u rd i f f e r tv i g o t l t 惴t h e b e 8 t w i t h l l p r i n c i p a l c o m p o n e n t f a c t o r ；t h e r e s u l t s h o w e d l h 砒i n t h e s l , c a r a l r e g i o n 4 0 0 0a n d 6 9 0 0 e m - 1 b c 相，e p r e l x o e e s 血g o f s n v ( s t a n d a r d n o r m a l v a r i a 妨t h e m o d d o f d i s t i n g u i s h e d o f t h r c o d i f f e r e n tv i g o u r y t h eb e s t w i t h6 l o p r i n c i p a lc o m p o n e l l t 囱咖s 零m t h 啦m o 贿i nt l a os p e c t r a lr e g i o n b 融w 啪4 0 0 0a n d6 9 0 0 e m 。i x , e p r o e e s s i n gm e t h o do fs n v ( s t a n d a r dn o r m a lv a r i a t c ) t h em o d e lo f , t i s t i n g u i s h e do ft w od i f f e r tv i g o u rw a 8t h eb e s tw i t h3 6p r t n e i l lc o m p o n e n tf l l e t o n l an 。wi d e a a b o u t 州c ka n d 弘妇a n dn o n - d e s m l e t i v ea n a l y s i so f s e e dv i g o u rw 硝o f f e r e d 1 k e y w o r d l slo a t , s e e dv i g o u r , n e a r - i n f r a r e dl p 蜘粥c o p y l r i n e i p a lc o m p o n e n t sn n a l y s i s ， m a h a l m o b i s d i l l t a n c e h 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意 签名卿期劫 帆川年万月心日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 一签礴弦彭帆岬年口心日 聊鹤多砂扛蝴。寸加，日 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 第一章前言 种子活力( s e e dv i g o u r ) 是决定种子或种子批在萌发和出苗期间活性和表现水平的所有特性 的总和( 陶嘉龄和郑光华，1 9 9 0 ，是反映种子质量劣变的主要指标之一活力测定可反映种子在 田间或贮藏条件下的潜在质量表现( h a m p t o n ，1 9 9 5 ) ，在种子质量管理中具重要意义种子的劣 变将导致种子的活力、贮藏能力及田问建植能力等质量因素下降，从而造成很大的经济损失据 统计，在美国，每年生产的种子中，有2 5 的种子质量问题，造成的经济损失价值可达5 亿美元 在全世界范围内，种子劣变造成的经济损失将更加巨大( m 由l o n a l d ，1 9 9 9 ) 种子劣变是降低种子的生存能力，从而导致种子丧失活力及发芽力的不可逆变化种子劣变 是种子作为一个活的有机体必须经历或完全丧失活力，这是一个由量变到质变的过程，具有不可 逆、不可避免和群体问不相同等特点( d e l o u c h e ，1 9 7 3 ) 许多研究表明，随着种子劣变的加深， 种子自身的能量合成、呼吸强度及生物合成能力都会发生明显的下降，染色体发生畸变、d n a 发生降解、r n a 和蛋白质的合成、酶的活性及细胞膜都会发生变化( m c d o n a l d ，1 9 9 9 ；s m i t h ， 1 9 9 5 ：m a r o o s - f i l h ，1 9 9 8 ；w a i t e r s ，1 9 9 8 ) 在种子劣变的过程中也会发生一些生化变化，而这 些变化往往会引起不饱和脂肪酸和有毒物质( 酵类、醛类、酮类、酸类) 的增加，另外还会引起 蛋白质、淀粉、可溶性糖、磷脂脂肪酸等吉量的降低( h a r r i n g t o n ，1 9 7 3 ；b l a n c h e ，1 9 9 0 ；m a , m a v a ， 1 9 9 4 ：g a l p m ，1 9 9 5 ；s e a g ，1 9 9 4 ；蛐，1 9 9 5 ) 在生产实践中，由于牧草种子粒小、休眠度高等，更不易取得理想的田问建植，因而更需要 进行活力测定( h a m p t o n ，1 9 9 9 ) 而现有的活力测定方法如发芽速度与幼苗生长测定( 浦心春， 1 9 9 3 ) 、冷冻测定( 孙建华，1 9 9 0 ) 、人工老化测定( h a l l ，1 9 9 0 ) 、册含量测定( 浦心春，1 9 9 3 ) 等都对种子本身造成不同程度的伤害因此，随着种子活力逐渐受到人们的重视，快速而且不破 坏种子的活力检测方法( 黄真池和黄上志，1 9 9 8 ；张宝恩和黄上志。1 9 9 9 ；李灵芝等，2 0 0 2 ) 逐 渐成为研究的热点 1 1 国内外牧草种子活力测定方法的研究现状 近几十年来，牧草种子的活力在我国也逐渐得到了人们的重视，建立的牧草种子活力测定方 法可概括为直接测定法和间接测定法 1 1 1 直接测定法 直接测定法就是模拟田问不良条件来观测种子的出苗能力或种苗生长速度现在列入国际种 子检验协会( i s t a ) 的方法有发芽速度测定、幼苗生长测定、冷冻测定和加速老化测定等，这类 方法简单易行。重复性好 1 1 1 1 发芽速度与幼苗生长测定 种苗生长评价测定现有两种发展方向。一个是种苗长度的测定，一个是种苗评定测定( 浦心春 和韩建国，1 9 9 3 ) 多数研究常用发芽速度和幼苗生长来判断牧草种子活力，尤其是在豆科和禾 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 本科牧草中，白春霞等( 2 0 0 6 ) 认为幼苗生长试验可用于多花木兰和二色胡枝子种子h a m p t o n 和t e k r o n y ( 1 9 9 5 ) 认为，幼苗生长试验在羊茅属和黑麦草牧草种子中也可以应用多数研究表 明发芽速度和幼苗生长与种子活力成正相关( r a d w a n ，1 9 7 8 ；l a w r e n c e ，1 9 6 3 ) 但在一些研究 中发现发芽速度和幼苗生长与活力呈弱相关或不相关的趋势m c d o n a l d ( 1 9 7 5 ) 曾指出发芽速度 测定不应该用于休眠种子的活力测定。玉柱等( 1 9 8 9 ) 人认为此种测定不适用紫花苜蓿种子、红 豆草和扁蓿豆种子 1 1 1 2 冷冻测定 冷冻测定最早是测定玉米种子的活力。主要是模拟田问的逆境低温条件来浏定种子的出苗能 力孙建华和陈江辉( 1 9 9 0 ) 在用冷冻测定紫花苜蓿种子批活力时试验结果表明处理过的种于 其活力明显提高且硬实种子减少，尤其低活力或硬实率高的种子，经冷冻后其鲜重及简化活力指 数比对照明显提高 i 1 1 3 人工老化测定 人工老化是在高温伸d 4 5 c ) 、高湿( 相对湿度1 0 0 ) 的条件下处理种子，人工加速种子的 老化，以老化后种子的发芽率作为活力值在牧草种子活力评价方面，已用于红三叶，雀麦、黑 壹草、羊茅和草芦属等种的测定( 脚m c k e e ，1 9 6 8 ；h a l l 和w i 嘲1 9 9 0 ) ，并证明与活力 密切相关，韩建国等( 1 9 9 8 ) 在高羊茅等种的测定上也采用了人工老化铡定但是由于牧草种子 粒小、吸湿快，在老化处理以后易生霉、腐烂。而且老化试验易受温度和老化后含水量的影响 m c d o n a l d ( 1 9 9 9 ) 的研究中建议用饱和食盐水代替自来朱，可控制老化时的相对湿度在8 0 以下， 便于小粒种子的活力测定 1 1 2 间接测定法 间接测定法即采用生理生化测定方法，常用的方法有a t p 含量测定、酶活性的测定、1 1 c 法、 葡萄糖代谢的测定、呼吸强度的浏定、电导率法等 1 1 2 1 电导率法 电导率法已经被i s t a 推荐为大豆种子的活力测定方法电导率法测定的原理是测定种子细胞 的完整性、活力高的种子渗出的可溶物少，浸泡液的电导率低，活力低的种子渗出的可溶物多， 浸泡液的电导率高已有报道电导率可有效地评价三叶草、紫花苜蓿、百脉根、扁蓿豆、红豆草、 柠条和花棒等豆科牧草种子在高羊茅( 韩建国，1 9 9 5 ) 和多叶鹅观草( 孙丽萍，1 9 9 1 ) 种子能 收到良好的效果，沈永( 1 9 9 8 ) 在对箭售豌豆的研究中发现，箭舌豌豆种子渗出物质如磷、还原 糖和氨基酸等随种子活力的下降迅速增加 1 1 2 3 呼吸强度测定法 种子吸水时呼吸速率上升并且加剧，呼吸速率的大小与种子活力有一定的关系研究表明， 高、中等活力的白菜种子与低活力的种子可以根据吸胀初期的呼吸速率的大小明显区别开，种子 吸胀初期的呼吸速率则与种子活力呈明显的正相关( 黄真池和黄上志，1 9 9 8 ) ，扁蓿豆、红豆草、 紫花苜蓿( 玉柱等，1 9 8 9 ) 以及多花黑麦草( m a r s h a l l ，1 9 8 5 ) 的种子的呼吸耗氧速率与田间出 苗率显著相关在许多研究中发现呼吸强度和种子活力有一定的关系( s h e t y t 等，1 9 9 1 ；g o a l e 等，1 9 9 5 ；k a l p a n a ，1 9 9 5 ) 但孙丽萍等( 1 9 9 1 ) 认为呼吸强度在对伏地肤和红豆草种子的活力 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 测定中并不适合 i 1 2 4a t p 含量测定 a t p 含量测定一般采用荧光素酶法，毛培胜等( 1 9 9 9 ) 发现在对不同收获期高羊茅种子活力的 测定当中认为 r p 含量法是测定高羊茅种子活力的较好方法孙丽萍等( 1 9 9 1 ) 在采用 t p 含量法 测定伏地肤、多叶鹅观草、红豆草种子的活力中，发现活力、生活力越高，其 t p 含量越高，存 在较高的正相关性徐本美等( 1 9 8 3 ) 在对水稻、小麦、红花、大豆、罗 、白菜等种子的活力 测定当中采用的也是 t p 法 1 i 2 5t t c 法 僦原来主要用于区分死种子和活种子，但在种子活力测定当中也适用，在牧草种子检验 规程中已列出了冰草、小康草等牧草种子t t c 测定的方法( 目家标准总局。1 9 8 2 ) 李晖( 2 0 0 6 ) 把 喊应用到高原植物种子的活力测定当中，结果表明。僦用于高原植物种子活力的检测具有 较好的指示作用但对所检种子必须提供合适的萌动条件 1 2 近红外分析技术的研究现状 近红外光是指位于可见诺区与中红外诺区之问的一段电磁波谱，即介于7 8 0 2 5 2 6 t m 的光区 近红外光谱的产生，是由于分子振动的倍频( 振动状态在相隔一个或几个能量级问的跃迁) 或和 频( 分子两种运动状态的能级同时发生跃迁) 吸收所造成的( 严衍禄，1 9 9 4 ) 早在1 8 0 0 年h e r s c h e l 就发现了该谱区，但由于物质在该谱区的吸收谱带宽，重叠较为严重，而且吸收信号弱，加上受 当时技术条件的制约，信息解析较为雕难，因此，被人们“遗忘”了一个半世纪( 籍保平，2 0 0 0 ) 近红外光谱技术q 蚰口i m l z r e ds p e c h 邯p y ，简称n i r ) 就是利用有机化学物质在近红外光谱区的 光学特性快速估浏样品中一种或多种化学成分含量的一项新技术( 张子仪和陈学秀，1 9 9 2 ) 但是随着各种计算机技术、新兴统计方法、化学计量学及光电科学的发展，使近红外光谱技 术已经成功的应用到各个领域，在2 0 世纪6 0 年代，k a r | n o i sc 1 9 6 ) 最早使用近红外光谱和 多元线性回归分析测定谷物的水分、蛋白质、脂肪含量随后，近红外光谱技术在数十类农业、 生物样品上，测过几百种项目，测定的精度可满足农业研究的要求，其中有的项目已经被美国谷 物化学协会0 u c c ) 、国家谷物科技协会( 1 0 c ) ，公职化学分析工作者协会( a o a c ) 所采用( 严衍禄 等，1 9 9 0 ) 1 2 1 近红外光谱分析技术的理论基础 i 2 1 1 近红外光谱分析技术的物理基础 近红外光谱分析分为漫反射0 4 e 缸i n f r e d r e f l e c t s n c e s p 扭0 s p y ，简称n 峪) 和透射o 妇 i n 】 a r 耐b l m s m i t t a u c e s l e r m 6 c o p y ，简称n i t s ) 两种不同的检测方式光的反射有两种，一种是镜 面反射，另一种是漫反射所谓镜面反射。就是光线照射到光滑物体表面上被有规则地反射出来 的现象。它未与样品内部相互作用。没有携带入射光与样品相互作用的信息( 严衍禄等，1 9 9 0 ) 因此，n i r 进行固体样品的定量分析时，一般采用浸反射技术，避免镜面反射所谓漫反射，就 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 i i 量鼍皇曼鼍鼍葛皇罡詈置曼曼曼曼量量皇皇鼍量量量鲁鲁皇詈鼻| 皇詈鲁量鼍量皇皇暑詈暑曼曼曼皇| 皇詈皇篁皇皇曼詈皇皇一 是光线照射到粗糙物体表面被无规则反射的现象当光线照射到由一定厚度颗粒物质组成的样品 层时，一部分被吸收，一部分被样品内部各层次反射、吸收，折射后最终反射出来，反射出来的 光线反映了样品的内部特性。更多地携带有样品的信息在样品具有相当厚度的情况下，用近红 外光照射有机物，样品的透射光可忽略不计，入射光主要被样品吸收或是被样品反射 ( t o m a s ，1 9 9 5 ；t o r m o d ，1 9 9 0 ) 浸反射光谱分析几乎不需对样品作任何处理，加上傅里叶光谱仪和现代数学方法、计算机技 术的应用，已成为一种应用广泛的光谱分析技术( 严衍禄和金泽哀，1 9 9 8 , 陆婉珍等，2 0 0 0 ) 在漫反射分析中，在散射系数不变时， l o g a = a + b c 式中，r 为截距，f 为回归系数( 魏良明，2 0 0 3 ) 1 2 1 2 近红外光谱分析技术的数学基础 在近红外漫反射多组分定量分析中，由于组分含量与漫反射吸光度之问并非严格的线性关 系，当用线性关系来拟合非线性关系，线性方程必然存在不等于零的截距：因光谱吸光度不具备加 和性。样品的组分未知各种组分的光谱特性无法预先知道，因此多组分近红外光谱定量分析 首先要用化学计量学方法，利用一批标准样品并建立组分浓度或性质与光谱问的数学模型( 魏良 明2 0 0 3 ) 与吸收光谱按照比耳定律作光谱定量分析类似n i r 分析需要建立光谱参敷与样品含 量问的关系一标准曲线，即我们所说的定标模型复杂样品作n i r 定量分析时，为了解决谱区重 叠与谱图不稳定的闯题，需应用全光谱的信息n i r 分析必需首先有含量或性质己知的标准样品， 利用化学计量学方法算法，建立全谱区的光谱信息与含量或性质问的数学模型： c s m = b e + b i a i + b 2 a 2 + b s a f l - b k a k 其中：b k 为回归系数；a o a k 为第o k 个波长点的吸收强度；c s w , 为近红外区光谱分 析的某个化学成分含量( 徐坤等，2 0 0 1 ) ，2 1 3 近红外光谱分析技术的化学基础 不同物质在近红外光谱区段也具有不同的近红外光谱近红外光谱主要是由于分子振动的非 谐振性使分子振动从基态向高能级跃迁时产生的，主要记录含氢基团x ho 、n 0 ) 振动的 倍频和合频吸收，这是n i r 定量分析的化学基础( 吴瑾光，1 9 9 4 ) 如农作物，农作物中水分子的 0 - h 伸缩振动与弯曲振动的合频吸收一般在5 2 0 0 c m 1 附近，脂肪分子的c - h 伸缩振动与弯曲振动 的合频吸收带在4 2 0 0 c m 1 4 4 0 0 c m 1 左右，淀粉分子0 - h 合频吸收在5 1 7 0 c m - i 左右其他的一些 化学官能团，如羧基c = o , c - n , c - c 等的伸缩振动在近红外光谱区域也能产生多级倍频吸收，但 是强度较弱，实际分析时难度较大表1 - 1 是主要基团合频及各级倍频吸收带的近似位置( 严衍 禄等，2 0 0 5 ) 对于农作物种子来说，这类基团的含量较高，信息非富，是近红外分析的重要来 源现代近红外仪器的改进和化学计量学方法的发展，已能充分利用这部分吸收较弱基团信息， 提高近红外分析的准确度和扩大近红外分析的范围农作物种子的主要由水分，糖分、淀粉、蛋 白质、脂肪、维生素、纤维索和木质紊等有机成分组成，而这些组分正是由以上的官能团所构成 因此，农作物种子的近红外光谱信息非常丰富，可以成为近红外分析的主要对象( 吴建国，2 0 0 2 ) 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 袭i 1 主要基团合顿及各级倍频吸收带的近似位置 ：! 竺竖! ：! ! 坠鲤竺曼鲤坐型型! 型型竺! 竺璺 单位 1 1 2 2 近红外光谱分析技术( n t r s ) 的原理与特点 1 2 2 1 近红外光谱分析技术的原理 根据其检测对象的不同分为：近红外透射光谱( 波长7 0 0 1 1 0 0 n m ) 与反射光谱( 波长1 1 0 0 2 5 0 0 n = ) 物质中的不同组分或同一组分的不周含氢基团在近红外区域有丰富的吸收光谱农产 品中的蛋白质、淀粉、纤维素、脂肪等成分具有含氢基团，在近红外区都有特定的吸收光谱，每 种成分都有其特定的吸收特征，这为近红外光谱定性、定量分析提供了依据( 严衍禄等，1 9 9 4 ； 陆婉珍等，2 0 0 0 ) 主要是含氢官能团，如0 - h , h - h 。c - h 和s - h 的伸缩或弯曲振动其它官能团， 例如c _ 0 键的伸缩振动，c - n 键的伸缩振动和c - c 键的伸缩振动等等在近红外谱区仅能产生多级 倍频( 陆婉珍等，2 0 0 0 ) 这些多级倍频的信号强度很弱，通常被含氢官能团的一级或二级倍频 所掩盖故此，近红外光谱所能测定的成分中必须舍有o - h 。u - h , c - h 和s - h 键，如蛋白质、水 分、脂肪、淀粉，氨基酸等相同数量的不同有机物分子所产生的近红外谱带不同，可以在近红 外谱带与有机成份含量之问建立联系，这样通过物质的近红外光谱信息，便可预测物质中该成份 的含量( 陈鹛飞，2 0 0 6 ) 1 2 2 2 近红外光谱分析的特点 近红外光谱技术是现代分析技术中一种快速、高效，并且适合在线分析的有利工具，主要特 点为： ( 1 ) 分析速度快通过建立的可靠的定标模型，测量一个样品的时间只需l 2 分钟 ( 2 ) 分析速率高可同时分析样品的多种组分或性质 ( 3 ) 成本低、无污染利用近红外光谱技术不需要任何试剂消耗，不消耗样品，无须捧放 污染物与常规方法相比，既大大降低了成本费用，又保护了环境，是一种。绿色分析”技术( 严 衍禄，：z 0 0 0 ) ( 4 ) 可以实现在线分析根据近红外光能够在光纤中进行良好传输的特性，通过光纤技术 可以使仪器远离一些有毒的、危险的现场进行对长距离在线分析( 陈锋，2 0 0 3 ) ( 5 ) 缺点，首先是测试灵敏度低，在近红外谱区，分子振动的倍频、合频的谱带强度是其 基频的1 0 到1 0 0 0 0 分之一对于组分分析，要求其含量一般应大于0 1 其次，近红外定量分 析方法是一种间接分析技术，必须首先用一定数量的标准样品，经过标准方法测定其组成或性质， 5 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 建立光谱数据与样品组成或性质问关联的校正模型，而建立模型需要一定的费用、时问和化学计 量学知识另外，测定结果准确与否与建模的质量及其合理应用密切相关( 严衍禄，2 0 0 0 1 徐广 通等，2 0 0 0 ；陆婉珍等，2 0 0 0 ；史永刚等，2 0 0 1 ；吴军，2 0 0 4 ) 2 3 近红外光谱分析中常用的方法 1 2 3 1 近红外光谱分析技术中化学计量学方法 化学计量学( c h e m o m e a i ) 是综合使用数学、统计学和计算机科学等方法从化学量测数据中 提取信息的学科( 徐禄，1 9 9 5 ；b m - e t o a ，2 0 0 2 ) ，是化学的一门分支学科，它应用数学、统计学 及计算机科学，设计和选择最佳测量程序与实验方法，并通过解析化学测量数据，而获得最大限 度的化学信息因此，光谱化学计量学方法研究在现代近红外光谱技术的发展中占有非常重要的 地位( 严衍禄等，2 0 0 5 ) 化学计量学方法的研究主要涉及2 个方面的内容：一是光谱处理方面的内容，目的是针对特 定的样品进行适当的处理。剔除异常样品，消除光谱噪声，减弱以至消除各种非目标因素对光谱 的影响，为建立近红外光谱校正模型和预测未知样品组分浓度或性质奠定基础；二是近红外光谱 定性、定量校正方法的研究，以期建立稳定、可靠的定性、定量分析模型( 徐广道等，2 0 0 0 ) 1 2 3 2 光谱预处理方法 光谱的干扰因素包括基线漂移、随机噪声、样品不均匀引起的光散射等光谱的预处理研究 一般包括两个方面： 首先是噪音和其它谱图小规则影响因素的滤除，如消除随机噪音、光程变化、样品背景干扰， 测样器件引起光谱差异等因素对校正结果产生的影响，主要采用积分法、卷积平滑法、导数法等 在光谱信号处理中，最常用的方法是s a v i t z k y 和c o l a ) ( 2 0 0 2 ) 提出的卷积平滑法，在使用卷积 平滑法时。要注意根据光谱数据采集密度的具体情况选择窗口尺寸的大小，若窗口的数据点过少， 则达不到滤除噪音的效果，但是如果窗口过大，又会丢失有用的光谱信息基线校正最常用的解 决方法是对光谱进行一阶微分或二阶微分处理，前者主要解决基线的平动，后者则解决基线的旋 转在近红外光谱分析时，由于样品的不均匀性常常导致所测的样品光谱具有很大的差异，多元 散射校正技术( m u l t i p l es c a t t e rc o r r e c t i o n , m s c ) 夏 j 在解决样品的粒径不均匀或者测样容器不一致 对光谱的影响上有良好的效果另外，光谱的标准归一化处理对于消除光程变化或样品稀释等变 化导致光谱响应变化也是较为理想的方法 其次是谱图信息的优化，即在上述基础上对反映样品信息突出的光谱区域进行选择。筛选出 最有效的光谱区域，提高运算效率在近红外光谱全区域中，不同波长处的光谱吸收信息对于最 后建立模型的贡献价值是不同的在某些波长处，杂质吸收和干扰大大强于目标组分产生的吸收， 且很难通过现有的信息抽提技术对特征信息进行有效提取因此，删除这些波长的光谱吸收有助 于提高模型的准确度( 李勇，2 0 0 5 ) 在多元线性回归中，一般需要对样品吸收峰的位置进行选 择而当采用主成分回归和偏最小二乘法0 l s ) 等进行全光谱分析时，则无需对波长范围进 行选择但许多实验结果证明。在建模之前，对建模的光谱信息进行选择是一种有效的优化模型 方法，对减少噪音信号的影响、提高运算速率和模型的稳定性是有益的( d e l w i c h c 等，1 9 9 5 ；徐 6 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 广通等，2 0 0 0 ) 1 2 3 3 近红外光谱的定量、定性校正方法研究 应用于光谱定量分析中的化学计量学方法主要是多元校正方法，尤其是随着计算机技术的发 展，各种多元校正技术如主成分回归( p ( = r ) 、逐步多元线性回归( s 枷吣、人工神经网络( 心 n ) 、 偏最小二乘法回归但l s ) 和拓扑c r p ) 等方法陆续在近红外光谱分析中得到应用其中m l r 、 s m i , r 、p c r 和p l s 处理线性相关问题上可以得到较好的结果，而a n n 和t p 则在处理非线性 向题上有一定优势 主成分回归方法能够有效地解决多元线性回归中遇到的共线性问题、变量数使用限制问题和 在一定程度上解决了噪音滤除问题在实际分析中遇到的近红外光谱，构成光谱的因素很多，如 样品的状态、样品的组分、组分之间的相互作用、光谱仪的影响( 检测器噪音) 和环境因素的影响 等因此，所收集的原始光谱集是一个多维的空间数据，包括了由组分产生的相关变量和由噪音 产生的独立变量可采用主成分回归的方法。有效地选择仅与被测组分或性质有关的特征向量参 加回归运算，捧除光谱中包含的噪音对模型的不利影响( 李勇，2 0 0 5 ) 偏最小二乘法回归方法已经在许多领域得到广泛的应用是近红外光谱分析方法中常用的建 立线性模型的回归方法p l s 将因子分析与回归分析结合起来，是近红外光谱分析中使用最多、 效果最好的一种方法( 吉海彦等，l 8 ) p l s 方法目前能够得到广泛应用的原因主要有两方面， 首先与多元线性回归、主成分回归等分析方法比较，虽然求得的模型的残差平方和差别小大，但 p l s 方法求得模型的预测残差平方和( p r e s s ) 较小，因而具有较高的预测稳定性；其次p l s 方法 比较合适于处理变量多而样本数少的分析，是一种高效抽提信息的方法( 李勇，2 0 0 5 ) 1 2 4 近红外模型的建立流程 n 破分析中是通过建立校正模型，来对未知样品进行定性、定量分析主要由建立定标方程 和对定标方程进行检验两部分组成其中建标过程包括采集样品，常规化学分析，划分样品组， 近红外分析和回归分析等五步检验过程是通过模型获取一系列未知样品的预测值，并进行预测 值与化学分析值的相关性分析。来检验模型的实用性，它可消除在建模过程中的过拟合现象( 陈 鹏飞，2 0 0 6 ) 1 2 4 1 近红外定量分析的一般流程 近红外定量分析的一般流程可分为以下几个步骤： ( 1 ) 样品筛选：根据预测目标选择样品，选出的样品必须具有代表性，包括化学、物理学， 植物学特性和储藏方法选择的样品应能涵盖以后要分析样品的范围在所测的浓度或性质范围 内，样品的个数应该是均匀分布的 ( 2 ) 常规分析方法测定成份含量：用公认的、权威的方法对样品中某成份含量进行测定， 获得样品中该成份的含量，因为由模型预测结果的准确性在很大程度上取决于标准方法测定结果 的准确性 ( 3 ) 扫描样品光谱：用近红外光谱分析仪获取定标样品的光谱数据 ( 4 ) 建立与检验数学模型：根据测量的光谱数据和化学值，通过合理的化学计量学方法建 7 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 j i | 鼍毫寡鼍舅詈曼曼曼量皇量皇詈置詈鼍詈曼舅皇皇曼曼鼍鼍詈曼量詈量置皇蔓鼍皇舅詈胃鲁曼曼鼍e 量詈皇奠舅鼍詈量曼量鼍詈皇昌_ 立校正模型，通过样品集内部交叉证实与外部证实检验数学模型，以确定模型是否符合应用的要 求 ( 5 ) 未知样品组成、性质的预测：首先对未知样品扫描光谱，并对光谱进行预处理，然后 选择适合的校正模型，对未知样品进行预测在对未知样品测定前，要根据测定的光谱和校正模 型适用性判定，以确定建立的模型是否适合对未知样品进行测定( 徐广通等，2 0 0 0 ；陆婉珍等， 2 0 0 0 ) i 2 4 2 近红外定性分析的一般漉程 在近红外光谱图谱上，依据不同种类物质所含化学成分的不同，含氢基团倍频与合频振动频 率不同，则近红外图谱的峰位、峰数及峰强是不同的，样品的化学成分差异越大，图谱的特征性 差异越强采用简易的峰位鉴别可对不同品种的中药进行鉴别，采用峰位鉴别法主要是分析组分 相差较大的不同种物质，这种方法直观、简便，但对于性质相近的样品鉴别却无能为力因此必 须需要其它的方法，如化学计量学方法等来鉴别( 王风霞，2 0 0 6 ) 模式识别在六十年代末被应 用到化学领域，模式识别方法一般只需要知样品的类别或等级，并不需要知道样品中含有的组分 数与其含量的问题模式识别法主要用于光谱的定性分析，在近红外光谱定性分析中常用的模式 识别方法很多，有聚类分析、判别分析、人工神经元网络、主成分分析结合马氏距离法等( 王凤 霞，2 0 0 6 | ；刘晓董，2 0 0 4 ) 近红外定性分析的一般流程可分为以下几个步骤： ( 1 ) 标准样品光谱集的建立：光谱定性分析主要是将标准光谱与样品的光谱进行比较，所 以建立标准样品的光谱集是比较重要的一步 ( 2 ) 光谱的校正与预处理：与定量分析一样，定性分析也需要抵消背景干扰来提高光谱的 质量，一般的处理方法有导数、归一化处理等。 ( 3 ) 光谱特征的提取：定性分析的依据就是光谱特征的相似性，在常规的分析中一般依据 几个峰值就可以确定物质的归属和纯度在近红外光谱分析中，定性判别分析一般依靠若干峰组 或者全光谱来进行判别分析。如主成分分析( p f 酗p a lc o m p o n m t , p c a ) ，s i m c a 方法( s o l h d e p e n d e mm o d d l m g o f c l a s sa n a l o 钉) 、人工神经网络法( a n n ) 等 ( 4 ) 定性判别分析模型的建立和评价：与定量分析有所不同的是，定性判别分析一般用类 归属的判别正确率、错误率来评价优劣 ( 5 ) 未知样品定性判别：利用测得样品光谱对样品进行归属判定，即决定该样本是否属于 某一个类别 1 2 5 近红外光谱分析的误差来源 影响近红外光谱分析的因素有多种，一般容易受到测量条件( 如仪器、温度) 、样品状态等外 界因素的影响 1 2 5 1 标样的数目 在近红外分析中，如果定标样品数量不足，定标结果的说服力就不够( 刘海涛，2 0 0 2 ) 样 品应能涵盖以后要分析样品的范围，样品数量的多少影响分析结果的准确性，数量太少不足以反 8 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 映被测样本群体的常态分布规律；数量太多，则增加工作量( s h c v k 和w e s t e d m u & 1 9 9 1 ；徐坤等， 2 0 0 1 ) 在选择样品时。要考虑样品成分含量和梯度，同时应注意样品的理化性质，生长地域( 环 境) 、种类、生长条件等因素，以提高定标效果，使定标方程具有广泛的应用范围( 王文真，1 9 9 6 ； 徐坤等