（微生物学专业论文）短双歧杆菌α半乳糖苷酶基因及其重组表达研究.pdf

山东大学硕士学位论文短双歧杆菌小半乳糖苷酶基因及其重组表达研究 摘要 糖生物学( g l y c o b i o l o g y ) 是研究糖缀合物糖链的结构、生物合成和生物学功 能的一门学科，其研究领域包括糖化学、糖链生物合成、糖链在复杂生物系统 中的功能和糖链操作技术。近年的研究发现，糖链几乎参与真核生物的每一个生 命过程，在细胞识别、信息传递、激素调节、受精、发生、发育、分化、神经系 统和免疫系统恒态维持，以及病原体感染，炎症与自身免疫疾病，癌细胞增殖与 转移等各个方面都起了特异性的介导与识别的作用。糖生物学作为2 1 世纪国际 性的新兴科学，为新药的开发提供了新的机遇和挑战。糖生物学面临的巨大挑战 是与生命有关的低聚糖大量合成非常困难，糖类化合物上多个可反应的羟基使特 异性糖苷键的化学法合成步骤繁琐，而酶法合成以其精确的位置和构型特异性、 简单的步骤，成为目前大量合成低聚糖的唯一有效方法。具有转糖基活性的糖萤 酶合成低聚糖底物简单。不需糖基转移酶所必须的昂贵核苷糖底物，是当今工业 化合成低聚糖的首选酶类。转糖基糖苷酶的开发因此成为国际范围的研究热点， 新酶的发现、转糖基酶库的建立以及糖苷酶的基因改造三个方面的研究同时展 开。本论文研究一株双歧杆菌的a 一半乳糖苷酶及其基因，以及基因的高效表达， 为建立双歧杆菌位半乳糖苷酶转糖基作用体系，研究该酶转糖基作用的区域选择 性，建立双歧杆菌a 半乳糖苷酶转糖基合成的a d 半乳糖基寡糖单位库，酶法 进行糖缀合物的加工奠定基础。 首先进行了大肠杆菌中h i s - t a g 标记表达b i f i d o b a c t e r i u m b r e v e2 0 3 小m 半乳 糖苷酶基因( a g a l ) 的研究。根据本室已得b b r e v e2 0 3 a 半乳糖苷酶基因序列，设 计引物，采用p c r 技术。以丑b r e v e2 0 3 染色体d n a 为模板扩增得到酶基因片 段( 2 1 k b ) 。将扩增产物连接至h i s - t a gc - 端标记表达载体p e 1 2 2 b 的b a m h i 和 髓o r j 位点，命名为p e t 2 2 b a g a l 。将重组质粒p e t 2 2 b - a g a l 转化e c o l i b l 2 l ( d e 3 ) ，经过i p t g 诱导后，通过镍亲和层析柱进行分离提纯，最终得到了 电泳纯酶蛋白，在垂直板s d s p a g e 中为一条带，显示了酶蛋白单个亚基分子 量约为6 7 k d a ，纯酶在n a t i v eg r a d i e n tp a g e 和活性染色中未能显示出均一的带 型。重组酶的n 端氨基酸序列为n h 2 t - k - r - l l - e - i t - s - v ，根据n - 端氨基酸序 列以及之前的基因测序，从而最终确定了该q 半乳糖苷酶基因的o r f 的真正起 始位置是在b l a s t 预测的o r f 的第三个a t g 处。对该酶的蛋白质序列进行 b l a s t 比对结果显示克隆并表达的静半乳糖苷酶( a g a d 是以前所没有报道过的， 属于一种新的酶蛋白，它与其他来源碱性舡半乳糖苷酶有一定的同源性，但在双 歧杆菌中的发现属首次。该酶在n a t i v e - 梯度电泳下不能形成均一的带型，可能 是其在我们研究双歧杆菌的a 半乳糖苷酶过程中一直未能发现与纯化的原因，也 有可能该蛋白在双歧杆菌中属于不可溶膜蛋白在细胞破壁后提取可溶性舡半乳 糖苷酶( a g a 2 ) 时很难得到，还有一个原因是该酶的表达目前采用了h i s - t a g 标记， 山东大学硕士学位论文短双歧杆菌廿半乳糖苷酶基因及其重组表达研究 可能也影响到其多聚体的性质。 其次，进行了大肠杆菌中b b r e v e2 0 3 小半乳糖苷酶( a g a l ) 的温度诱导高效表 达研究。利用p c r 技术，将小半乳糖苷酶基因( a g a l ) 克隆连接至温度高效表达质 粒p b v 2 2 0 的e c o r i 和b a m h i 位点，命名为p b v - a g a l 。将重组质粒p b v - a g a l 分别转化e c o l id h 5 a 、b l 2 1 、d h l 0 b 中，叶半乳糖苷酶基因( a g a l ) 在这三株宿 主菌中均可进行非融合性表达，比活分别为2 8 0 8u n i t s ，m g 、1 3 8 5u n i t s m g 、1 9 4 4 u n i t s r a g ，均高于b b r e v e2 0 3 ( 1 7 6u n i t s r a g ) 。重组质粒p b v - a g a l 在e c o l ib l 2 l 中稳定性较好，在无选择压力下，连续培养4 8 h ，可保持在8 0 ，而在d h 5 a 、 d h l 0 b 中的稳定性较差。 该重组酶经过硫酸铵分级沉淀、d e a e s e p h a r o s e f a s tf l o w 柱层析、g i g a p i t e k 1 0 0 s 柱层析和a i t l i c o nu l t r ap l - 1 0 浓缩并除盐，酶蛋白在垂直板s d s 书a g e 中为一条带，证明已得到重组的小半乳糖苷酶( a g a l ) 电泳纯，亚基分子量大小仍 为6 7k d a ，该酶在n a t i v eg r a d i e n tp a g e 和活性染色中仍未能显示出均一的带型。 纯酶的比活为9 6 9 7u n i t s r a g ，纯化倍数为7 倍，得率为1 3 。通过d n a s i s 分 析得到酶的等电点口i 为5 1 9 。最适反应温度为4 5 ，在4 0 以下稳定，7 0 时 失去所有的酶活性：最适反应p h 为4 o 4 4 ，在p h3 6 6 0 范围内稳定。h g + 、 c u 2 + 、a g + 强烈抑制酶的活性，而c o 外、m 矿、c a 2 + 、l v i a t l 2 + 、z n 2 + 、e d t a 和 d t t 对酶活性没有抑制。重组酶水解酶对p 硝基苯酚旺- d 半乳糖苷的k 。= 1 4 3 r a m ，v 。x = 3 5 7 l l m a o l ( l r a i n ) 。通过薄层层析并未发现该酶有转糖基活性。 结果说明重组酶p h 稳定性、最适反应p h 、温度稳定性、最适反应温度等与我 们发表的最b r e v e2 0 3 中的一种亚基分子量为7 8 k d a 的a - d 半乳糖苷酶( a g a 2 ) 有 很大的差异，由此可以说明本实验研究得到的小m 半乳糖苷酶( a g a l ) 是最b r e v e 2 0 3 中的一种新酶，该酶有可能在丑b r e v e2 0 3 中是我们已经研究并发表的小m 半乳糖苷酶( a g a 2 ) 的一种同工酶。 最后，迸行了短双歧杆菌b b r e v e2 0 3 中a 一半乳糖苷酶基因a g a 2 克隆的初步 研究。为了克隆b b r e v e2 0 3 中的小半乳糖苷酶基因( a g a 2 ) ，利用g e n b a n k 中检 索到不同菌株的a 半乳糖苷酶基因的d n a 序列，分析同源性从而设计简并引物 对旺- 半乳糖苷酶基因保守区进行克隆，得到大小约5 0 0 b p 的保守区d n a 片段， 进行序列的测序与比对，结果显示克隆出的洳半乳糖菅酶基因保守序列区与已报 道的2 株双歧杆菌( b i f i d o b a c t e r i u ma d o l e s c e n t i s 和b i f i d o b a c t e r i u ml o n g u m ) 的叶半 乳糖苷酶基因均有较高的同源性，说明此保守区d n a 片段确实属于双歧杆菌a 半乳糖苷酶基因，非常适合作为探针进行标记，从而进行s o u t h e r n 杂交，从染 色体d n a 中钓出a 半乳糖苷酶基因。目前进一步的工作正在积极开展中。 关键词：双歧杆菌；廿半乳糖苷酶；基因：融合蛋白表达：温度诱导表达 坐垄奎兰堡主兰堡笙兰堑罂些堑堕! = 兰墨塑笪堕茎里墨茎重堡耋鲨堑壅 a b s t r a c t g l y c o b i o l o g y i st h e s t u d y o ft h e s t r u c t u r e ，b i o s y n t h e s i s ，a n db i o l o g y o f s a c c h a r i d e s ( s u g a rc h a i n so rg l y c a n s ) t h a ta r cw i d e l yd i s t r i b u t e di nn a o e i n d e e d ，a l l c e l l sa n dm a n ym a c r o m o l e c u l e si nn a t u r e c a r r yad e n s ea n dc o m p l e xa r r a yo f c o v a l e n t l ya t t a c h e ds u g a rc h a i n s s i n c em o s tg l y c a r t sa r eo nt h eo u t e rs u r f a c eo f c e l l u l a ra n ds e c r e t e dm a c r o m o l e c u l e s ，t h e ya r ei nap o s i t i o nt om o d u l a t eo rm e d i a t ea w i d e v a r i e t y o fe v e n t si nc e l l - c e l la n dc e l l m a t r i xi n t e r a c t i o n sc r u c i a lt ot h e d e v e l o p m e n ta n df u n c t i o no fac o m p l e xm u l t i c e l l u l a ro r g a n i s m 1 1 1 ec h a l l e n g eo f g l y c o b i o l o g yi sd i f f i c u l ti ns y n t h e s i so fq u a n t i t i e so fo l i g n s a e c h a r i d e s b yf a r , t h e e n z y m es y n t h e s i so fo l i g n s a c c h a r i d e si st h eo n l ye f f e c t i v ew a y w i t ha c c u r a t es i t u a t i o n ， s p e c i a lc o n f i g u r a t i o na n ds i m p l ep r o c e s s n o w a d a y sg l y c o s y l t r a n s f e r a s ei st h eb e s t e n z y m e i ni n d u s t r i a l s y n t h e s i s o f o l i g o s a g c h a r i d e s f o r s i m p l e s u b s t r a t e s t h e d e v e l o p m e n to fg l y c o s y l t r a n s f e r a s ei sb e c o m i n gt h ef o c u so fs t u d yi nt h ew o r l d t h e p r e s e n t w o r ks t u d i e d c t - g u l a c t o s i d a s e o fas t r a i no fb i f i d o b a c t e r i n ma n d o v e r e x p r e s s i o no f r e c o m b i n a n t a g a l a c t o s i d a s eg e n e ，w h i c h i sv e r yu s e f u lt os y n t h e s i s o fn e w g a l a c t o - o l i g o s a c c h a r i d e s o r g a l a e t o c o m p o u n d s w i t i lr e c o m b i n a n t 值- g a l a c t o s i d a s eb yt r a n s g a l a c t o s y l a t i o n t h e a g a l a c t o s i d a s eg e n ef r o m b b r e v e2 0 3w a sc l o n e db yp c rw h o s e p r i m e r s w e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ek n o w nt l - g a l a c t o s i d a s eg e n es e q u e n c e db yo m l a b r e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t 2 2 b - a g a lw a sc o n s t r u c t e db yi n s e r t i n g a g a l a c t o s i d a s e g e n ei n t ov e c t o rp e t 2 2 b ( + ) p e t 2 2 b - a g a lv ，a st r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t h er e c o m b i n a n te l l z y i i e sw e r ee x p r e s s e da sh e x a h i s t i d i n e t a g g e df u s i o np r o t e i n s u n d e rt h ei n d u c t i o no fi p t gi ne c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) c e i l sa n dp u r i f i e dw i t hn i c k e l n i t r i l o t r i a c e t i ca c i da g a r o s e t h es i z eo fas u b u n i tm o l e c u l a rm a s sw a so f6 7 l 【i ) ab y s d s - p a g eo fp u r i f i e dr e c o m b i n a n te n z y m e s n 坨n a t i v em o l e c u l a rm a s so ft h e r e c o m b i n a n t 旺一g a l a c t o s i d a s ew a gn o tc a l c u l a t e db yt h en a t i v eg r a d i e n tp a g e i t s n - t e r m i n a la m i n os e q u e n c ew a sn h 2 t - k r - l l e - i - 1 乙s v f r o mt h i sr e s u l t , w e d e t e r m i n e dt h a ta - g a l a c t o s i d a s eg e n eo r f b e g i n w i t l lt h et h i r da t gf r o mt h eb l a s t p r o p o s e do r e t h ea m i n oa c i ds e q u e n c ea l i g n m e n t o f a g a lw a sc o m p a r e d 、i t i lt h o s e o fo t h e rm i c r o o r g a n i s m s t h e r ew a sah i g ha l i g n m e n tb e t w e e na g a la n da l k a l i n e g - g a l a c t o s i d a s e f r o mt h er e s u l ta b o v e ，t h er e c o m b i n a n t 小g a l a c t o s i d a s e ( a g a l ) w a sa n e w e n z y m e ， t h e a m p l i f i e df r a g m e n to f a g a l a c t o s i d a s eg e n e ( a g a i ) b yp c r w a si n s e r t e di n t o p b v 2 2 0 r e c o m b i n a n tp l a s m i dp b v 2 2 0 一a g a l w a st r a n s f o r m e di n t od i f f e r e me c o l i h o s ts t r a i n s t h es p e c i f i ca c t i v i t yo f a g a l a c t o s i d a s eg e n ei nt h er e c o m b i n a n ts t r a i n s 山东大学硕士学位论文短双歧杆菌a 半乳糖苷酶基因及其重组表达研究 c o u l dr e a c h2 8 0 8u n i t s r a g ，w h i c hi s1 6 一f o l do ft h a to fb b r e v e2 0 3 t h ep l a s m i d p b v 2 2 0 一a g a l i nb l 21w a ss t a b l ea f t e rt h eh o s ts t r a i nw a sc u l t i v a t e di nl bb r o t h ( w i t h o u ta n t i b i o t i ca d d i t i o n ) a t3 0 f o r4 8ha n dt h e ni n d u c e da t4 2 f o r5h b u t a b o u t9 6 o f t h ep l a s m i d sw e r el o s ti nd h 5 aa f t e rt h es a l n ep r o c e d u r e ， t h er e c o m b i n a n te n z y m ew a s p u r i f i e dt oe l e c t r o p h o r e t i ch o m o g e n e i 哆f r o m t h e c e l l f r e ee x t r a c t b y a m m o n o i u ms u l f a t e f r a c t i o n ，d e a e s c p h a r o s ef a s t f l o w , g i g a p i t e k - 1 0 0 sa n da n i c o nu l t r ap l 1 0 t h es p e c i f i ca c t i v i t yo ft h ep u r i f i e d e n z y m ew a s9 6 9 7 砌倒如舀w h i c hw a s7f o l d sa sh i g h a st h a to f c r u d ee x t r a c t t h e y i e l dw a s a b o u t1 3 i tw a sas u b u n i tw i t ham o l e c u l a rw e i g h to fa b o u t6 7k d aa n d p lw a s 5 19 i t so p t i m a l t e r m p e r a t u r e a n d p h w a s4 5 ca n d 4 0 一4 r e s p e c t i v e l y t h e e n z y m ew a ss t a b l ei nt h ep h3 6 - 6 ，0a n ds h o w e dg o o ds t a b i l i t yb e l o w4 0 c i t s a c t i v i t yw a ss t r o n g l yi n h i b i t e db yh 矿、c u 2 + 、a g + ，w h i l ec 0 2 + 、m 9 2 + 、c a 2 + 、m n 2 + 、 z n 2 + 、e d t aa n dd t th a dn oe f f e c to ne n z y m ea c t i v i t y k mv a l u e sf o rp n p - e n d a ln 卿】本室保存。 e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) c e l l s 【f o m p t h s d s b ( i b r o b ) g a l d c m ( d e 3 ) 】本室保存。 b b r e v e2 0 3 由日本东京大学农学部应用分子微生物室雄谷英彦教授提供。 质粒p e t 2 2 b ( 十) 为本室保存。 2 2 2 培养基和培养条件： ( 1 ) l b 培养基 蛋白胨1 ；酵母膏0 5 ：n a c il ；p h7 0 液体培养基中加1 5 的琼脂粉即得l b 固体培养基。 一一些蔓查兰堡主兰垡笙壅 壁翌堕堑堕! 圭墨蔓堇壁里墨茎重墼重苎堡壅 ( 2 ) b l 固体血培养基： 日本荣研化学株式会社制造，使用时加入5 的脱脂马血或羊血。 ( 3 ) b g l c 培养基酬： 葡萄糖1 ：蛋白胨0 5 ；酵母膏o 5 ：醋酸钠o 5 ；k 2 h p 0 4o 4 ：m g s 0 4 o 娩；l 一抗坏血酸0 6 8 ：l - 半胱氮酸盐酸盐0 0 4 ：p h 7 0 。 ( 4 ) m r s 培养基 蛋白胨l ；k 2 h p 0 40 2 ；柠檬酸三铵o 2 ：牛肉浸膏1 ；n a a e 3 h 2 0 0 0 5 ；m g s 0 4 7h 2 0o 0 2 ：m n s 0 4 4 1 4 2 00 0 0 5 ：酵母浸膏0 5 ；葡萄糖 2 ；t w e e n8 00 1 ：p h6 0 - 6 6 b b r e v e2 0 3 在b l 固体血平板培养基上活化后接种于产酶培养基b - r a f , 即用 绵子糖代替葡萄糖的b g l c ( b 一葡萄糖) 液体培养基。所有培养均为厌氧( c o o 培养 ( 3 7 ) 。 2 2 3 菌种保存 大肠杆菌的短期保存：将培养好的大肠杆菌试管斜面或平板放在4 c 冰箱保 存数周。 大肠杆菌的长期保藏：以单个菌落接种5 1 0 m l 液体l b 培养基，3 7 振荡 培养。离心收集过夜培养的菌体，重新悬浮于l m l 无菌1 5 甘油、0 8 5 n a c i 的e p p e n d o r f 管中，p a r a f i l m 封口，混合均匀，置2 0 c z $ j f i 中包藏l 一2 年，置一7 0 冰箱中保藏5 年以上。 2 3 重组d n a 技术 2 3 1 大肠杆菌质粒提取 按分子克隆实验指南进行“。 挑取单菌落接种于3i n l 含氨苄青霉素( 1 0 0 p g m l ) 的l b 培养基中，3 7 摇床培养过夜一取1 5 a l l 培养物倒入e p p e n d o r f 管中，高速离心3 0s 一将 e p p e n d o r f 管；倒扣于吸水纸上，尽量控干培养基一加入1 0 0 h 1 溶液i ，用枪头抽吸 混匀一加入2 0 0 1 t l 溶液i i 颠倒混匀，冰浴放置5m j 一加入1 5 0 山溶液m ，颠 1 9 山东大学硕士学位论文 短双歧杆菌弘半乳糖苷酶基因及其重组表达研究 倒混匀，冰浴放置1 0 m i n 一1 0 0 0 0 r p m 离心5 - 1 0 m i l l 。将上清转入一新e p p e a d o r f 管中一加入2 倍体积的无永乙醇，2 0 放置2 0r a i n ：或加入或0 7 倍体积的异 丙醇室温放置1 5m i n 一1 2 0 0 0 - 1 4 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，弃上清，用7 0 7 , 醇洗涤 沉淀一至两次，真空干燥一将沉淀物溶于5 0 mt e 缓冲液或无菌的去离子水中一 加入l | dr n a s e a ( 1 0m 咖1 ) ，3 7 c 保温1h 一补加4 5 0 沮t e ，用等体积的苯酚、 苯酚一氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 和氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 各抽提一次一加入5 0 u | ( 1 1 0 体积) 3m n a a c ，混匀，然后加入2 倍体积的无水乙醇，- 2 0 放置3 0m i n 一1 2 0 0 0 r p m 离心1 0r a i n ，弃上清，沉淀用7 0 乙醇洗涤一至两次，真空干燥至无乙醇味 为止一将沉淀溶于3 0 5 0 mt e 中，- 2 0 保存。 2 3 。2 显b r e v e2 0 3 染色体d n a 的提取 b b r e v e2 0 3 菌株b l 一固体血平板培养基活化一接种b g l e 液体培养基5 0 r i d ， 3 6 h 一离心收集菌体一悬浮于3 m l5 0 r a mt r i s h c l 0 h 8 o ) ，5 0 m me d t a ，lo i - n # m 溶菌酶一3 7 ，4 h ( 缓慢摇动) 一加入2 m ls t e p 溶液+ ，摇匀一5 0 ，l h ( 缓慢 摇动) 一等体积苯酚一氯仿一异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提2 次一水相加入0 6 倍体积 异戊醇一玻璃棒缠绕d n a 一7 0 乙醇洗后干燥一2 m it e 溶解一4 山 r n a s e ( 1 0 m g m 1 ) ，3 7 ，l h 一等体积酚一氯仿一异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提一水相加 入2 倍体积冷乙醇一离心得沉淀一7 0 乙醇洗后干燥，0 4 m lt e l ：1 0 0t e 稀 释后测量o d 2 6 0 ，计算染色体d n a 的浓度( 1o t h 砷= 5 0 1 t gd n a j m l ) 一t o 贮存。 * s t e p 溶液：s d s0 5 ： i r i s h c i1 5 0 m m ；e d t a 0 4 m ；蛋白酶k 2 5 0 1 l g m l 2 3 3 琼脂糖凝胶电泳 按常规方法进行 2 3 4d n a 大小的测定 以九d n a h i n d l i i 酶切片段( 2 3 1 3 0 b p ，9 4 1 6 b p ，6 5 5 7 b p ，4 3 6 1 b p ，2 3 2 2 b p ， 2 0 2 7 b p ，5 6 4 b p ，1 2 5 b p ) 作为分子量标准，与待测d n a 样品同时电泳，根据电泳 结果确定待测d n a 片段的大小。 山东大学硕士学位论文短双歧杆菌n 半乳糖苷酶基因及其重组表达研究 2 3 5p c r 技术 引物设计：利用引物设计软件p 舢r 2 0 版进行。 根据肖敏等得到的1 1 b r e v e2 0 3q 半孚l 糖苷酶基因序列嘲1 ，设计了一对p c r 引物f 和r 。在上游弓i 物f 的5 端加上了保护碱基a a t a 及b a m h i 酶切位点 序列，在下游引物r 的5 端加上保护碱基c g a g 及h i n d l h 和e c o r i 酶切位 点序列，以便将p c r 产物定向连接到载体上。引物设计如下： p r i m e rf ：5 - a a t a q 亟筮匿a t g t t g g c g g c c t o c t c t 3 b a n ，h i p r i m e rr ：5 - c g a g 垒鳗卫鱼垒殁g g g a a a g t a t a n 盯o c g c g g g 3 h i n d l l ie e o r i p c r 扩增反应： 参考文献。”2 3 的方法进行。引物浓度l 肛m o l l ，d n t p 浓度2 0 0g m o l l ，模 扳浓度1 0 r l g 蚌l ，p f ud n a 聚合酶购自s a n g o n 公司，加入量为2 s u 5 0 1 x l 反应体 积。p c r 反应循环参数设置为：9 4 l m i n ，5 7 ( 2l m i n ，7 2 3 m i n ，2 8 个循环 后，7 2 1 0 m i n 。p c r 反应采用美国生产的p 皿m e rc e t u s 的d 咐a t h e r m a lc u c l e r4 8 0p c r 仪。 2 3 6 限制性核酸内切酶酶切 d n a 限制往内切酶酶切主要是依据公司提供的搡作手册进行。 2 3 7 连接反应 外源目的d n a 片段与载体d n a 比例为3 ：l ，按比例加入d n a 片段、连 接缓冲液、t 4 d n a 连接酶( s a n g o n ) 、d d i - 1 2 0 , 1 6 c j 苣接1 6 h ，用琼脂糖凝胶电泳 检测连接效果。 2 3 8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 按1 接种量将过夜培养的菌液加入2 0r r i l 新鲜的l b 培养基中，于3 7 c 摇 床培养至o d 6 0 0 为0 3 0 4 一将菌液倒入无菌的大离心管中，冰浴1 0 m i n 一4 c ， 2 l 山东大掌硕士学位论文短双歧杆菌叶半乳糖苷酶基因及其重组表达研究 6 0 0 0r p m 离心5r a i n ，弃去上清，倒扣在吸水纸上，控干残液一加入冰冷的o 1m c a c l 2 溶液5m l ，轻轻重悬菌体，4 0 ，6 0 0 0r p m 离心5r a i n ，弃上清。重复这步 操作一次一加入冰冷的o 1mc a c l 2 溶液2m i ，于冰上放置，感受态细胞制备完 成一取2 0 0 山感受态细胞加入连接液1 0 m ，轻轻混匀，冰浴3 0m i n 一4 2 c 热击 9 0s e c ，迅速置冰上冷却3m i n 一向管中加入含1 0 m m 葡萄耱的新鲜l b 培养基 8 0 0 b t l ，轻轻颠倒混匀，于3 7 摇床上2 0 0r p m 培养1h 一涂布于合适的平板上( 加 1 0 0 9 9 m la m p 的且含x g a l 和i p t g 的筛选培养基) m 1 。 2 3 9 琼脂糖凝胶中d n a 片段的回收 琼脂糖凝胶中d n a 片段的回收采用p c rf r a g m e n t r e c o v e r yk i t ( o m i g a ) ，具 体操作步骤参照试剂盒使用说明书。 2 3 1 0 重组菌无细胞粗酶液的制各 t 收集新鲜培养细菌细胞，1 0 m m 磷酸缓冲液( p v i7 o ) 洗涤两次，悬浮于同样 缓冲液中，细菌悬浮液于0 - 1 5 0 用超声波破碎仪破碎，最小功率为1 0 0 0 w ，探 头振幅4 0 ，1 0 0 0 0 r p m m i n 离心，上清液用做粗酶液。 2 3 1 1 糖苷酶活力测定 2 m m 硝基苯酚糖苷、5 0 m m 醋酸铺缓i 中液( p h 5 5 ) 和适当稀释的酶液共 0 3 6 m l ，3 7 反应l o 分钟后，加入2 1 0 m l ，0 2 m ，p h1 0 5 硼酸缓冲液终止反应， 于4 0 0 n m 比色。硝基苯酚的摩尔消光系数1 7 ，7 0 0 删。 活力单位规定：每分钟从对硝基苯酚耱苷底物中水解释放1 it o o l 的硝基苯 酚的糖苷酶量为1 个酶活单位。 2 3 1 2 蛋白质含量测定 采用b r a d f o r d 测定法。“，牛血清蛋白为标准，据标准曲线计算蛋白质含量。 见图2 1 坐堡奎兰堕主兰垡笙兰 堑翌些堑堕竺= 兰塾鳖蔓堕茔里墨墨重丝耋竺堡壅 0 1 0 0 8 鼍0 0 6 面0 0 4 等0 0 2 醐0 0 0 2 y = 0 7 7 9 9 x 一0 o o l 3 0 0 50 10 摩尔消光系数( 5 9 5 n m ) 1 5 l + 系列ll 线性( 系列1 ) 图2 1b r a d f o r d 法测蛋白标准曲线 2 3 1 3 利用镍柱法分离提纯h i s - t a g 重组酶 将亲移层析树黯n i c k e ln i t r i l o t r i a c e t i ca c i d a g a r o s e ( q i a g e n ，s a n t ac l a r i t a ，c a l i f ) 装柱( 1 5 c m ( 1 5 c m ) 。用l xb i n d i n g b u f f e r 进行平衡后上样，上样后先用l xb i n d i n g b u f f e r 6 x 柱体积洗柱，后用lx w a s h i n gb u f f e r6 柱体积洗柱，再用1 x e l u t i n g b u f f e r 洗脱并收集有酶活的洗脱液，迅速用1 0 m m ，p h 7 0 的磷酸缓冲液透析，用 m i c r o c o n y m l o 1 0 ，0 0 0 n m w l ( m i l l i p o r e ) 浓缩样品。 1 b i n d i n gb u f f e r ：0 5 mn a c i ；2 0 m mt f i s h c i ：用浓h c i 调p h 7 9 i x w a s h i n gb u f f e r ：2 0 r a m 睬睦；o 5 mn a c h2 0 r a m i r i s h c i ；用浓h c i 调p h 7 9 1 e l u t i n gb u f f e r ：2 0 0 r n m 咪唑；o 5 mn a c i ；2 0 m mt r i s h c i , 用浓h c i 调p h 7 9 l s t r i pb u f f e r ：1 0 0 m me d l a ；0 5 mn a c l ：2 0 m mt d s h c i ：用浓n a o h 调p h 7 9 1x c h a g eb u f f e r ：5 0 r a mn i s 0 4 2 3 1 4 蛋白质电泳技术 s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d sp o l y a r c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h r e s i s 。 s d s - p a g e ) 。本实验采用垂直板式不连续系统电泳方式，电泳分离胶浓度为1 2 ， 浓缩胶为3 2 5 ，参照l a e m m l i 方法进行呻1 。 n a t i v eg r a d i e n tp a g e 参照m a n a b e 方法m 1 ，采用4 - 1 5 线形梯度垂直板壮聚 山末大学硕士学位论文 短双歧抒茁垫半乳糖营酶基因及其重组表达研究 丙烯酰胺凝胶，4 c 电泳。 蛋白质染色用考马斯亮蓝法。 2 3 1 5 酶谱分析 重组菌无细胞抽提液经非解离梯度聚丙稀酰胺凝胶泳( n a t i v eg r a d i e n t p a g e ) ( 4 - 1 5 线形梯度胶) ，用4 一甲基伞形酮c t - d 半乳吡喃糖苷 ( 4 一m e t h y l u m b e l l i f e r y l a d - g a l a c t o p y r a n o s i d e ) 进行活性染色，于3 6 5 n m 下观察荧光 【】 2 3 1 6 蛋白质的转印 蛋白质转印采用半干法9 3 。s d s p a g e 电泳结束后，电泳置于预处理的 p v d f 膜上- ( b i o - r a d 公司产品1 ，上面覆3 4 层经电极液浸湿的滤纸，将此s a i l d 埘c h 放于t r a n s b l o ts e m i - d r yt r a n s f e r c e l l ( b i o r a d ) q 。p v d f 膜一面在 正极，然后4 0 m a 恒流1 5 h 。屯泳结束君，接常规宅泳凝胶染色与脱色方法对 p v d f 膜进行染色和脱色。 2 3 ，1 7 蛋白质n 末端测定 本项实验在北京大学生物系完成。 方法：利用e d m e n 法进行测定 仪器为：a p l 4 9 1a p p l i e db i o s y s t e m sf o s t e rc i t y c a u s a 2 3 。1 8 糖的薄层层析( t l c ) 糖样品( 1 0 一3 0 曲点在t l c 薄板( s i l i c ag e l6 0 ，n o ，5 5 3 ，m e r c k ) 上，展开剂展 开后，雾喷显色剂，1 4 0 1 2 加热烘烤1 0 - 1 5 r a i n ，糖斑点的显色根据其种类从棕黄 至深紫色。 展开剂：正丁醇：乙醇：水= 5 ：3 ：2 显色剂：2 0 h 2 s 0 4 + o 5 3 ，5 一二羟莲甲苯 山东大学硕士学位论文短双歧杆菌醐时艇因及其重组表达研究 2 4 结果与讨论 2 4 1 口- 半乳耱苷酶基因的扩增和克隆 用p e l 2 碳”质粒作为表达载体克隆静半襄i 蒋苷酶基西 ( 1 ) 弘半乳糖苷酶基因的扩增和克隆 以b b r e v e2 0 3 染色体d n a 做摸扳，进行p c r 扩增 经过p e r 反应，在o 3 的琼黯綮凝胶电泳检漶，罨到约2 0 k b 的p c r 产物， 其大小与已知的小半乳糖苷酶基因一致，符合预期的要求，见图2 2 1 、2 ，p c r 产物3 分子1 4 3 6 、2 2 , 2 、2 0 3 、鬟硼哟 ( 2 ) 含小半乳糖昔酶基因的重组质粒的构建 经纯化的p e r 扩增片段经b a m h l 和e c o r i 双酶切，定向克隆到b a m m 和 点幻i u 双酶切的p e l _ 2 2 b ( + ) 质粒上经t 4 d n a 连接酶将其连接，构建重组质粒 p e t 2 2 b - a g a l ( 图2 3 ) 图2 3 重组质粒p e t 2 2 b - a g a l 构建图谱 山东大学硕士学位论文短双歧杆菌廿半乳糖昔酶基因及其重组表达研究 ( 3 ) 重组子的筛选和酶切鉴定 p e t 2 2 b - a g a l 与p e t 2 2 b ( + ) 质粒一起进行琼脂糖电泳，分子量较p e t 2 2 b ( + ) 质粒大的质粒可能是带有目的的基因片段的重组子。p e t 2 2 b a g a l 用b a m h i 和 e c o r i 双酶切得到大小两个片段，大片段约5 6 k b ，与p e t 2 2 b ( + ) 质粒的双酶切片 段一致，小片段约约2 0 k b ，大小与p c r 产物相一致。由此可初步认为p e t 2 2 b a g a l 含有a 半乳糖苷酶基因茆图24 。 图2 4 重组质粒p e t 2 2 b - a g a l 酶切产物琼脂糖凝胶电泳图 i 、2 p e t 2 2 b - a g a l f 七o r i + b a m h l ；3 、4 p e t 2 2 b - a g a l e c o r i ；5 p e t 2 2 b a g a i ； 6 分子量标准nd n a p r l i n d l i i 。2 3 1 3 、9 9 2 、6 5 6 、4 3 6 、2 3 2 、2 0 3 、5 6 4 k b ) 2 4 2 半乳糖苷酶基因在e c o i l 中的表达 将含有a 半乳糖苷酶基因的重组质粒p e t 2 2 b - a g a l 转化e c o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 。 将重组子菌株过夜培养，按1 接种量接于l b 液体培养基( 含a m p l 0 0 p g m 1 ) 3 7 培养至对数前期，按终浓度0 2 m m 加入i p t g 诱导5 小时，破细胞测定u 一半 乳糖苷酶活力为2 8 9u n i t s m g 。 2 4 3 重组的a