（动物营养与饲料科学专业论文）茶多糖的化学修饰及其衍生物的降血糖活性研究.pdf

摘要 国内外已有很多研究报道，证实茶多糖具有显著的降血糖功能，但关于茶多糖化学 修饰的研究还未见报道。本论文以中性茶多糖为原料，对其进行化学修饰，以制备高活 性的降血糖多糖衍生物。 采用吡啶磺酸法合成硫酸酯化茶多糖，茶多糖与f e 3 + 、c a 2 + 溶液反应制备茶多糖的 金属络合物。动物实验表明，茶多糖经硫酸酯化以后降血糖活性显著提高( p o 0 1 ) ； t p s f e 的降血糖活性显著提高( p o 0 5 ) ，而t p s c a 降血糖活性变化不显著，这可能 与茶多糖空间结构改变有关。 对茶多糖硫酸酯化研究表明，酯化试剂比例、反应温度和反应时间是影响茶多糖硫 酸酯化修饰的重要因素，得到的最佳工艺条件是：酯化试剂比例为l ：3 ，反应温度为6 0 ，反应时间为4h ，产物的取代度和得率可分别达到1 9 3 、7 7 6 l 。 茶多糖在硫酸酯化过程中有部分降解。硫酸酯化茶多糖经d e a e s e 曲a r o s ef f 分 离，当取代度为1 4 3 时得到三个级分：s t p s o p s 为o ) 、s t p s a ( d s 为o 9 7 ) 、 s t p s b ( d s 为1 5 4 ) ：取代度为1 9 3 时得到三个级分：s t p s c ( d s 为0 9 1 ) 、s t p s - d ( d s 为1 5 1 ) 、s t p s e ( d s 为2 1 3 ) 。经高效凝胶色谱s e p h a c r y ls 一3 0 0h r 层析，琼脂糖凝胶 电泳分析表明：s t p s b 、s t p s e 2 、 s t p s e 1 、s t p s c 2 、 s - t p s c 1 都是均一多 糖。 对比分析茶多糖及硫酸酯化茶多糖的红外光谱图及核磁共振图谱发现，初步推断硫 酸基团主要是在t p s 的c 6 位上发生取代。 s t p s d ( d s 为1 5 1 ) 的清除自由基的能力、增强s 0 d 活性的能力、降血糖活性 都最强。硫酸酯化茶多糖的降血糖机制可能是通过促进机体对s o d 等抗氧化剂的生物 合成，提高小鼠机体内的s 0 d 活性，从而增强机体清除自由基的能力，减轻四氧嘧啶 所产生的自由基对胰岛b 细胞的损伤。 关键词：茶多糖化学修饰硫酸酯化降血糖 江南大学硕：l 学位论文 a b s t i a c t t e ap o l y s a c c h a r i d e s ( t p s ) h a v eb e e nr e p o n e dg o o dh y p o g l y c e m i ca c t i o na th o m ea 1 1 d a b r o a d h o w e v e r f e wr e p o r t sw e r ei n v 0 1 v e di ni t sc h e m i c a l l ym o d i f i e dd e r i v a t i v e s i nt h i s s t u d y ，n e u t r a lt p s sw e r ec h e m i c a l l ym o d i f i e db yd i f f e r e n tm e t h o d st oe n h a n c et h e i r h y p o g l y c e m l ca c t l v l t l e s s u l f a t e dt p s sw e r es y n t h e s i z e db yp y 删i n e s u l f o n i ca c i dm e m o d m e t a l t p sc o m p l e x s w e r ep r e p a r e d 、v i mr e a c t i o n so ft p ss o l u t i o na n df e p ，c 一+ r e s p e c t i v e l yt h er e s u l t so b t a i n e d f 而ma n i m a ie x p e 面n e n t si n d i c a t e dm a tt h eh y p o g i y c e m i ca c t i v i t i e so fs u l f a f e dt p s 、e r e i m p m v e ds i g n i f i c 锄t l y ( p o 0 1 ) c o m p a r e dt om eu 砌o d m e dt p s ，t p s f ec o m p l e xw a s h i 曲e rt h a l lu n m o d m e dt p s ( p 0 0 1 ) b u tt i l e r e w a sn os i g n i f i c a md i 虢r e n c eb e t w e e n t p s - c aa i l du 姗o d i f i e dt p s ，w 1 1 i c hw a sp r o b a b l yi n v 0 1 v e di nt h es p a c i a ls t m c t u r eo ft p s a n dd i r e n tt p sd e r i v a t i v e s n l es u l f a t i o ne 髓c t so ft e ap o l y s a c c h a r i d ew e r em a i n l ya 腩c t e db yt h em o l a rm t eo f c h l o r o s u l f o n i ca c i dt op y r i d i n e ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nt i m e t h er e s u l t so fo r m o d o x e x p e d m e n t se x 陆b i t e dt h eo p t j m a jc o n d i c j o n so fs u l f a i o no ft p s ： 1 ：3v 川u m em t i oo f p y r i d i n ea n dc h l o r i n es u l f o n i ca c i d ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r eo f6 0 ，r e a c t i o nt i m eo f4h t h e d so f t h ed e r i v a t i v ea n dy i e l dr a t i ow e r c l 9 3a n d7 7 6 l r e s p e c t i v e l y t h et p sw a sp a n l yd e 伊a d e dd u r i n gs u l f a t i o np r o c e s s s u l f a t e dt p s sw e r em r t h e r p 嘶f i e d t h r e e 胁c t i o n sw e r eo b t a i n e d f r o ms u l f a t e dt p s sw i t hd so fl ，4 3 ，n 啪e l y s t p s o ( d s ，o ) ，s t p s a ( d s ，0 9 7 ) ，s t p s b ( d s ，1 5 4 ) t h r e ef h c t i o n s 、耽r ea l s oo b t a i n e d f 而ms u l f 缸e dt p s sw i t hd so f1 9 3 ，n a m e l ys t p s c ( d s ，o 9 1 ) ，s t p s d ( d s ，1 5 1 ) ， s t p s e ( d s ，2 1 3 ) s t p s b ，s t p s e 2 ，s t p s e 1 ，s t p s c 2a n ds - t p s c l 、v e r e h o m o g e n e o u sp 0 1 y s a c c h a r i d e si d e n t i f i e db ya g a m s eg e le l e c t m p h o r e s i s t h es 0 3 - g r o u pw o u l db ee a s 1 ys u i f a t e da tc 一6o ft h es u g a ru n i tf r o mf t i ra n dn m r s p e c t r ao f t p sa n d i t ss u l f 乱ed e r i v a t i v e s i nc o n c l u s i o n ，s t p s d ( d s ，1 5 1 ) h a dr e m a r k a b l er a d i c a l 一s c a v e n g i n ga c t i v 时a 1 1 d h y p o g l y c e m i ca c t i v i t y o nd i a b e t e sm i c e i tc o u l di m p r o v et h ea c t i v i t yo fs o d t h e m e c h a i l i s mo fs u l f a t e dt p s 啪sp r o b a b l yt h a ti te n h a f l c e dt h eb i 0 1 0 9 i c a ls y n l h e s i so fs o d a n di m p r o v e di t ss u p e r o i d e 越o nf k er a d i c a l 一s c a v e n g i n ga c t i v i t y ，w h i c hd e c r e a s et h e o x i d a t i v ed 扪a g eo fb c e ui n d u c e db ya u o x a l l k e y w o r d s ：t e ap o l y s a c c h a r i d e ；c h e m i c a lm o d m c a t i o n ；s u l f a t i o n ；h y p o g l y c e m i c v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 日期吱呓年么月，声 | 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名：盟 日期：孓产舒矽月于日 第一章绪论 1 1 茶多糖的研究进展 第一章绪论 多糖广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是构成生命的四大基本物质 之一。多糖因其具有多种生物活性而越来越受到人们的关注。目前已经或正在开发的 植物多糖有人参多糖、枸杞多糖、魔芋多糖、黄芪多糖、天冬多糖、板兰根多糖、女贞 子多糖、茶叶多糖、紫菜多糖等十余种【2 】。然而在天然植物中多糖含量较高的植物，大都 是人参、大麻、灵芝等中草药，价格昂贵，而且资源有限。于是国内外开展了从中低档茶 叶中提取茶叶多糖应用于食品、医药等领域的研究。茶多糖通常是茶叶中茶类、果胶、 蛋白质等组成的一类复合物，约占茶叶干物质的2 0 【3 】。茶叶原料的老嫩程度对茶多糖含 量的影响很大，并表现出随茶叶粗老程度的递增，茶多糖的含量增加。经药理实验，茶多糖 进入人体后，可抗凝血、抗血栓、降血糖、降血脂、延缓衰老1 4 j ，并可在短时间内增强肌 体的非特异性免疫能力肪治糖尿病和甲状腺肥大，还可有效地抗辐射，改善造血功能和 保护血液等，茶多糖优异的药理性能，决定了它在医药、食品和食品功能添加剂等领域具 有广阔的开发应用前景【5 j 。 1 1 1 茶多糖的提取 溶剂、p h 、和料液比是影响茶多糖提取率的重要因素，这四个因素种，p h 对茶多 糖的活性影响最大【5 击】。同时茶叶的产地、品种、制茶工艺、茶叶老嫩以及树龄都影响 茶多糖的含量，因此原料的选择对茶多糖的提取率影响很大j 。同一茶叶原料，采用不 同的提取方法所得到的t p s 性状、纯度不同，生物活性也不相同【8 j 。清水岑夫【9 j 的研究 表明保持茶叶最佳降血糖作用的浸提温度还与茶叶的种类有关。故对不同茶叶品种，要 采用不同的浸提温度，在保持最佳药理活性的前提下，尽量提高提取率。汪东风j 等研 究证实，茶多糖热稳定性较差，6 0 以上降解加快。 1 1 2 茶多糖的分离纯化 从茶叶中提取茶多糖的工艺很多，基本上可归纳为单独提取法和综合提取法【1 0 】，但 普遍存在着提取的多糖得率低，纯度不高，活性低等问题。近年来，酶法，超声波、微 波等常用于辅助茶多糖的提取。 1 1 3 茶多糖的纯化 茶叶粗多糖的颜色较深，应根据所含色素的理化性质采取相应的脱色方法。常用的 方法有离子交换法、氧化法、金属离子络合法、吸附法等【l l 】。 茶多糖中的含有大量蛋白质等杂志。大多采用s e v a g 去除，缺点是一次只能除去少 量蛋白质，一般需多次反复方能除尽，茶多糖常因多次除蛋白而损失【】。三氟三氯乙烷 江南大学硕士学位论文 法脱蛋白效率较高，但因其易挥发，不宜大量应用。 多糖在不同的浓度的有机溶剂中溶解度不同。多糖不溶于乙醇或甲醇、丙酮而沉淀 析出。黄桂宽【l2 j 等加入乙醇使提取液含醇量达8 0 来纯化茶多糖；李布青等【1 3 】利用溴化 十六烷基三甲基铵与酸性多糖阴离子形成不溶性络合物，他们将提取液先用c t a b 二次 沉淀，2 0 n a c l 溶解后，离心，上清液再加2 倍体积的丙酮沉淀，所得茶多糖中总糖含 量5 1 2 ，降血糖效果最佳。k e n i c l l i 等【1 4 】用超滤法制备出纯化的茶多糖。 阴离子交换剂d e a e 。纤维素适合于分离各种酸性、中性多糖和碱性多糖。李布青等 【1 3 】将脱蛋白后的茶多糖用d e a e 一纤维素柱层析，0 1 n n a 0 h 洗脱，获得较纯的茶多糖。 对于脱色后的茶多糖可以采用凝胶柱层析。凝胶柱层析是根据多糖分子的大小和形 状不同进行分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶( s e p h a m s e ) 。王丁刚等【1 5 】采用s e p h a d e x g 一1 0 0 层析纯化茶叶多糖。汪东风等将粗多糖过s 印h a d e xg 2 0 0 柱，0 1m o l ，ln a c l 溶 液洗脱，得茶多糖的纯化品。 1 1 4 茶多糖的结构研究 茶多糖经过分离纯化，被确认为单一多糖后便可进行结构分析，已使用的分析手段 主要有物理方法和化学方法1 1 7 】。物理方法常使用的有：g c 和g s m s 联用法：用于 测出多糖的组成及各单糖之间的摩尔比。此法要求所测样品具有一定的挥发性，因此待 测样品多需制备成硅烷衍生物和乙酰化衍生物等。核磁共振光谱( n m r ) 法：用于 确定多糖结构半糖苷键的构型以及重复结构中单糖的数目。一般用心m r 图测定简单 多糖，c n m r 测定复杂的多糖，因为后者的化学位移较宽些。紫外光谱法：在2 6 0 2 8 0 啪处用于检测多糖中是否含有蛋白质、核酸、多肽类。红外光谱法：用于确定 吡喃糖的糖苷键构型及其他官能团。 化学方法中以酸水解法应用最多，它可分为完全水解法和部分酸水解法，用于鉴定 多糖中单糖组分或多糖中的低聚糖【1 ”。其他化学方法有过碘酸氧化、s m i t h 降解、甲基 化反应、碱降解等化学降解法，用于多糖结构中苷键的构型、单糖之间的连接部位确定 等。但在实际分析时，通常需要物理方法和化学方法结合起来，才能完成多糖的结构测 定。 1 1 5 茶多糖的生物活性 1 1 5 1 降血糖作用 据报道，日本用3 0 年以上树龄的茶叶制成的淡茶，经糖尿病患者饮用一段时间后， 可使症状减轻。t a k e o 等1 1 9 j 人采用合成树脂h p 2 m g 从绿茶浸提液中分离出的t p s ，有明 显的降血糖效果。周杰等、汪东风等川、王丁刚等吲研究了绿茶t p s 对正常小鼠血糖 以及由四氧嘧啶( a l l o x a l l ) 诱导的高血糖小鼠的作用，均证实t p s 有明显的预防糖尿病 和降血糖效果。如王丁刚等1 2 2 j 给正常小鼠口服( 叩) 剂量为5 0m g l 【g 和1 0 0m g l ( g 绿茶茶 多糖后血糖浓度分别下降1 4 和1 7 ，腹腔注射剂量( i p ) 为2 5m 班g 和1 0 0m g l ( g t p s ，7 h 第一章绪论 后，血糖浓度分别下降4 8 和5 2 ；当i p 给予茶多糖1 0 0m g l 【g7h 后可使四氧嘧啶所致 高血糖小鼠的血糖明显下降( p o 0 1 ) 。李布青掣1 3 1 报道，用丙酮沉淀获得的茶多糖 降血糖作用最佳。实验结果表明，茶多糖在降低四氧嘧啶高血糖模型小鼠的血糖浓度的 同时肝糖原大量增加，说明茶多糖对糖代谢的影响与胰岛素类似。 1 1 5 2 清除自由基作用 不同产地、茶树品种以及栽培条件下的茶多糖的清除自由基的能力不一样。陈海霞 怛3 j 发现茶多糖( t p s ) 在体外对超氧阴离子自由基( 0 2 ) 、羟自由基( o h ) 和脂 质自由基( r ) 有清除作用，通过比较不同来源t p s 的抗氧化活性大小，发现t p s 的来 源对其抗氧化能力具有显著的影响，如从湖北宣恩低档富硒绿茶中分离纯化所得的 t p s a ，比从一般低档绿茶中分离所得的t p s b 的抗氧化活性要显著。 1 1 5 3 降血脂作用 王丁刚等【”1 报道，高脂血症大鼠吞服茶多糖2 2 5m g l ( g 1 0d 和4 5m g 瓜g 1 0d ，总 胆固醇分别下降1 2 和1 7 ，甘油三酯降低1 5 和2 3 ，低密度脂蛋白胆固醇分别下降 6 和2 9 ，高密度脂蛋白均增加2 6 。 1 1 5 4 抗凝血及抗血栓作用 王淑如等口6 j 报道，茶多糖在体内、体外均可显著延长血凝时间。实验表明，茶多糖 明显延长血栓形成时间，缩短血栓长度，从而起到抗血栓的作用。 1 1 5 5 增强机体免疫功能 茶多糖能增强机体的免疫能力。汪东风掣2 5 1 对小鼠皮下注射茶多糖，然后腹腔注射 羊红细胞免疫，6d 后静脉取血，结果表明，茶多糖浓度在3 0 1 0 om m l 范围内具有 以血清凝集素为指标的体液免疫增强作用，其中以3 0 m 咖l 效果最佳，与对照相比在p o 0 5 ) ，硒化黄芪多糖的抑瘤率5 1 1 4 ( p 0 0 5 ) ，并发现硒化黄芪多糖对小鼠s 1 8 0 肉瘤有较强的抑制作用。朱建伟【6 i l 等研究发现： 灵芝多糖锗可抑制小鼠s 1 8 0 肉瘤的生长，能增强荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的活性。 其它化学修饰方法如磷酸化、棕榈酸化、磺酸化、硬脂酰化、碘化和氨化、烷基化 等，在多糖分子的结构修饰中也有应用。 1 2 2 生物工程修饰 1 2 2 1 基因工程技术对多糖的结构修饰 微生物具有繁殖速度快的特点，为工业化大量生产活性多糖提供了可能。然而，许 多天然微生物多糖还不具备理想的活性结构，因此，需要通过操纵微生物基因表达或引 入外源基因来控制微生物体内多糖合成途径，从而产生所需的多糖，这便是基因工程在 多糖结构修饰中的应用。对一野生酵母菌通过引入外源基因使其胞内多糖结构发生突 变，支链糖基取代度从o _ 2 提高到o 5 ，且空间构象变得更为舒展，单螺旋结构的比例提 高，多糖体外抗肿瘤活性比修饰前提高3 5 倍左右【6 ”。 目前，基因工程在多糖结构修饰方面的应用尚属起步阶段，还面临一些问题，如操 作的不稳定性、外源基因获取困难等。 1 2 2 2 酶法对天然多糖的降解 酶技术由于具有专一性强、选择性好、无副作用等优点而在多糖结构修饰方面日益 受到重视，目前由于多糖结构修饰的酶主要是一类糖苷酶，其用途在于降解多糖的主链， 某些p e r t o s t r e p t o c o c c u s 和e u b a c t e r i l l i i l 的革兰氏阳性厌氧菌可产生肝素降解酶，它能特 异性地裂解肝素上具有特殊修饰基团( 如羧甲基、乙酰基) ，而使肝素具有不同的药理 活性【6 3 1 。积极开发其它类型的酶如：转移酶、合成酶，必将丰富酶技术在多糖结构修 饰中的应用。 1 2 3 物理方法修饰 采用低频( 1 m h z ) 、高强度( 3w c m 2 ) 的超声波，可通过增加质点震动能量来切 断生物大分子中的某些化学键，从而降低相对分子质量，增加水溶性，提高生物学活性。 例如，超声波降解褶菌多糖后，相对分子质量分布在较窄的范围内，而多糖空间构象未 发生变化，使其抗肿瘤活性与母体保持不变，但降解后相对分子质量和特性粘度等物理 参数明显降低，从而有利于临床上的应用i “l 。一种具有b ( 1 ，3 ) 一葡聚糖结构的真菌 多糖( c i n e r e a l l ) 经过长时间的超声处理后，相对分子质量从2 5 万降至5 万左右，经小角 度x 光衍射分析，c i n e r e a n 超声降解产物的空间结构与具有免疫调节活性的裂褶菌多糖 相似【6 5 1 。除了超声波外，其它物理场也用于多糖结构修饰，如有报道用v 一射线降解肝 素制备安全、高效、低相对分子质量的肝素制品。 江南大学硕：i ：学位论文 多糖的衍生化为多糖带来新的结构，引起多糖理化性质和立体构象的变化，导致活 性的变化。有的能显著提高多糖的活性，甚至为多糖带来新的活性，但是多糖的衍生化 也有可能使原有活性减弱或丧失，因此多糖衍生化关键在于确定多糖的结构与活性关 系。因此，有人提出以“活性构象”为分子模型，指导多糖衍生化，确保多糖在衍生化 后活性中心的立体构象处于最佳状态，为活性筛选及构效关系分析提供更多的多糖衍生 物，开发出更多高效低毒的新型多糖类药物。 1 3 立体背景与意义 我国是主要的产茶叶国家之一，目前茶叶年产量达1 0 0 万吨之多，其中低档的粗老 茶叶就有1 0 多万吨。能充分利用低档茶叶，从中综合提取茶多糖等相关活性成分，不仅 可以提高经济效益，促进茶业的发展，而且对药理学研究和临床应用研究、促进入类健 康具有重要意义。 目前国内外对茶叶多糖的研究主要集中在茶多糖的提取、分离、纯化，以及结构的 研究。药理作用的研究主要集中在降血糖、降血脂等方面，但是从研究报道发现，分离 纯化后得茶多糖，特别是中性多糖，由于其溶解性等方面的原因，其生物活性还不是很 明显。目前对茶多糖的化学修饰及其分子修饰产物的活性还很少见到深入的报道。 1 4 主要研究内容 本论文主要是利用本实验室已经制各得到的中性茶多糖为原料，通过对茶多糖的化 学修饰，研究其降血糖活性的变化，并探讨茶多糖结构的改变与降血糖提高的关系。主 要研究内容如下： 1 ) 通过硫酸酯化、茶多糖络合铁、茶多糖络合钙等方法对茶多糖进行分子修饰，并且 对修饰后的修饰产物进行降血糖活性实验，筛选出降血糖活性强的分子修饰产物。 2 ) 对筛选出来的硫酸酯化分子修饰产物进行进一步深入研究，优化其制各工艺进行。 3 ) 采用离子交换层析和分子筛层析对制备得到的不同取代度的硫酸酯化产物进行分离 纯化，并对其理化性质进行研究。 4 ) 对茶多糖分子修饰前后的结构及降血糖活性的机理关系进行探讨。 8 第二章茶多糖的化学修饰及其降血蓿活性的筛选 第二章茶多糖的化学修饰及其降血糖活性的筛选 2 1 前言 通过结构修饰可以改变多糖的空间结构、相对分子质量及取代基种类、数目和位置 而对其活性产生影响。这方面的工作虽然起步比较晚，但已经取得了不少成果。多糖含 有活性羟基、富电子毗哺环、桥氧等功能基团，有的多糖还含有羧基、氨基，在适当条 件下，易发生多类化学反应。多糖的化学修饰就是通过化学方法对多糖化合物分子进行 改造，通过改变多糖的空间结构、相对分子质量机取代基种类、数目和位黄对多糖活性 产生影响，由此可以确定多糖的结构和活性的关系，并为多糖类药物的设计提供理论依 据。通过化学修饰引入合适的功能基，可以改变多糖的疏水作用力、亲水作用力、氢键 力和离子键力，改变分子问的加和协同性、方向性和选择性，从而对多糖的溶解度、稳 定性和黏度特性产生深远影响，提高活性和生物利用度，既可拓宽领域，又可以在应有 中更加安全有效。 本章通过对茶多糖的化学修饰，研究茶多糖及其修饰产物的降血糖活性变化，筛选 出降血糖活性强的化学修饰产物。 2 2 材料与仪器 2 2 1 实验材料 由本实验室经d 3 1 5 分离并经d e a e s e p h a m s ef f 得到的中性茶多糖t p s 嘶6 7 】；昆 明种小鼠，雄性，由无锡市山禾药业集团动物中心提供。 2 2 2 试剂 氯磺酸、吡啶( 使用前用n a o h 回流l oh ) 、三氯化铁、氯化钙、柠檬酸钠、氢氧 化钠、乙醇、硫酸钾、氯化钡、明胶、邻甲苯胺等均为国产分析纯；四氧嘧啶，a r 级， s i g m a 公司生产。 2 2 3 仪器和设备 s p e c t r a a 一2 2 0 型原子吸收分光光度计，美国v a r i a n 公司制造； 美国n i c o l e tn e x u s5 d x cf t i r 傅立叶变换红外光谱仪： r e 一5 2 a 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂生产： s h b i i i 型循环水真空泵，巩义市站街光亚仪器厂生产： 冷冻干燥机，1 8l ，瑞士l a b c o n c o 公司生产； j j 一1 定时电动搅拌器，江苏金坛荣华仪器有限公司生产； 9 4 2 型磁力搅拌器，上海闵行虹浦仪器厂生产； 马弗炉，上海实验仪器总厂： 9 江南大学硕士学位论文 u n i c o 紫外可见光分光光度计，上海尤尼可公司生产 透析袋，分子截留量为3 5 0 0 ( 上海绿鸟公司提供) ； d c 一5 0 1 超级恒温水浴，上海分析仪器厂。 2 3 实验方法 2 3 1 硫酸酯化茶多糖的制备 采用氯磺酸吡啶法【6 8 】，将附有冷凝管、分液漏斗和搅拌装置的三颈烧瓶于冰盐浴中， 加入吡啶搅拌待其充分冷却。在3 0 q om i n 内，慢慢滴加氯磺酸，直至有淡黄色固体出 现，加入用无水乙酰胺溶解好的茶多糖溶液，并迅速将反应装置移入6 0 超级恒温水 浴中，恒温搅拌1 oh ，反应结束后再度移入冰浴中，立即用4m o l 几的n a o h 溶液将反 应液调节到p h 为7 ，加入五倍体积的乙醇，收集醇析的沉淀，复溶于少量水，流水透 析7 2h ，去离子水透析1 2h ，浓缩、冷冻干燥得硫酸酯化茶多糖。 2 3 2 茶多糖钙的制备 称取一定质量的茶多糖，溶于适量的去离子水中，在搅拌下，滴入与茶多糖摩尔比 约为5 ：l 的c a c i 2 溶液( 茶多糖的相对分子质量按1 6 i 计算) ，6 0 温度下搅拌反应1 5 h 。旋转蒸发浓缩溶液至适量体积，然后加入5 倍体积的工业乙醇，析出沉淀，过滤。 收集沉淀，用无水乙醇多次洗涤，至滤液中无氯离子( 用硝酸银溶液检查是否产生沉淀) 检出。透析、冷冻干燥产物，得到淡黄色粉末茶多糖一钙配合物。 2 ，3 3 茶多糖铁的制备 取适量茶多糖，加入柠檬酸钠作为催化剂，溶于3 0m l 去离子水中，在6 0 恒温 水浴中不断搅拌，同时滴加2m o l ，l 三氯化铁溶液和2 0 o 的n a o h 溶液，调节滴加速 度，控制反应液的p h 值为8 ( 用p h 试纸检验) ，反应中不断滴入的f e c l 3 溶液，当反 应中有沉淀产生并不再溶解时，表明反应体系的络合能力已达到饱和，即停止滴加f e c l 3 溶液和n a o h 溶液，继续在6 0 水浴中搅拌1h ，反应冷却后，经醇沉、离心、透析 等步骤，制得茶多糖铁配合物。 2 3 4 茶多糖的红外光谱分析 红外光谱，将无水样品2 om g 与k b r 混匀、研磨后压片，用n i c o l e tn e x u s5 d x c f t _ i r 在5 0 0 一4 0 0 0c m 。1 范围内进行扫描。 2 3 5 硫酸基含量的测定 采用氯化钡明胶浊度法【7 0 】，取代度公式：d s = ( 1 6 2 s ) ( 3 2 1 0 2 s ) 。 其中： l o 第二章茶多糖的化学修饰及其降血糖活性的筛选 d s ：取代度； s ：样品中硫的含量。 标准曲线的制备：吸收一系列硫酸钾标准液( 1 0 m m ls 0 4 2 。) 于2 5 m l 比色管中， 用水补足，使其体积至1 0m l ，迅速加入o 1 8 lm o l l 盐酸l om l ( 明胶的质量分数是 0 5 ) ，摇振1 0s ，迅速加入氯化钡一明胶溶液( 氯化钡的质量分数是1 0 ，明胶的质 量分数是o 5 ) 2m l ，振摇2m i n ，以水为参比，于波长3 6 0 啪处测定吸光值，同时， 作空白试验。 样品中硫酸酯基的测定：称取多糖样品3 4m g ，加入4m o l l 盐酸，真空封管， 1 0 0 水解8h 后，减压蒸干，再用水溶解稀释到合适的浓度待测。 2 3 6 茶多糖络合物的铁、钙质量分数的测定 准确称量配合物样品0 2 0 0 0g 于干燥的坩埚中，碳化好以后放入马弗炉中，于5 0 0 5 5 0 下灰化2 h ，得灰白色粉末，冷却。将灰分用无机酸沈出，用去离子水定容后 至2 5m l ，于s p e c t r a a 一2 2 0 型原子吸收分光光度计上测定钙铁含量【7 ”。 2 3 7 茶多糖及化学修饰产物对四氧嘧啶糖尿病小鼠降血糖作用实验 2 3 7 1 四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的建立 健康雄性昆明种小鼠，购买回来后适应性饲养一个星期，选取体重1 8 之2g 的小鼠， 随机分笼，标记，称重，禁食1 2h 后腹腔注射四氧嘧啶2 0 0 m g 蝇，7 2 h 后，禁食1 2h ， 剪尾尖取血测血糖，血糖值在9 5m m o i l 以上者为糖尿病小鼠( d m ) 模型。 2 3 7 2 茶多糖( t p s ) 、化学修饰产物对糖尿病小鼠降血糖作用的实验方法 将实验型糖尿病小鼠随机分成5 组，模型对照组( d m ) 、茶多糖组、硫酸酯化茶多 糖组、茶多糖钙组和茶多糖铁组，同时设正常对照组( c k ) 。其中正常组( c k ) 及模 型对照组( d m ) 灌等体积的生理盐水，其它各组分别按2 0 0m g k g 的剂量灌胃，末 次灌胃前禁食1 2h ，灌胃后4h 、7 h 、1 1h 尾静脉采血测血糖f “。 2 3 7 3 血糖测定和统计学分析 血糖含量测定采用邻甲苯胺超微量法7 3 1 。该方法测定血糖浓度操作简易、灵敏度高、 显色后颜色的稳定性好。用s a s 厂v 8 版软件包进行数据统计，所用指标以均数士标准差 表示。 2 4 结果与讨论 2 4 1 硫酸酯化茶多糖的制备和表征 经阴离子交换树脂d 3 1 5 分离得到的经阴离子交换树脂d 3 1 5 分离得到的茶多糖吲， 再上d e a e s e p h a r o s ef f 阴离子交换柱，用p h 6 o 的o 0 2m o l ，l 的磷酸缓冲液洗脱得到 江南大学硕士学位论文 中性茶多糖( 以下简称t p s ) 。从其单糖组分分析表明【6 ”：t p s 半乳糖醇酸含量很低，主要 由半乳糖组成，以6 型差向异构为主，组成单糖以吡喃糖形式存在，其分子量为2 3 2 4 8 。 2 4 1 1 硫酸酯化茶多糖的制备 按照2 3 1 的方法制备硫酸酯化茶多糖s t p s ，并将其完全酸水解，采用2 3 5 的方 法测其硫酸根含量。通过测定表明，硫酸基含量在o 8 0u 咖l 范围符合比耳定律，回 归方程为y = 0 0 0 7 x o 0 3 4 l ，r 2 = o 9 9 8 8 ，其中y 表示3 6 0n m 下的吸光度，x 表示s 0 4 0 含量。对t p s 也进行完全酸水解，硫酸根未检出，表明t p s 本身不含硫酸根。 表2 1t p s 的硫酸酯化产物的得率和取代度 t a b 2 11 1 1 ey i e i da 1 1 dd so f s u l f a t e de s t e ro f t e ap 0 1 y s a c c h 撕d e s 由表2 1 可以看出，茶多糖硫酸酯化修饰以后硫酸基含量明显增加，说明硫酸酯已 经形成。中性茶多糖( t p s ) 的单糖组成主要是半乳糖6 7 l ，伯羟基数量多，且半乳糖醛 酸含量低，空间位阻小，容易发生硫酸酯化反应。 2 4 1 2 茶多糖硫酸酯化前后的红外光谱 图2 1 茶多糖( t p s ) 的红外光谱 f i g 2 1f t i rs p e c t r ao f t e ap o l y s a c c h a r i d e st p s 第二章茶多耱的化学修饰及其降血籍括性的筛选 图2 2茶多糖硫酸酯化产物f s t p s ) 的红外光谱 f 嘻2 2 f t i rs p e c t r ao fs u l f 乱e dt e ap o l y s a c c h 撕d e s ( s t p s ) 从硫酸酯化茶多糖的红外光谱f 图2 1 、图2 2 ) 可知，硫酸酯化茶多糖在2 9 2 9c m ， 1 4 1 4c m 一，1 0 5 0c m l 附近仍有多糖母体特征的吸收峰，硫酸酯化后，t p s 位于3 4 2 2c m _ 1 的羟基吸收峰移向高波数3 4 4 4c m - 。；s t p s 在1 2 5 8c m 、1 1 2 7c m 、8 3 2 c m 一、6 1 7 c m 一和5 8 4c m “处都出现了硫酸酯键强的特征吸收峰，其中1 2 5 8c m - 1 是由不对称s = 0 伸 缩振动引起，8 3 2c m “的吸收峰是由对称的c 一0 一s 振动引起的。在8 3 2c m 叫宽的吸收 峰表明在半乳糖残基c 一6 位接上了处于平伏键的硫酸酯基；在1 1 2 7c m 。的强吸收带可能 是由反对称c o s 伸缩振动引起的。8 3 2c m _ 1 和1 1 2 7c m 一1 处的两个吸收带和c o h 和 c o c 伸缩吸收带重叠1 4 2 】。茶多糖t p s1 2 4 9c m _ 。、8 3 2c m 。处有吸收，但吸收较弱。同 时，还可以看出，在1 7 3 3c m - 1 附近的羧基吸收峰在t p s 中消失。表明部分羟基已被硫酸 酯化，掩盖了羧基的吸收。以上说明多糖已形成硫酸酯。 2 4 2 茶多糖钙、茶多糖铁络合物的制备 茶多糖分子中存在一些活性基团如羟基、羧基，使得其具有良好的金属配位能力， 可与金属离子形成络合物。很多情况下形成的配合物不仅没有影响茶多糖的某些生物活 性反而增强了这些功能。 表2 2 茶多糖与钙、铁络合物的金属离子含量及得率( ) t a b l e2 21 1 1 ey i e l da n di o nc o n t e n to f t e ap 0 1 y s a c c h 撕d e sc o m p l e x e s 茶多糖络合物 络合前f e 忿a络合后f “c a 含 茶多糖络合的得率( ) 样品 含量( u g 佗)量( u g 幢)f e c a 量( u g 悖) t p s c a8 2 6 7 3 0 土4 8 6 0 54 8 7 7 3 6 6 士2 3 1 9 0 8 4 0 5 0 6 3 6 士2 8 0 5 1 36 3 7 1 t p s f e5 9 3 3 士3 7 l15 1 6 9 士4 3 49 2 3 3 士1 1 0 54 6 0 7 由表2 2 可知，t p s c a 得率较高，络合程度也高，而t p s f e 得率较低，络合程 江南大学硕士学位论文 度也低得多。这可能有以下原因：茶多糖在三氯化铁溶液的一个强酸性的环境中，多糖 的降解程度估计要大一些，络合程度也就低一些；络合程度高低与金属离子所带电荷也 有一定关系。 按照2 3 2 和2 - 3 3 的方法制各茶多糖钙、茶多糖铁，采用原子力吸收光谱测定络合 前后的钙、铁质量分数。 2 4 3 茶多糖钙、茶多糖铁络合物的红外光谱 图2 3 、图2 4 为茶多糖钙、茶多糖铁络合物的红外光谱图。同茶多糖t p s 红外光 谱图( 图2 1 ) 相比较，可以看出，两种配合物保留了多糖的特征吸收峰，但茶多糖在 3 4 1 9 c m 。1 附近的羟基( o h ) 吸收峰在t p s c a ，t p s f e 中明显增强，且向高波数移动， 与茶多糖的羟基配位后，使得一o h 的氢键缔合作用减弱，因而在3 4 1 9c m - 1 处的吸收峰 增强；在1 7 3 0c m 。附近的羧基( 一c 0 0 h ) 中的c = 0 伸缩振动吸收峰则在钙配合物 中消失，茶多糖铁在1 7 3 0c m 。1 附近的羧基( 一c o o h ) 的吸收峰则变弱；茶多糖位于 1 4 1 4c m 。处羧基( 一c 0 0 h ) 的c o 的伸缩振动或次甲基的一c h 变角振动在钙配合 物移向高波数1 4 1 9c m 。1 处，铁配合物中移向高波数1 4 2 1c m 一，说明羧基( 一c o o h ) 中的c o 参与了配位；位于1 1 0 1c m 。的伸羟基吸收峰在钙配合物中移向1 0 9 4c m ；位 于l o l 7c m 。处羧基( 一c 0 0 h ) 的0 一h 吸收峰，在钙配合物中移向1 0 0 5c m 一；伯羟基 的伸缩振动在两种配合物红外光谱中变化都不明显，说明配体中的伯羟基参与配位的可 能性不大。 从茶多糖对c a 2 + 、f e ”的络合情况可以看出，茶多糖对不同的金属离子的配位方式 不同，配位能力大小也不同，茶多糖可能以仲羟基和羧基的c 0 配位为主。 图2 _ 3t p s f e 络合物的红外光谱 f i g 2 3 f t i rs p e c t mo f t h ec o m p l e xt p s f e 4 第二章茶多糖的化学修饰及其降血耱活性的筛选 图2 4t p s c a 络合物的红外光谱 f i g 2 4 f t i rs p e c 仃ao f t h ec o n l p l e xt p s c a 2 4 4 茶多糖及其硫酸酯化产物、金属离子络合物降血糖活性 表2 3 为茶多糖及其硫酸酯化产物、金属离子络合物对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的 影响。 表2 3 茶多糖及衍生物对四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖的影响( n = 1 0 、。s ) t a b 2e f f 毫c to f t p s 、s t p sa n dm e t a lc o m p l e x e so nb i o o dg l u c o s eo f a l l o x a ni n d u c e dd i a b e t i cm i c e ( n = 1 0 、x 士s ) 与正常对照组比较，b b ：p 0 0 1 非常显著，b ：p o 0 5 显著 与模型对照组比较，a a ：p o 0 1 非常显著，a ：p o 0 5 显著 从表2 3 可以看出：注射注射四氧嘧啶以后小鼠的血糖较正常对照组显著升高( p 江南大学硕士学位论文 o 0 1 ) 。第七天给药后茶多糖组及茶多糖修饰产物组均比模型对照组血糖水平极显著 降低( p o 0 1 ) ，给药l lh 小时后，血糖值又有所回升。 茶多糖及茶多糖分子修饰产物都有显著降低血糖的能力。茶多糖经硫酸酯化后，降 血糖活性提高最为显著。 茶多糖与茶多糖的金属络合物的降血糖活性的比较可以看出，茶多糖经钙络合以 后，降血糖活性有所降低，而经铁络合以后，降血糖活性有较大幅度的上升而且降血糖 活性表现得更为持久。其原因可能为：茶多糖多糖与钙离子络合以后，其空间机构有很 大的改变使其茶多糖的活性位点被隐藏起来，导致茶多糖络合钙的降血糖活性降低，而 相反的情况，茶多糖络合铁以后，空间结构的改变正好使其活性位点更加显露出来，从 而提高了降血糖的活性，更容易与其受体相结合。 综合以上结果，茶多糖化学修饰以后，硫酸酯化茶多糖的降血糖活性提高显著，作 为以后茶多糖化学修饰的研究重点。 2 5 本章小结 1 ) 吡啶一氯磺酸法能有效的制各得到硫酸酯化茶多糖。硫酸基取代度和红外光谱的 检测都表明已经形成硫酸酯化茶多糖，修饰后的硫酸酯化茶多糖有明显的硫酸酯键的特 征吸收。 2 ) 茶多糖与金属钙离子和金属三价铁离子的反应形成茶多糖金属络合物，通过金 属离子含量的检测及其红外光谱图可以确定已经形成了金属配合物。化学修饰后金属离 子含量明显升高，并且茶多糖钙的络合程度远高于茶多糖铁。 3 ) 通过降血糖活性实验比较，茶多糖经硫酸酯化以后降血糖活性显