（动物营养与饲料科学专业论文）南江黄羊生长轴主要基因多态性与生长性状关系的研究.pdf

摘要 为寻找南江黄羊快长品系标记辅助选择可用的分子标记，本研究将以4 0 5 只南江黄羊为试验 动物，以生长轴主要基因( g h r h 、g h 、g h r 、i g f i 和i g f b p 3 ) 为候选基因，利用p c r - s s c p 技术和d n a 序列分析技术筛选其多态位点，并与南江黄羊的生长性状进行关联分析，以期筛选与 南江黄羊生长性状相关的分子标记本研究分五个部分进行： ( 1 ) 检测了g h 基因外显子3 、外显子4 、外显子5 和内含子2 的多态，序列分析比对结果发现 外显子3 有2 个s n p s ( 9 8g a ；1 0 8g a ) ，外显子4 有个4s n p s ( 2 7g a ；6 8c a ；1 3 6g a ；1 7 0c t ) ， 外显子5 有3 个s n p s0 6c 化1 8 7 c 化2 0 2c o ) 和1 个碱基插入( 2 4 1c 插入) ，其中有5 个s n p s 引起 了氨基酸替代；与南江黄羊生长性状的关联分析结果显示：外显子3 的s n p 多态与2 月龄体重、周 岁体重和体商、胸围性状存在显著相关( p 0 0 5 ) ，b b 基因型是周岁体重、体高和胸围性状的有 利基因型，其在发挥效应上表现为显性；外显子4 的s n p 多态与初生重、2 月龄体重、6 月龄体重和 部分体尺指标显著相关( p 0 0 5 ) ；f f 基因型是初生重、2 月龄体重、6 月龄体重、2 月龄体长和2 月龄胸围的有利基因型。其相关是来自于1 3 6 位点( g a ) 转换效应( 同义突变) 。外显子5 多态 与生长性状无关。 ( 2 ) 克隆得n c h r 基因的8 个外显子，检测了1 0 个外显子和5 调控区的多态，结果表明：在 g h r 基因5 调控区存在( g ) 1 0 、( g ) l l 与( g ) 1 4 多态和( 1 b ) 1 3 、( 1 g ) 1 4 与( 1 i g ) 1 7 多态，关联分析结果显 示该多态与2 月龄体重、6 月龄体重和周岁体重有关系，b d 基因型个体的2 月龄体重显著低于其他 基因型( p o 0 5 ) ；b d 基因型和a c 基因型个体的6 月龄体重显著低于a a 基因型、b b 基因型和c c 基因型个体( ， o 0 5 ) ；d d 基因型个体的周岁体重显著低于a a 基因型、b b 基因型和c c 基因型 个体( p ( o 0 5 ) 。基因效应剖分说明5 调控区多态对生长性状的影响主要来自于( g ) n 多态，且( g ) l o 等位基因是生长性状的不利基因。g h r 基因的1 0 4 、。# y 显子上未检测到多态。 ( 3 ) 检测了i g f - i 基因4 个外显子和5 调控区多态，结果表明：在外显子4 的编码区外( 内含 子4 ) 上存在g c 颠换多态，并与初生重和周岁体重有关系( p c g 初步认定c c 基因型可能是初生重和周岁体重和周岁体尺的有利基因型。4 个外显子与57 调控区未检测到多态。 ( 4 ) 克隆得到南江黄羊g h r h 基因部分片段( 外显子2 、内含子2 和外显子3 ) ，并检测了该片 段多态性，结果发现该片段不存在多态，6 种生物( 人、鼠、猪、奶牛、绵羊和山羊) 该片段编 码区序列同源性较高，保守性强。 ( 5 ) 检测了i g f b p 3 外显子2 ，内含子2 、外显子3 和外显子4 的多态，结果表明在这4 个位点不 存在多态。 g h 基因外显子3 、外显子4 、g h r 基因57 调控区和i g f - i 基因内含子4 上的多态可能是与南江黄 羊生长性状相关的分子标记，但还需要在南江黄羊群体和其他山羊品种中进一步的验证。 关键诃：生长轴主要基因，多态性，生长性状，南江黄羊 a b s t r a c t t h ep r e s e n ts t u d yw a sc o n d u c t e dt of i n dt h eg e n e t i cm a r k e r sa s s o c i a t e dw i t ht h eg r o w t ht r a i t si n n a n j i a n gh u a n gg o a t sf o rm a r k e ra s s i s t e ds e l e c t i o nl i n ew i t hh i g h e rg r o w t hr a t e at o t a lo f4 0 5 n a n j i a n gh u a n gg o a t sw e r eu s e dt od e t e c tt h ep o l y m o r p h i s m so f m a j o rg e n e so f g r o w t ha i x si n c l u d i n g g h r hg e n e ，g hg e n e ，g h rg e n e ，i g f - ig e n ea n di g f b p 3g e n et oa n a l y z ew h e t h e rt h e yc o u l db e c a n d i d a t eg e n e so rm o l e c u l a rm a r k e r st oi m p r o v et h eg r o w t ht r a i t s i nn a n j i a n gh u a n gg o a t s f i v e e x p e r i m e n t sw e r ed e s i g n e df o rt h i so b j e c t i v e e x p e r i m e n tl ：t h ep o l y m o r p h i s m sw e r ed e t e c t e da te x o n3 ， e x o n4a n de x o n5o f g hg e n e t h er e s u l t so f s e q u e n c ea n a l y s i sa n dm e g a l i g ns h o w e dt h a t2s n p s ( 9 8 g a ；1 0 8g a ) w a si n d e n t i f e di ne x o u3o f g hg e n e ，4s n p s ( 2 7g a ；6 8c a ；1 3 6g a ；1 7 0c 门_ ) i l i e x o n4o f g hg e n ea n d3s n p s ( 3 6c t ；1 8 7c t ；2 0 2c t ) a n dli n s e r t i o n ( 2 4 1ci n s e r t i o n ) i ne x e r t 5 o f g hg e n e t h ec o r r e l a t i o n sw e r eo b s e r v e db e t w e e nt h ep o l y m o r p h i s m so f e x o n3a n dt h et w o - m o n t h b o d yw e i g h t ，o n e - y e a r - o l db o d yw e i g h t t h el e a s ts q u a r em e a n so ft w o m o n t hb o d yw e i g h ta n d o n e - y e a r - o l db o d yw e i g h to fi n d i v i d u a l sw i t hg e n o t y p eb bw e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to f g e n o t y p ec ca n da c 俨 o 0 5 ) ；t h ec o r r e l a t i o n sw e r eo b s e r v e db e t w e e nt h ep o l y m o r p h i s m so f e x o n4 a n db i r t hw e i g h t ，t h et w o - m o n t hb o d yw e i g h t , t h es i x - m o n t hb o d yw e i g h t i n d i v i d u a l sw i t hg e n o t y p ef f h a dh i g h e rb i r t hw e i g h t , t w o - m o n t hb e d yw e i g h ta n ds i x - m o n t hb o d yw e i g h t 妒 o 0 5 ) t h em u t a t i o na t 1 3 6s i t e ( g a ) w a sr e s p o n s i b l ef o rt h et h i sc o r r e l a t i o n ，w h i c hi n d i v i d u a l so fg e n o t y p eg gh a v eh i g h e r b i r t hw e i g h t , s i x - m o n t hb o d yw e i g h tt h a nt h e s eo fg e n o t y p ea g “k 0 5 ) t h ec o r r e l a t i o n sw e r en o t f o u n db e t w e e np o l y m o r p h i s mo fe x o n5a n db o d yw e i g h ta n db o d yp h y s i c a lm e a s u r e s e x p e r i m e n t2 ： e i g h te x o n ss e q u m c ew e r ec l o n e d t e ne x o n sa n d57 f l a n k i n gr e g i o no fg h rg e n ew e r ed e t e c t e db y t e c h n i q u eo f p c r - s s c p gr e p e a ta n dg tr e p e a tp o l y m o r p h i s m sw e r ei d e n t i f i e di n5 f l a n k i n gr e g i o n o fg h rg e n e t h ea s s o c i a t i o na n a l y s i sr e v e a l e dt h a tp o l y m o r p h i s m sh a das i g n i f i c a n te f f e c to n t w o - m o n t hw e i g h t , s i x - m o n t hw e i g h t , o n e - y e a r - o l dw e i g h t t h eb dg e n o t y p eh a dl o w e rt w o m o n t h w e i g h tt h a nt h eo t h e rg e n o t y p e sr p o 0 5 ) t h eb dg e n o t y p ea n da cg e n o t y p oh a dl o w e rs i x - m o n t h w e i g h tt h a nt h ea ag e n o t y p e ，b bg e n o t y p oa n dc cg e n o t y p e 妒 o 0 5 ) t h ef u r t h e ra n a l y s i sr e s u l t s h o w e dt h egr e p e a tw a sr e s p o n s i b l ef o rt h ea s s o c i a t i o nw i t hb e d yw e i g h t e x p e r i m e n t3 ：f o u r e x o n sa n d5 f l a n k i n gr e g i o no fi g f - ig e n ew e r ed e t e c t e db yt e c h n i q u eo fp c r - s s c p p o l y m o r p h i s m s w a si d e n t i f i e da ti n t r o n4o fi g f ig e n e t h ec o r r e l a t i o n sb e t w e e ng e n o t y p e sa tt h i sl o c u sa n db i r t h w e i g h t , o n e - y e a r - o l dw e i g h tw e q - ef o u n d ( p 0 0 5 ) t h ec cg a n o t y p eh a dh i g h e rb i r t hw e i g h t ， o n e - y e a r - o l dw e i g h tt h a nc gg e n o t y p e ( p 0 0 5 ) t h ee f f e c to fg e n o t y p eo nb o d ym e a s u r e sw e r e n e a r l ys i g n i f i c a n t 0 1 ) e x p e r i m e n t4 ：p o l y m o r p h i s mo f p a r t i a lg e n eo f g h r h w a si n v e s t i g a t e db y t h et e c h n i q u eo fp c r - s s c p , b u tn op o l y m o r p h i s mw a sr e v e a l e d 砒p a r t i a lo fg h r hg e n ei nn a n j i a n g h u a n gg o a t s e x p e r i m e n t5 ：t h r e ee x o n sa n di n t r o n2o fi g f b p 3g e n ew e r ed e t e c t e db yt e c h n i q u eo f p c r - s s c eb u tn op o l y m o r p h i s m sw e r ef o u n d p o l y m o r p h i s m so fe x o n 3a n de x o n 4o fo hg e n e ， 57 f l a n k i n gr e g i o no f g h rg e n ea n di g f ii n t r o n4m a yb ei m p o r t a n tc a n d i d a t eg e n ec o n t r o l l i n gg r o w t h p e r f o r m a n c ei nn a n j i a n gh u a n gg o a t s k e yw o r d s ：m a j o rg e n ei ng r o w t hh o r m o n ea x i s ，p e l y m o r p h i s m s ，g r o w t ht r a i t s ，n a n j i a n gh u a n gg o a t s 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：狱备嚣时间：习年乡月f 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：务、错 导师签名： 时间：1 商7 年月fj 日 铽阃：a 年i ；其l fb 1 研究目的和意义 第一章绪论 南江黄羊是1 9 9 8 年由国家正式命名的肉羊新品种。它是采用杂交育种方法，经三十多年有计 划的选育而形成的。为进一步提高其优良种质特性，育种工作者积极开展南江黄羊的品系选育工 作，但常规的育种方法存在选择效率低、遗传进展缓慢等问题。 随着分子生物学技术的发展，9 0 年代初实施了畜禽基因定位的计划，开始寻找影响重要经济 性状基因( e t l s ) 或与之连锁的d n a 标记，并将其应用于畜禽的标记辅助选择( m a s ) ，大大加 快了畜禽育种工作的进展。但相对于猪和牛与e t l s 相关基因定位和基因多态标记研究，山羊的基 因定位及与e t l s 相关的多态标记研究严重滞后，到目前在山羊的基因连锁图谱上仅有3 0 7 个q t l 位点【l j ，其0 0 2 9 8 是微卫星标记【2 ，”，只有少数与e t l s 相关的多态标记。而猪的几乎所有的染色体 上都发现了影响经济性状的数量基因座位( q t l ) ，位点数目多达1 6 7 5 个【4 j ；2 0 0 4 年肉牛染色体上 已定位的微卫星标记有3 8 0 2 个纠。2 0 0 5 年增加到5 5 9 3 个位点t 6 1 ，2 0 0 6 年又增加了2 4 7 3 个新位点， 更重要的是增加了2 6 2 个扩增片段长度多态( a f l p ) 位点1 7 j ，2 0 0 7 年t a k a s u g a 等定位t 4 0 个与生 长和牛肉品质相关的多态位点哪。而且猪和牛核心群和商业群体中，已开始应用分子辅助标记进 行选择，大大提高了选择的效率和生产效率。为加快山羊遗传育种工作的进展，开展控制山羊生 产性状主效基因的分离及其多态性的研究，寻找有经济价值的分子标记已是势在必行。 目前广泛采用的一种用于克隆新基因的策略是候选基因分析法，包括比较候选法和功能候选 法两种。比较候选法克隆基因是指根据人类和小鼠基因组分析所揭示出的基因与性状的关系来选 择控制畜禽同类表型的基因作为候选基因。功能候选法是指根据已掌握的生物学及生理学的知识 来选择那些在畜禽生长发育过程中可能对研究性状有影响的基因作为候选基因，如编码参与代谢 调控的途径酶、激素等的基因。功能候选基因法具有统计功效强、应用广、费用低和操作简单等 优点，是候选基因分析法中最受研究者重视的一种方法。到目前为止，畜禽中己明确或基本明确 的主效基因，大多是通过功能候选基因法克隆出来的p 生长性状是山羊生产中非常重要的经济性状。但动物生长又是一个复杂的生物代谢过程，受 遗传、营养、环境等多因素的影响，这些因素对生长的影响作用都是通过直接或间接影响动物内 分泌系统来实现的。神经内分泌生长轴是调控生长的主要内分泌系统，是由动物体内从下丘脑 垂体一靶器官的一系列与动物生长发育密切相关的激素及其受体所组成的神经内分泌系 统。对于哺乳动物来说，主要下丘脑分泌的生长激素释放激素( o 】删o rg r f ) 、生长抑素( s so r s r j f ) 、垂体分泌的生长激素( g h ) 、靶器官如肝脏分泌胰岛素样生长因子( i g f s ) 和这些激素 的受体、结合蛋白等，它们共同组成一个精密的生长调控系统，共同调节动物的生长发育。鉴于 g h r h 、g h 、生长激素受体( g h r ) 、i g f 1 和胰岛素样生长因子蛋白( i g f b p s ) 在动物生长中 的重要作用，可以把它们的基因作为侯选基因用来寻找与畜禽生产性能相关的多态位点，以便进 行标记辅助选择 本研究以南江黄羊为试验动物，以生长轴主要基因( g h r h ，g h 、g 腿，i g f i 和i g f b p 3 ) 为候选基因进行基因的克隆，利用p c r - s s c p 技术和d n a 序列分析技术筛选这些基因的多态位点， 寻找s n p s ，并将这些多态位点与南江黄羊的生长性状关联分析，以期筛选出对南江黄羊生长性状 中国农业大学博+ 学位论文绪论 有显著影响的多态位点，为南江黄羊快长品系标记辅助选育提供可靠的依据，同时也为构建山羊 基因连锁图谱提供素材。 2 国内外研究现状 动物生长发育调控是一个高度复杂而精细的生理过程，受多个的生长调控系统的影响，其中 神经内分泌生长轴各因子( 激素、受体、结合蛋白等) 及其基因对动物的生长发育起着关键的作用 d 3 o 正常情况下，下丘脑接受体内外的信息，释放g h r h 和s r i f ，调节垂体g h 的分泌，g h 通过 与生长激素结合蛋i 刍( g h b p ) 结合而运输，与靶器官上g h r 结合，促使i g f s 的产生并进入血液循 环，i g f s 再通过与i g f b p 结合转运到全身组织细胞，促使组织细胞的生长与分化( 如图1 所示) 。 其中各因子的产生和分泌又受其相应的基因表达调控。整个过程的调控复杂，存在着基因的转录、 表达、产物的修饰以及各水平的反馈调节机制。 图卜1 生长轴作用机制 f i g u r e1 - 1m h n i s a mo f g r o w t ha x i sf u n c t i o n 随着分子生物技术发展，人们开始利用转基因技术、基因敲除技术、克隆技术等方法研究其 基因对生物功能的影响。到目前为止，鼠作为模式动物是人们对与生长轴基因及其功能相关研究 最为详尽的动物。e f s t r a t i a d i s 等汇总了前人研究结果，得出了在2 0 2 5 个控制生长的基因中大多 数是位于g h - 1 g f s 生长轴上的结论l l q 。o a y l i n n 等研究发现生长激素释放激素受体胞外区错义突 变破坏了其受体的功能，致使血液中o h 缺乏、i g f - i 浓度降低t ”i 。z h o u 等发现敲除了g h r 基 因的小鼠，其血液g h 浓度升高，但i g f - i 浓度降低【l q ；b e r g 等指出人g h r 基因的变异对l a r o n 型侏儒症负责“”，g h r 基因变异后，对g h 反应不敏感，且i g f i 浓度降低【l s 】；b u r n s i d e 等发现 性连锁矮小鸡由g h r 基因突变引起的1 1 9 - 2 “。i g f - i 启动子和编码区的突变引发了人的生长障碍盼 ”j 。其受体的变异影响了出生后生长脚l 。在人类侏儒症病因的探索研究中，现已多数归因于生长 2 中国农业大学博十学位论文 绪论 轴基因的突变田j 。从上述的例证可以看出：生长轴主要基因与人和动物生长密切相关，其基因的 变异会引起生长轴激素、受体和结合蛋白功能的变化，从而影响到人和动物生长发育。 到目前为止，人们已经完成人和鼠生长轴上主要基因的克隆测序，并对这些基因及其蛋白功 能进行了详尽的研究。牛、猪和鸡生长轴主要基因克隆测序也基本完成，这些基因的多态与重要 经济性状的关联分析也相继报道。下文综述生长轴的功能、主要基因结构、多态性及与生产性能 的关联结果等方面研究进展。 2 1g h r h 基因的研究进展 2 1 1g h r h 的生物学功能 g h r h 是下丘脑合成和分泌的小分子蛋白1 2 s ，2 6 1 ，其主要功能是诱导并刺激垂体促生长区的细 胞合成和释放g h i ”2 9 l ，a i - r a h e e m 等( 1 9 8 6 ) 报道了提纯的人g h r h 和鼠g h r h 促进牛的生长激 素的释放，从而增加了其生长速度p o l 。g h r _ h 的作用是通过与其受体结合实现的 2 6 1 ，其信号传导 途径见图1 2 ，g h r h 与受体结合，使细胞内c a m p 增加，活化c a m p 依赖的蛋白激酶，促使组蛋 白磷酸化，促进g h 的合成与释放3 ”，促进动物生长发育。且无种属特异性【3 2 - 3 4 1 。 2 1 2g h r h 的结构 图1 - 2g 刚信号传导途径” r i g e r e1 - 2s i g n a l i n gs y s t e mo f g h r h “ 人们首先发现的g h r h 是一种含4 4 个氨基酸残基的单链多肽类激素l j ，j ，尔后有发现存在一类 含4 0 个氨基酸的g h r h l 3 6 , 3 7 1 。k a t a k a m i 等研究发现g h r h 的前体含有1 0 8 个氨基酸，分为信号肽、 剩余肽和g h r h 前体，进一步分解为两种类型的g h r h ，( 1 - 4 4 ) - n h 2 、( 1 - 4 0 ) - o h 和c 末端未知功能 的肽 3 9 l 。转基因鼠模型模拟人g h r h 合成过程的研究为0 - 4 0 y o h 可能来源于0 - 4 4 ) - h q 2 提供了证 据。这两种形式在动物体内都具有生物学活性，但以( 1 - 4 4 ) - n h 2 活性高。猪的下丘脑分泌的g h r h 有3 种形式，分别由4 4 、4 0 、3 7 个氨基酸组成，体外研究证明3 种均具有生物活性，但以4 4 肽的活 性最高嗍目前，人 3 9 1 、牛i 柏l 、猪”、山羊1 4 2 l ，绵羊1 4 2 1 和鼠【4 3 1 g h r h 的一级结构也已清楚。如 3 中国农业大学博十学位论文绪论 下所示： 人：y a d a i f t n s y r k v l g q l s a r k l l q d i m s r q q g e s n q e r g a r a r l - n h 2 猪：y a d a i f t n s y r k v l g q l s a r k l l q d l m s r q q g e r n q e q g a r v r l - n h 2 牛：y a d a l f t n s y r k v l g q l s a r k l l q d i m n r q q g e r n q e q g a k v r l - n h 2 羊：y a d a i f t n s y r k il g q l s a r k l l q d i m n r q q g e r n q e q g q k v r l - n h 2 鼠：h a d a i f t s s y r r i l g q l y a r k l l h e i m n r q q g e r n q e q r s s f n o h 由上述氨基酸序列可知，人、猪、牛和羊的g h r h 一级结构非常相似。人与猪相差3 个氨基酸， 与牛相差5 个氨基酸，与羊相差6 个氨基酸。人、猪和牛前2 7 个氨基酸完全相同，即不同来源g h r f i 的n 端结构十分保守，因此可以推测g h r h 的功能部位在n 端。l i n g 等( 1 9 8 4 ) 体外试验使人g h r h 的c 端逐步缺失，用肽合成法合成一组g h r h 类似物的片段，再测定各片段的生物学活性，随着c 端的缩短，活性逐渐降低，c 端为酰氨基团比c 端为羟基的g h r h 活性要高，当c 端逐渐缺失到2 9 个氨基酸时，活性仍保留到一半以上；当氨基酸数量小于2 9 个时，活性基本消失；n 端氨基酸的 缺失对g h r h 的活性影响很大，如第1 个氨基酸缺失时，活性降低至原先的1 1 0 0 0 以下 3 9 】，这进一 步说g q g h r h 的功能区位于其n 端t 4 ”。g h r h 的功能与其二级结构有密切的关系。体外试验证 明，g h r h 能形成螺旋结构，但仍没有进一步详尽的研究。 2 1 3g h r h 基因结构与定位 m a y o 等汞q g u b l e r 等1 9 8 3 年报道了人g h i m ( 1 4 4 n h 2 的c d n a 序列”。完全编码子含有3 2 7 核苷酸，1 巧o 个核苷酸编码信号肽，6 l 3 2 4 核苷酸编码g h r h 的前体，9 4 - - 2 2 5 核苷酸编码 g h r h l 4 6 1 。人、奶牛和猪的g h r h 基因均由5 个外显子和4 个内含子组成( g e n b a n k n o ：a l 0 3 1 6 5 9 ， a f 2 4 2 8 5 5 ，a h 0 0 2 7 1 2 ) 。人g h r h 编码子序列与猪g h r h 相差1 3 个碱基，同源性为9 0 ，猪与牛 g h r h 的编码序列相差8 个碱基，同源性为9 1 。可见人与动物及动物之间g h r h 不仅氨基酸序列 的同源性高，在编码氨基酸的核苷酸序列的同源性也很高。目前在g e n b a n k 中，有零星的绵羊 g h r h 基因序列片段( g e n a a n k n o ：d q 6 6 6 6 9 5 ) ，然而没有检索到有关山羊g h r i - i 基因的信息，这 说明在山羊g h r h 基因上的研究较落后。 目前，已将人g h r h 基因定位与2 0 号染色体上i j ，j ，猪g h r h 基因定位于第1 7 号染色体上 l q ，绵羊g h r h 在第4 号染色体上i j j 。 2 1 ，4g h r i t 基因多态性与生产性能的关系 目前，关于g h r i - i 基因多态性及与生产性能相关的研究报道较少。n i e l s e n 等1 9 9 7 年发现4 个丹麦猪种g h r h 基因上存在d r a b r f l p 多态位点和b a m l l l r f l ，p 多态位点h 聊。同年b a s k i n 等 发现了猪g h r h 基因上存在a i m r f l p 多态位点 4 9 j 。f r a n c o 等在对2 0 6 头猪g h r h 多态与生长 和胴体性状关联分析研究中，发现g h r ha l u i - r f l p 多态与兰德瑞斯猪平均日增重( p - - o 0 0 0 1 ) 和 背膘厚= 0 0 0 0 4 ) 显著相关p o l 。m o o d y 等( 1 9 9 5 ) 在海福特牛和安格斯牛品种中分析了g h r h 基 因h a e l i i - r f l p 多态，其中a 等位基因频率分别为0 0 7 和o 7 0 l ，“。p a r m e n t i e r 等( 1 9 9 9 ) 在奶牛 中也观察胁p i i i r f l p 多态，虽然a a 基因型个体数量较少( 基因型频率为0 0 8 ) ，但该基因型个 4 中国农业大学博仁学位论文绪论 体的乳脂率显著高于b b 基因型个体i l “。c h e o n g 等以朝鲜h a n w o o 黑牛d n a 为模板，用直接测 序法检测了g h r h9 k b 全长( 包括1 5 k b 启动子区) ，发现了1 2 个单核苷酸多态位点( s n p s ) ， 选择其中6 个多态位点在4 2 8 头h a n w o o 黑牛中进行基因分型，其中有5 基因标记的基因频率超 过0 1 ，与冷胴体和眼肌面积进行关联分析结果表明，- 4 2 4 1m t 多态与h a n w o o 黑牛冷胴体重和 眼肌面积显著相关i ，“。c u d 等研究了7 9 头内洛尔牛、3 0 头夏洛来牛和瘤牛杂种后代、3 0 头内洛 尔牛和西门塔尔牛杂种后代和2 4 内洛尔牛和安格斯牛杂种后代的g h r h 基因h a e i i i 。r f l p 多态 与胴体重、背膘厚度、眼肌面积和料重比等生长性状和胴体性状无相关i s 3 1 。 到目前为止，还没有关于绵羊和山羊g h r h 基因多态性的报道。 2 2 g h 基因的研究进展 2 2 1g h 的生物学功能 t 线性生长 围1 _ 3 生长激素的生物学功能 f i g u r e1 - tf u n c t i o no f g r o w t hh o r m o n e g h 是神经内分泌生长轴中调控动物生长的核心。是由垂体前叶嗜酸性细胞合成和分泌的， 具有广泛生理功能的蛋白激素，几乎能影响所有的组织类型和细胞，包括骨、软骨、脂肪组织、 免疫系统、生殖系统、脑组织及造血系统等在动物体的生长发育、泌乳，繁殖和新陈代谢等方 5 中国农业大学博 ：学位论文绪论 面有重要的影响瞰1 。其发挥作用主要有两种途径：一是直接作用于靶细胞产生生理效应；二是通 过与生长激素受体( g h r ) 结合，刺激肝细胞、肌细胞产生i g f i ，i g f - i 通过旁分泌或自分泌方式作 用于肌肉、骨骼等，促进机体生长发育【5 ，】。具体g h 的功能及作用途径见图1 3 【5 ”8 1 。 2 2 2 g h 的结构 动物g h 是由1 9 0 - 1 9 1 个氨基酸组成的单链多肽，约2 2 k d ，其信号肽和成熟肽分别为1 6 2 7 个和1 8 6 1 9 1 个氨基酸，其二级结构( 如图1 4 ) 中包含7 个环( h ) ，1 4 个1 3 转角( p ) ，5 个t 转 角( y ) ，还有4 个c y s 连接而成的两个二硫键，一个连接5 3 与1 6 5 处胱氨酸残基，另一个连接1 8 2 与1 8 9 处胱氨酸残基，这两个二硫键使得分子形成两个环二级结构。山羊g h 的前体是1 扫2 1 7 个氨 基酸组成，其信号肽的长度为2 7 个氨基酸，成熟肽1 9 0 个氨基酸。 r _ j 、k ，、- ，、_ l 一两b 盎_ 上_ - 皂- 一t - rtp l s r l f q 枷l h o l f d t y e e f e e yi ， q k l r s f l o o s l c f s e sip t t f 1 f 1 i f 玎叠广五一1 了司f 五百 l 二q 、 j 2 卫_ l 二上u l j 吒妒、尹- s n r e q x s w l q m i s 乙l li o s w l e v o f l r s v f w 5 l w 口5 口v y d l l k d l e e a t 卫生工_ 丘_ 二茹翻、加- 崔、b - ， o t l 啪r i - e d o s p r l a o 州口 i t l 队k f 龇m s 聃d d l l 酬y a 乙l y c f r k 口m d k v e t f l r i y q l 了f 石i 晤i 五z 5 i 石矗i 五石i 五讨i 转i j ：i 日，f - c r s v e a o l i i 图1 - 4 人生长激素蛋白质二级结构图( 引自：h t t p ：w w w d y n a m c o m i c s o r g i m a g e s l h g u p r i g ) f i g u r e1 - 4s e c o n d a r ys t r u c t u r eo f g hp r o t e i n 通过x 射线衍射技术等研究发现，g h 立体结构4 4 个螺旋组成( 见图1 5 ) ，自n 端至c 端依次为 螺旋1 4 ，其中螺旋4 最长，其次为螺旋1 和螺旋3 ，螺旋2 最短。g h 分子结构上有2 个生长激素受 体的结合位点。位点l 由螺旋4 近c 端的一些氨基酸残基、螺旋l 与螺旋2 之间非螺旋连接部分( e p 大 约在其肽链的第5 4 5 8 位残基) 以及螺旋l 近n 端的少数几个残基共同组成。位点2 由n 端的一些残 基以及螺旋3 上的一些残基共同组成。如结合位点上或维持结合位点结构的氨基酸发生改变，将 会影响到g h r 的结合，从而影响g h 功能的发挥。 图1 - 5 人生长激素蛋白质立体结构图( 引自：h t t p ：w w w d y a a m e o m i c s o r g i m a g c s i h g u p r i g ) f i g u r e1 - 5h u m a ng hc o n f i g u r a t i o nf i g u r e 2 2 3g h 基因结构 6 中国农业大学博十学位论文绪论 2 2 3 1 g h 基因序列分析 目前，哺乳动物g h 基因研究的比较透彻，由5 个外显子和4 个内含子构成，内含子和外显子 交界处绝大部分符合g t - - a g 规则，转录起点上游8 4b p 以内有t a t a 盒，而且该启动子含有顺式 调控序列，以便对激素类信号作出反应。g h 基因的外显子，内含子、57 和3 端非转录区的位置和 长度都具有高度保守性。以b a r t a 等( 1 9 8 1 ) 研究发现老鼠g h 基因为例，说明g h 基因的结构，老 鼠g h 基因长度2 1 0 0b p ，由5 个外显子和4 个内含子构成( 见图1 - 6 ) 。其5 个外显子编码的氨基酸 序列：第1 外显子编码1 2 3 个氨基酸；第2 外显子编码2 3 3 1 氨基酸，第3 外显子编码3 2 7 0 氨基酸； 第4 外显子编码7 1 1 2 4 氨基酸；第5 # b 显子编码1 2 5 - - 1 9 0 或1 9 1 氨基酸1 5 9 1 e l龟自 e 图卜6 生长激素基因结构图图中e l e 5 代表g h 的5 个外显子；i a - i n 代表g h 的4 个内含子；数字代表编码的氨 基酸序列 f i g u r e1 - 6s t r u c t u r eo fr u tg hg e n e e j e 5 ht h ef i v ee x o n so f g hg e n e ；i a - i ei it h ef o u ri n t r u n so f g hg e n e ；t h e n u m b e r i s n o o f t h e a as e q u e n c e 人类和鼠g h 基因的测序成功为其它物种g h 基因的测序提供了参考，s e e b u r g 等( 1 9 8 3 ) 发表 了猪g h 基因c d n a 序列1 6 0 l ；l a m b 等( 1 9 8 8 ) 发表了鸡g h 基因c d n a 序列【6 l i ；b y r n e 等( 1 9 8 7 ) 和o r i a n ( 1 9 8 8 ) 先后测定的绵羊g h 基因序列全长分别为1 7 9 2 b p 旧 9 2 1 6 0 b p l 6 3 1 。w a r w i c k 等( 1 9 8 9 ) 获得了 绵羊的c d n a i “。y a m a n o 等和y a t o 等先后克隆了山羊g h 基因c d n a 序列“吲。k i o k a 等0 9 8 9 ) 以牛 g h 基因e d n a 作为探针，得到了t o k a r a 山羊g h 基因全序列，它由2 5 4 4 b p 组成，包含5 个外显子和4 个内含子，在启动子中含有顺式调控序列，在转录起始位点上游8 3 b p 有t a t a 盒。山羊g h 基因5 个外显子长度分别为1 3b p 、1 6 1b p 、1 1 7b p 、1 6 2b p a t 1 2 0 1b p ；4 个内含子长度分别为2 4 7b p 、2 2 7 b p 、2 2 9 b p 和2 7 6 b p ，外显子和内含子的交界处均符合g t - a g 规则 6 7 1 ，该研究为山羊g h 基因多态 的研究奠定了基础。 2 2 3 2g h 基因定位 在g h 基因定位方面的研究上，h e d i g e r 等( 1 9 9 0 ) 通过原位杂交手段将绵羊g h 基因定位 于1 1 号染色体l l q 2 5 - q t e r ，将牛g h 基因定位在1 9 号染色体1 9 q 2 钿t e 一嗍；s h a w 等( 1 9 9 1 ) 也 是用原位杂交手段将鸡g h 基因位于l 号常染色体的长臂末端，g 带l q 4 区域1 6 9 1 。y e r l e 等( 1 9 9 3 ) 用高分辨率g 带染色体原位杂交将猪g h 基因定位在1 2 p 1 2 - p l 。51 7 0 1 ；而山羊g h 基因则是通过 比较基因组学技术定位于1 9 号染色体的长臂k ( 1 9 q 2 2 ) 例g h 基因的定位为以后分子标记研究与 定位奠定了基础。 在山羊基因组中，山羊g h 基因是有3 个等位基因v a m a n o 等( 1 9 9 1 ) 发现山羊g h 基因有 2 个克隆：1 个克隆( c g g h ) 包含g g h l 基因；另1 个克隆( e g g h ) 包含g g h 2 和g g h 3 基因c g g h 克隆包含4 9 1 b p 的插入序列，正好位于g g h 3 基