（农药学专业论文）氯嘧磺隆在大豆田的残留动态及其降解菌的特性研究.pdf

置毡壅些盍生亟芏僮缝塞 氢疃瑾隆垄盘亘堕毯塑盘查丛基睦坚萱曲壁蛙盟窒 氯嘧磺隆在大豆田残留动态及其降解菌的特性研究 摘要 氯嘧磺隆是一种磺酰脲类除草剂，由美国杜邦公司开发，主要用于大豆田，可选 择性地防除阔叶杂草、莎草及某些禾本科杂草，但由于许多经营用户和农民对该除草 剂的特性缺乏了解，出现许多残留问题，本文对氯嘧磺隆在土壤及大豆植株、青豆、 籽粒中的残留分析方法、残留动态进行研究，为制定残留标准提供依据，并驯化富集、 筛选能高效降解氯嘧磺隆的菌株，初步鉴定其种类，研究其降解特性。 土壤样品经甲醇、水混合溶液提取后，用二氯甲烷萃取，萃取液减压浓缩至干， 用甲醇溶解后过硅胶柱净化，用甲醇定容，选择z o r b a x c 。柱以甲醇水和乙酸酸化的 混合液为流动相，进行高效液相色谱( 职l c ) 分析。大豆植株及青豆、籽粒样品经甲 醇、水混合溶液提取后，用石油醚去杂质，其它前处理及分析步骤同土壤样品。方法 的回收率为8 2 4 卜9 1 3 4 ，变异系数为o 3 4 1 1 9 。土壤样品最小检出浓度为 o 0 0 3 m g k g ，植株、青豆、大豆籽粒样品最小检出浓度均为o 0 0 5 m g k g 。 2 0 0 4 2 0 0 5 年在吉林省长春市和黑龙江省海伦市海北镇进行两年田间试验，对 5 0 氯嘧磺隆可湿性粉剂在以8 9 l l m 2 处理的土壤和大豆样品作残留动态分析。降解 过程符合一级反应动力学模式c = c o e 姐。在土壤中两年两地的动态方程分别是： c = 0 0 4 3 9 e o0 6 撒，半衰期1 l0 7 d ，r = 08 0 5 1 ( 2 0 0 4 年吉林) ；c = o 0 5 3 2 e o 肺锄，半衰期1 0 4 4 d ， r = o 8 4 1 2 ( 2 0 0 4 年黑龙江) ；c = o 0 4 5 4 e o0 6 姗，半衰期1 05 5 d ，r = o7 8 7 7 ( 2 0 0 5 年吉林) ； c = o 0 5 3 2 0 6 6 2 ，半衰期1 0 4 7 d ，r = o8 4 7 4 ( 2 0 0 5 年黑龙江) 。氯嘧磺隆在吉林大豆植 株中的消解曲线方程为c = 1 1 1 2 4 e “o ”“，半衰期为87 7 h ，r = 0 9 9 3 9 ( 2 0 0 4 年) ；c = o9 3 3 3 一0 7 娩，半衰期为8 8 6 h ，r = 0 9 3 0 2 ( 2 0 0 5 年) 。结果表明：氯嘧磺隆在大豆体 内的降解速度明显快于土壤。 最终残留测定结果表明：对5 0 9 0 氯嘧磺隆可湿性粉剂在以4 和8 9 h m 2 分别在大豆 生长期施药一次，青豆及收获期籽粒中的最终残留量均低于其最小检出浓度 0 0 0 5 m g 螬，土壤中的最终残留量低于0 0 0 3 m g k g 。 氯嘧磺隆降解菌的分离鉴定：试验从沈阳化工研究院农药厂废水排放口的污泥中 通过瓶培法富集培养分离出一株氯嘧磺隆的高效降解菌株，经初步鉴定属于克雷伯氏 菌属( 脚j 夙f p 砌印j 。降解菌的特性研究结果表明：菌株降解氯嘧磺隆的最适温度为 3 0 ，适宜p h 为6 7 ，适宜接种量为1 5 m l ( 0 d 。为o 2 ) ，氯嘧磺隆适宜的起始浓度 为2 0 m g l ，3 0 、2 4 h 培养，降解率可达9 l _ 5 7 。 关键词：氯嘧磺隆，h p l c ，残留，大豆，降解菌 壹登叠型型兰墅重掌焦毪童 熟堕熊隆生态亘堕毯置壹查墨墓隆鲤堇盟壁丝丛童 t h er e s i d u a ld y n 锄i c si ns o y b e a n ，s o i la n d i s o l a t i o n ，c h a r a c t e r so f c h l o r 沛u r o n e m y ld e g r a d i n gs t m i n a b s t r a c t c h l o “m u r o n e t h y l l sal ( i r l do fs u l f o n y l u r e ah e r b i c i d ec o n t m l i i n ga n n u a lg r a s sw e e d l ns o y b e a nc r o p s ，w h i c hi se x p l o i t e db yt h ed u p o n tc o r p o r a t i o f lt h ed e t e m “n a t i o na i i d d e g r a d a t i o no fc h l o r i m u r o n e t i l y li ns o i ia n ds o y b e a nw e r es t u d i e d f i h e r e da n di d e m i 行e d c e r t a i nb a c t e r i aw h i c hc a nd e g r a d a t ec h l o r i m u r o n e t h y le 伍c i e m l y f a c t o r sc o n c e h l i n 2 d e g r a d a t i o ne 掰c j e n c y 、a sa l s om i d i e d t h es o i ls a n l p l e s 、e r e 嘲r a c t e db ye t h y lw a t e rs o l u t i o n a n e rp a n “i o nt h eo r g a l l i c p h a s ec o n t a i n i n gc h i o r i m u m n e t h y lw a sc i e a n e du pw i t hd i c h l o r o m e t h a n ea n ds i l i c a t h e n h p l ca n a l y s i sw a sp e r f 0 珊e dw i t hz o r b a xc 1 8 ，e l u t e dw i t l im e t h a n o l 9 1 a c i sa c e t i ca c i d m i x t u r e s t h es o y b e a na n ds e e d s a m p l e sw e r ee x 仃a c t e dw t he t h y lw a t e rs o l u t i o n ， r e m o v e dt h ei m p u r i t yb yp e t m l e u me t h e rt h e nc l e a n e du pw h hs i i i x 置盐盔些盔芏! 基堂焦迨窒 筮堕堡睦查盘亘里熊塑壁查亟基隆鲤萤鲤壁一哇婴窒 1 1 研究目的与意义 第一章前言 随着人们生活水平和质量的提高，有机农业的积极推行，人们对保护生态、重视 环境保护的认识日益深刻，对食品安全和生存、生长环境的质量越来越加以重视。农 药作为一类使用不当会对人类和环境有着严重污染的化合物，已倍加引起全球的广泛 关注。2 l 世纪，将不再强调杀死( 一c i d e ) 是农药的特征，农药概念的内涵及外延已经 发生革命性的变化，“农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、 草和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成或者来源于生物、其 他天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂。”农药的新概念将是植物调 节剂( b i o r e g u l a t i o n s ) ，农药作为环境中的一类有毒物质，需严格管理，在应用于某 种作物前，需进行农药登记。通过残留研究，可为农药登记及合理使用提供依据，并 深入地了解其环境行为。 氯嘧磺隆属磺酰脲类由美国杜邦公司开发的广谱、超高效的大豆田除草剂，可在 芽前、芽后选择性地防除阔叶杂草、莎草及某些禾本科杂草，对大豆安全，九十年代 中期在我国开始出现，并在北方大面积推广使用，效果良好。但由于许多经营用户和 农民对该除草剂的特性缺乏了解，出现许多残留问题，施用氯嘧磺隆的大豆田在第二 年种植瓜类、油菜、甜菜、马铃薯、高梁时都会产生不同程度的药害，给农民带来巨 大的经济损失，由于其高效性在土壤中残留几u g k g 就会对后茬作物产生影响，“ 因此必须探索一种简便、有效的检测方法，分析其残留量，为农药登记、合理使用及 环境评价提供理论依据。 磺酰脲类除草剂可被微生物利用，微生物不仅能降解其母体化合物，还能分解 其水解产物促进水解反应“1 。氯嘧磺隆在土壤中主要是化学水解和微生物降解，通过 富集培养、分离并鉴定氯嘧磺隆的高效降解菌，为该除草剂的环境污染生物治理提供 一条有效途径。 1 2 磺酰脲类除类除草剂的开发与应用 磺酰脲类除草剂是目前世界上最大的一类除草剂。自杜邦公司的g l e v i t t 首先 报导此类化合物具有除草活性，并于1 9 8 2 年首次开发出麦田除草剂氯磺隆 壹盐亟些塞璺醚土皇壁迨塞 煎堕道隧痊盘亘里毯墅融盎丛甚隆攫重曲齄蝰盟塞 2 一 ( 4 一氯一8 一甲氧基一2 一蹬睫基) 氨纂泽酸氨基骥羧基】苯早黢己酪。 c a s n o ：9 0 9 8 2 3 2 4 ，分子式：c ，；h 。s e l 札o 。s ，相对分子质量：4 1 4 8 ，化学结构式为： i | o 缝是为蠢色或灰自识嚣体，熔点：】8 5 一1 8 7 ，蒸汽压：4 。g xl 挚a 2 5 ) ，溶 解性：水l l m g l ( p h5 ) 、1 2 9 l ( p h7 ) ，k o w ：3 2 0 ( p h5 ) ，亚氨纂为酸性，p k a4 2 ： 稳定性：水中，p h5 、2 5 时d t 。( 半寝期) 为1 7 2 5 d 。 制备方法 臁盐与藤二酸二甲臻避孬环绩台反应，生成2 一氨基一4 ，6 一二羟基噻啶，然 后与三氯戴磷、甲醇爱藏，生成2 一氨蘩一4 一甲氧墓喝一氯嘧碇，最霜与2 一乙氧鏊羧基苯 磺酰异氰酸酯反应即制得氯嘧磺隆“删，反应式如下： n 珏 | | h 2 n 愁n h 2h 2 c o a o 馘 n 刚飞 b 挂 州，争酬i 熹州魄 篇5 + n 科弋_ 一颐：茹萝凰 图1 一l 氯嚷磺隆的制备过程 f 毽1 - lp r 州u 旺尊口c e s so f c h l 铡妇鞴f o 珏 x 直盐壅业盍生亟芏焦迨窒 氢堕垡隆垄盘星望煎旦盘查壁基堡竖蓝煎挂一蛙班塞 1 6 氯嘧磺隆的毒理学特性 161 毒性 氯嘧磺隆属低毒除草剂，原药大鼠急性口服l d 。 4 1 0 2 毫克千克( 雄) ，4 2 3 6 毫克千克( 雌) ，大鼠急性经皮l d 。 5 0 0 0 毫克千克，大鼠急性吸入l c 5 0 ( 4 小时) 5 毫克升，慢性两年饲喂大鼠无作用剂量2 5 0 毫克千克，狗2 5 0 毫克千克，兔急 性经皮l d s o 2 0 0 0 毫克千克，对兔眼睛和皮肤无刺激作用o “。 由宇润等”1 对w i s t a r 大鼠九十天亚慢性毒性试验研究中发现5 0 0 0 m k g 氯嘧磺 隆原药可造成大鼠体重增长缓慢，最终导致体重明显下降，各剂量受试动物的器官绝 对重量下降，相对重量增加，与对照组比较有显著性差异。虽然各剂量组受试动物均未 见受试药物引起的中毒性组织改变，但是通过临床观察、血液常规及血液生化检测结 果，也可以认为连续接触较长时间较大剂量的氯嘧磺隆原药可导致动物营养不良性贫 血和免疫力下降等慢性中毒反应，根据化学品摄入量计算结果，可以认为氯嘧磺隆原 药对雄性大鼠最大无作用剂量为4 2 3 6 5 3 7 m g k g ( 体重) d a y ，对雌性大鼠最大无 作用剂量为5 3 1 5 7 4 2 m g 岵( 体重) d a y 。该受试物对大鼠毒性作用的主要靶器官 没有明显的确认指征，是否对动物的消化系统、循环系统、造血系统、泌尿系统、神 经系统等其它系统及器官产生毒作用有待于在慢性试验中进行进一步研究探讨。 1 6 ，2 生态效应 氯嘧磺隆对鸟类低毒，野鸭急性经口l d ；。 2 5 1 0 毫克千克、野鸡和山齿鹁饲喂 l 岛 5 6 2 0 毫克升，对鱼低毒，蓝鳃鱼毒l c 5 0 ( 9 6 小时) 1 0 0 毫克千克，虹鳟鱼 l ( 9 6 小时) 1 0 0 0 毫克千克。蜜蜂l d 。( 4 8 小时) 1 2 5 微克只，蚯蚓l d 。 4 0 5 0 0 毫克千克。在试验条件下，对动物未发现致畸、致突变、致癌作用。”。 1 ，63 对植物的敏感性 m a r m i a n 等“”关于氯嘧磺隆对大豆结实率及相 x 置楚查些盔堂臻堂焦建童 筮堕熊遂查盍垦里毯蟹盘查壁甚睦坚煎塑楚一些堑童 组织中的过氧化物酶含量高于叶片，可溶性蛋白的含量和过氧化歧化酶活性明显降 低。 1 64 对土壤酶活| 生的影响 土壤酶是一种生物催化剂，土壤中大多生化过程都是在这些酶的参与下完成的， 土壤酶活性可以反映土壤肥力，对土壤质量具有一定的指示作用，王鑫宏、许艳秋等 1 通过实验室内培养研究了氯嘧磺隆对黑土土壤脲酶、转化酶和碱性磷酸酶活性的短 期效应，结果表明：氯嘧磺隆对脲酶的影响相对较小，最大抑制率和激活率分别为8 和1 3 ；氯嘧磺隆对碱性磷酸酶似抑制作用为主，最大抑制率超过2 6 ；对转化酶激 活与抑制效应都比较明显，激活率和抑制率分别达到2 0 矫3 0 ，说明转化酶对氯嘧 磺隆较敏感。此外，三种酶抑制率或激活率均呈现一定的波动性，主要是因为农药氯 嘧磺隆本身是一种有机物，可以在酶的酶促作用下降解，所以经过一段适应期后酶通 常会被激活，但由于底物的消耗以及新的抑制产物的生成又会使酶再次受到抑制。 1 6 5 环境归宿 氯嘧磺隆在植物体、土壤和水体中迅速 喜辛舴治鲆4表2 3 不鎏鬻嚣篓毫霉囊錾 i g 萋耋。l 攀；女i m ；s 目毫! v l 定，在p h 值为4 0 的缓冲溶液中降解较快， 半衰期为14天，主要降解产物为卜甲氧基-6一氯一2一氨基嘧啶，乙基一2一氨基磺酰基 苯，氮一( 4 一甲氧基一6 一氯嘧啶一2 一基) 甲基脲和糖精，次级降解产物c h l o r i 壹盐室些玉兰窭媸苎笪童i 垒二王 氢疃熊隆查盘亘鱼盛蟹塑查鏖基竖竖萱盟挂丝煎壶 呤 8 o 9 f o a 变 5 l l 6 图1 - 2 氯嚏磺隆在水溶液中的降解产物 f i g1 - 2 耽撼r a d e dp r o d u c t so fc h l o r i 硼r 锄e t h y li na q u e o u s 7 4 o 吗 弋 n n n o n晦 一 ：f眵。l顶，i 呱 呱 a 弋 下 lii 1 4 6 哎 9 琳4 洲 | o 图卜3 氯疃磺隆在土壤表面的光解产物 f i g 1 3p o s s i b l ep h o t o p r o d u c t so fc h l o r i m u r o ne t h y li ns o i l ( 3 ) 植物体内的降解 o 西 吗 铰 m 一 詈荸： 顶 o i i i c d ，卜i笠。 麦盐盔些盍皇硒掌焦迨童 氢疃熊隆垄盘亘鬯壅笪堑查丛基堡鲤萤救壁丝盟塞 氯嘧磺隆在离体大豆植株体内代谢迅速，通过“c 标记测定，半衰期为l 一3 小 时，二e 要代谢途径为氯嘧磺隆和体内的谷胱苷肽聚合，氯嘧啶取代谷胱苷肽的半胱胺 酸基团，次级代谢通过水解生成c h l o r i m u r o n ，这些代谢产物对大豆植株体内的乙酰 乳酸合成酶( 氯嘧磺隆的作用靶标) 无活性决定了大豆植株体对氯嘧磺隆的耐药性。 苍耳和红根藜对其敏感，且代谢较慢，半衰期大于3 0 天o ”“。 0 i | 矿、7 c ( ) c 2 h 5 l0 弋y 7 s n n i 删 l i o o f j ，g l u 1 7 氯嘧磺隆的残留分析研究进展 一a l a 国内外报道氯嘧磺隆及其它磺酰脲类除草剂在土壤、水及植物体内的分析方法 有：气相色谱法、液相色谱法( 包括液谱质谱，核磁共振联用) 、薄层层析法、极谱 法、c “示踪法、生物测定法和毛细管电泳法。 气相色谱分析方法： 氯嘧磺隆由于热不稳定性，不能直接进行气相色谱分析，必须转变成热稳定的 化合物。国内张淑英。“”3 利用测定其水解产物转换成氯嘧磺隆的量，采用一般实验 室具备的氮磷检测器( n p d ) 测定了土壤中氯嘧磺隆残留量，获得比较理想的效果。 k l a f f e n b a c h ，p 0 2 1 采用重氮甲烷衍生法测定土壤中氯嘧磺隆的残留。 液相色谱分析方法： 氯嘧磺隆的液相色谱分析方法中正相、反相均有报道，检测器有紫外检测器 ( u v d ) 、光导体检测器( p c d ) 等。2 “1 ，j 砌e sl p r i n c e 应用正相液相色谱光导检测 器测得大豆中氯嘧磺隆的最低检测限为o 0 l m g k g ，蒋木庚和c h a r l e s r p o w l e y 应用 置挞垂些盔芏殖堂焦熊童 氢喳熊隆垄盘星里燕魁塑查丛基睦鲤重塑壁：睦丛塞 液相色谱，紫外检测器测定包括氯嘧磺隆在内的多种磺酰脲类除草剂，具有分析速度 快、检测灵敏度高的特点。 其它分析方法： h u g hm b r o w n ，k r i s h n an r e d d y 和u b n a n d i h a l l i 均采用c “示踪法研究 氯嘧磺隆在土壤和大豆植株体内的代谢途径及吸收、释放情况。黄春艳以玉米为支持 植物测定氯嘧磺隆在土壤中的降解动态。k r y n i t s k y ，a j 应用毛细管电泳及液谱质 谱联用测定水中包括氯嘧磺隆在内的磺酰脲类除草剂1 “。 由于生物测定具有方便、实用、高灵敏度，但缺少选择性，且重复性不好，气相 色谱法前处理需要衍生化，液质联用方法检测效果好，但一般实验室不具备，因此液 相色谱法是一种比较理想的方法，其灵敏度高、检测限低能达到农药残留分析要求。 本试验在借鉴国内外文献报道的基础上，采用常规的液一液分配萃取，柱层析净化， 液相色谱一紫外检测器测定，建立氯嘧磺隆在大豆、土壤中残留分析的方法。 1 8 本论文主要研究内容 ( 1 ) 氯嘧磺隆在大豆、土壤中的残留分析方法研究 通过室内试验筛选，最终确定土壤、大豆植株、青豆及籽粒中氯嘧磺隆的提取、 净化、分析方法，测定氯嘧磺隆分析方法的回收率和重现性。 ( 2 ) 氯嘧磺隆在大豆、土壤中的残留动态研究 分别于2 0 0 4 、2 0 0 5 年在吉林省长春市和黑龙江省海伦市海北镇进行两年田间小 区残留试验，在大豆生长期施药，于施药后不同时间采样，测定氯嘧磺隆在大豆、土 壤中的残留动态，求出消解曲线方程和半衰期，并在收获期测定其最终残留量。 ( 3 ) 氯嘧磺隆降解菌的分离及特性研究 通过富集培养，筛选、分离出对氯嘧磺隆具有降解作用的细菌，并进行初步鉴定， 根据菌株生长和氯嘧磺隆降解情况，研究该菌株对氯嘧磺隆的降解的影响因素，包括 温度、p h 、摇床转速。 置盐巫些盍芏亟生焦逢童 氢堕熊隆垄盘亘里毯望叠查盈基睦监菌鲤挂些堑塞 第二章氯嘧磺隆在大豆、土壤中的分析方法 2 1 试验材料 2 1 1 仪器设备 a g i l e n t 儿o o 型高效液相色谱仪、紫外检测器、岛津u v 一2 4 0 紫外扫描仪、恒温 水浴振荡机：s h z 一8 8 型、组织捣碎机d s 一1 型、谷物粉碎机：f w 一1 0 0 型、旋涡混合 器：w h - 8 5 l 型、超声波清洗器：k q 一2 5 0 d e 型、旋转真空蒸发器：z f q 一3 型、层析 柱：1 5 c m 1 2 c m 、分液漏斗等各种玻璃器皿。 2 1 2 试剂 甲醇( 紫外光学纯、分析纯) 、丙酮、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、冰乙酸、 氯化钙、无水硫酸钠、硅胶均为分析纯，助滤剂：c e l i t e5 4 5 。 氯嘧磺隆标品：纯度9 8 由沈阳化工研究院提供 213 样品制备 土壤样品：土壤( 草甸黑土) ，风干，过2 0 目筛，四分法取3 0 克备用。 大豆植株样品：将大豆鲜植株去根后剪切成约l c m 小段，四分法取2 0 克备用。 青豆样品：四分法取2 0 克备用。 大豆籽粒样品：将大豆籽粒样品用谷物粉碎机粉碎后，过2 0 目筛，四分法取2 0 克备用。 2 2 试验方法 2 21 样品前处理方法 221 1 土壤样品 取土样3 0 9 ，置于具塞三角瓶中，分别加入甲醇水( 8 ：2 ) 5 0 m l 、3 0m l 振荡提 取两次，提取时间分别为3 0 m i n 、2 0 m i n ，合并提取液，在铺有助滤剂的布氏漏斗中 置挂垂些盔堂艇土掌焦丝塞氯竖礁鹱奎盍曼里基蟹皱露区基竖篮重塑撼雌监童 减压抽滤，爆甲醇水( 8 ：2 ) 4 0 m l 冲洗锥形叛及滤渣，滤渡移入分液漏斗中，加入 o 。l m o l l 氯化钙隶溶滚2 e m l ，矮二鬣甲烷萃取3 次( ，5 0 ，o 盹) ，振荡焉静止分 层，萃取液过无水硫酸钠脱水，置于旋转蒸发器3 5 下减压浓缩避干，吹干。用l m l 甲醇溶解残渣过层析柱净化。 在瑟李曩壤瘫袋次耱入o 。5 0 9 霸滤潮，3 。o o g 疆羧及多喜年无承浚酸镳。甏磊、滚醚潼 润硅胶，加入样品后，用乙酸乙酯7 0 m l 淋洗，前2 0 m l 弃去，收集后5 0 m l 。在3 5 下减压浓缩近干，吹千，用2 m l 甲醇定容，供液谱测定。 2 21 2 大豆植株样品 取大豆植株2 0 9 ，加入甲醇水( 8 ：2 ) 4 0 m l 及l m 0 1 l 氯化钙水溶液4 0 m l ，在 组织捣碎机中匀浆l m i n ，在铺有助滤剂的漏斗中减压抽滤，用甲醇水( 8 ：2 ) 8 0 m l 淋洗滤渣，合并滤液，在分液漏斗中加石油醚5 0 m l 振荡后静止分层，去除油脂及杂质， 弃掉石油醚层( 有乳化现象及沉淀物时需离心，余下溶液中加入蒸馏水5 0 m l 及l m o l l 氯化钙水溶液3 0 m l ，用二氯甲烷萃取三次( 6 0 、5 0 、5 0 m l ) ，萃取液过无水硫酸钠 脱水，置于旋转蒸发器3 5 下减压浓缩近干，吹干，加入l l 甲醇溶解残渣，过层 析柱净化。以下操作同土壤样品。 2 2 1 3 青豆样品 取青豆样品2 0 9 ，景于捣碎机中，加入甲醇水( 8 ：2 ) 4 0 i l 及l m o l l 氯化钙水 溶液4 0 m l ，匀浆1 分钟，以下操作同植株样品。 2 2 14 大豆籽粒样品 取大豆籽粒磨碎、过筛后的样品2 0 9 ，置于具塞三角瓶中，加入蒸馏水5 0 m l ，使 大豆吸涨1 6 h ，分别加入甲醇水( 8 ：2 ) 5 0 m l 、3 0 i 【i l 振荡提取两次，提取时间分别 为3 0 m i n 、2 0 m i n ，合并提取液，在铺有助滤剂的布氏漏斗中减压抽滤，以下操作同 植株样品。 2 22h p l c 检测条件 重整壅些盍芏亟芏焦迨窒 亟壁亟隆查盘星里盛蜜邈查丛基竖鲤蓖鲍壁一睦翌塞 表2 1 液相色谱条件 t a m e2 1 l cc o n d i d o n 氯嘧磺隆 ( 土壤) 氯嘧磺隆 ( 太豆、植株、籽粒) 仪器名称 色谱柱 流动相 流速 检测波长 柱温 a 酊l e 札1 1 0 0 咿l c c 。e ( 1 0 c 46 咖) 甲醇：水：乙酸 7 0 ：3 0 ：03 0 lo m l m i n 2 5 4 n 3 0 a g i l e n tl 1 0 0 肝l c c 1 8 ( 1 0 c m 4 6 m ) 甲醇：水；乙酸 7 0 ：3 0 ：0 3 0 1 o m l i n 2 3 8 n m 3 0 垄壁量! ! 唑! ! 吐 2 3 结果与分析 2 3 1 标准曲线 准确称取氯嘧磺隆标准品o o l o o g ，用流动相定容至l o o m l ，配制成l o o u g m l 的标准母液，再用此标准母液稀释成o 0 5 、0 1 0 、0 2 0 、o 5 0 、1 o o 、2 o o u g 1 i l l 系列标准溶液，按照上述色谱条件测定，得到色谱图，以进样量为横坐标，峰面积为 纵坐标，绘制标准曲线，其直线回归方程为y = 1 2 2 9 x o 儿1 3 ，相关系数为r = 0 9 9 9 9 ， 结果见表2 2 、图2 一l 。 表22 氯嘧磺隆进样量与峰面积 t a b k 2 1 蜥e c tq a n 枷o i la n d p e a k a r c ao f e 岬 l3 壹楚盛些盍堂瑟雯焦撞塞 一氢堕熊隧查盍亘璺遣蜜盘查骢基堡鲤菌垃挂一眭堡楚 3 0 0 兰2 0 0 蔷l o o 髫 0 2 。3 。2 最小梭出量测定 v = 1 2 。2 窖x 一0 + t l l 3 r 2 = 09 9 9 9 05 1 01 5 嗣2 1 氯畸横隆标准曲线 舞g 吣- l 辩蕊c 矗d 两m 趱麟 2 02 5 避撵爨( 珏g ) 在所设定的仪器条件下，氯嗾犊隆最小进撑爨峰裹为噪声2 嵇时，最小捡出璧 为o 5 1 0 4 9 。 2 3 3 检测檄限溅寇 土壤样品取3 0 9 ，植株、青豆、大豆籽糨样品各取2 0 9 ，均定容至2 m l ，遥样l o 瞳。 土壤样品最小检出浓度为o 0 0 3 m g k g ，植株、青露、大豆籽粒样晶最小检出浓度均 为o 0 0 5 m g k g 。 2 3 4 添翮回收率溺定 取空白壤3 0 9 ，植株、青豆、稃粒备2 0 9 ，分溺添翻o 。0 5 、0 ，l o 、1 o k 懿 三个水平，重复3 次，按照上述前处理方法和仪器条件测定方法回收率，结果见袭 2 3 。 l4 直主主遮些茎当塑t 坚型塑垒垂一 氢疃熊隆查盘亘蟹蕉塑叠查巫基竖竖萱鲍挂蛙壁塞 第三章氯嘧磺隆在大豆、土壤中的残留动态 3 1 田问试验 3 11 试验材料 5 0 氯嘧磺隆可湿性粉剂( 由某农药厂提供) 大豆( 品种为吉林2 0 ) 3 12 试验方法 31 2 1 田闻试验设计 2 0 0 4 2 0 0 5 年在吉林省长春市和黑龙江省海伦市海北镇进行两年田间小区残留 试验，具体条件见表3 一l 。 表3 1 田间小区试验条件 t a b l e3 一l1 1 l e 丘e l d 。珥吼m e n ic 伽d 缸o n 试验时间 壹挂壅些盍掌殛生笪迨窒亟堕堡隆垄盔亘里塞望盘查丛基竖盟萱曲壁丝塑壅 3122 气候条件，土壤类型： 吉林省长春市试验站位于北纬4 3 。l o 、东经1 2 5 。1 8 ，气候介于东部山地湿润与西 部平原半干旱之间的过渡带，属温带大陆性半温润季风气候类型。2 0 0 4 年平均气温 6 2 ，最高3 9 0 ，最低零下3 8 1 ，平均年降水量为5 5 0 4 m m ；2 0 0 5 年平均气温 5 o ，最高3 4 8 ，最低零下3 8 1 ，平均年降水量为7 2 8 6 帅。 黑龙江省海伦市位于北纬4 7 。2 6 2 、东经1 2 6 0 3 8 2 ，海拔高度2 4 0 米。气候条件属 北温带大陆性季风气候区，冬季寒冷干燥，夏季高温多雨，雨热同季。2 0 0 4 年平均 气温3 5 ，最高气温为3 3 3 ，最低气温为零下3 3 o ，平均年降水量为5 3 0 4 m ； 2 0 0 5 年平均气温3 o ，最高气温为3 6 5 ，最低气温为零下3 4 1 ，平均年降水 量为5 1 2 m m 。 吉林省长春市试验点供试土壤类型为草甸黑土，有机质含量为2 8 ，p h 值为 6 8 ，黑龙江省海伦市供试土壤类型为草甸黑土，有机质含量为4 1 ，p h 值为6 5 ， 两年两地前茬作物均为玉米。 31 23 消勰动态试验： 施药一次，剂量为8 9 h m 2 ，土样于施药后o 、l 、3 、5 、7 、1 4 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、 6 0 天，分别每小区按对角线取5 点，取土深度为o 1 5 c m ，大豆鲜植株于施药后o 、l 、 3 、5 、1 2 小时，1 、3 、5 、7 、1 4 天分别采样，每点l 砰，最终采集土壤1 o 垤、大豆 植株o 2 妇。在空白试验区内同期采集空白样品，景于一2 0 冰箱贮存待测。 31 24 最终残留试验： 设高、低剂量和空白三个处理，高、低剂量分别为8 、4 9 h m 2 ，试验小区面积为 2 0 平方米，重复4 次，喷雾施药1 次，于大豆收获期采收大豆籽粒和土壤各1 o k g ， 同期采集空白样品，置于一2 0 冰箱贮存待测。 3 2 检测方法 3 2 1 仪器设备 a g i l e n t l l 0 0 型高效液相色谱仪、紫外检测器 组织捣碎机：d s 一1 型 恒温水浴振荡机：s h z - 8 8 型 谷物粉碎机：f w 1 0 0 型 旋涡混合器：w h 一8 5 1 型 超声波清洗器：k q 2 5 0 d e 型 直盐盎些盘芏亟堂焦迨窒 煎堕堕隆查盘星里悲蜜盘查鏖基竖篮堇曲整壁塑窑 旋转真空蒸发器：z f q 一3 型 层析柱：1 5 c m 1 2 c m 分液漏斗等各种玻璃器皿 322 试验试剂 甲醇( 紫外光学纯、分析纯) 、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、冰乙酸、氯化钙、 无水硫酸钠、硅胶均为分析纯，助滤剂：c e l i t e5 4 5 氯嘧磺隆标品：纯度9 8 由沈阳化工研究院提供 323 样品制备 土壤、大豆籽粒样品：取土壤及大豆籽粒样品各l o o 克，去除杂质，研磨后过 2 0 目筛，备用。 大豆植株样品：将大豆鲜植株去根后剪切成约1 c m 小段，四分法取2 0 克备用。 青豆样品：四分法取2 0 克备用。 32 4 分析测定：( 方法与步骤同第二章) 3 2 5 残留量计算公式 即：噬 一阱救形 q 一从标准样曲线上查得的相应农药量( n g ) v 终样品溶液最终定容体积( m l ) v 样进样体积( u l ) 卜称样量( g ) 3 3 结果与分析 3 3 1 氯嘧磺隆在大豆田土壤中的消解动态 5 0 氯嘧磺隆可湿性粉剂8 9 h m 2 ，在大豆生长期喷施一次，于施药后不同时间采 样进行测定，结果见表3 2 、图3 1 6 。氯嘧磺隆在土壤中的消解曲线方程为c = 壹鲢垂些盎鲎趟生堂焦迨塞 煎疃磺隧垄盘亘堕毯骘数盎盈甚睦竖茸监般蛙丑塞 o ，0 4 3 9 e o0 6 2 鼬，半襄期l1 0 7 d ，f = o8 0 5 t ( 2 0 0 4 年吉林) ； c = o 0 5 3 2 e i o “6 “，半衰翘 1 04 4 d ，r 固8 毒1 2 ( 2 0 0 4 年黑龙江) ；e = o0 4 5 4 e 。6 ”，半衰絮l o5 5 d ，f = o 7 8 7 70 0 0 4 年吉林) ；c = o0 5 3 2 e “0 6 6 甜，半衰期1 0 4 7 d ，r = 0 8 4 7 4 ( 2 0 0 5 年黑浅江) 。 3 ，3 。2 氯羧绩隆在大爱鳞疆攘孛麓瀵瓣动态 在大隔生长期喷施一次，于施药后不同时间聚样，对吉林大豆鲜植株样品进行 测定，结祭见表3 3 、瓣3 一1 7 。氯嚏磺隆在大豆鳝植株中的满舞趋线方摆必c = 1 1l 篮矿脚斑，半衰颓t l 萨8 7 7 h ，r 司。9 9 3 9 ( 2 0 0 4 年) ；c = o 9 3 3 3 ，。7 ”，半衰麓 t l ，2 = 88 6 h ，r = 0 9 3 0 2 ( 2 0 0 5 年) 。 3 。3 。3 巍羧骥蓬在毒戡审韵残鏊瑟羧获鞭文豆孵糠、主壤孛熬豢终残鏊溅定 用5 0 氯嘧磺隆可湿性粉剂4 和8 h m 2 两个浓度分别在大豆擞长期用药次，青豆 及收获期籽粒中匏最终羧整量均低予冀最，l 、检出量0 5 越g k g ，土壤申救最终残整量 低于o 0 0 3 撤g k g ( 觅表3 4 ) ，美蓬、日本虢定萁在大溉中的最高残胬限量为o 。0 5 m g 妇， 美国规定其在花生中的墩高残留限量为0 0 2 m g k g ，建议我国制寇氯嘧磺隆在大豆中 的m r l 值为o 。0 5 m g k g 。 2l 壹盐盔些盍堂醚土堂焦迨毫 氢喧磺隆建盔星旦基鱼勉蠢照甚隆照苴鲍挝一哇塑窒 表3 2 氯嘧磺隆在土壤中的消解动态 t a b l e 3 - 2n i er e d l 】a 1d y n a i l l i cs t a c eo f c h l o n m u r o ne l l l v l1 ns o i l 施药后天壁望苎! ! ! ! ! 型 数( d ) ! ! ! ： ! ! ! ! 一 童苎 墨垄垩 壹苎 黑龙江 00 1 1 9 01 3 6 01 1 2 o1 3 l 1 4 2 0 3 0 4 0 6 0 消解方程 0 0 9 l 0 0 4 0 0 0 2 l 00 1 4 00 l l 0 0 1 0 00 0 4 0 0 0 3 0 0 0 3 c = 0 0 4 3 9 e “ 00 9 8 o0 4 7 0 0 2 8 o0 1 8 00 1 4 00 1 1 00 0 4 00 0 3 o0 0 3 c = o 0 5 3 2 e 。 o 0 9 6 0 0 5 7 00 2 l 00 1 6 o0 1 3 0 0 0 6 0 0 0 3 00 0 3 0 0 0 3 c ：0 0 4 5 4 e 4 。鲋 o 0 9 7 00 4 7 00 2 7 00 1 9 0 0 1 4 o 0 1 2 00 0 4 00 0 3 o 0 0 3 c = o0 5 3 2 e ” r 0 8 0 5 l 0 8 4 1 207 8 7 7 08 4 7 4 0 1 6 o 1 4 o 1 2 o 1 o 0 8 o 0 6 0 0 4 o 0 2 o o1 02 03 04 05 06 0 时间( d ) 圈3 16 氯嘧磺隆在土壤中的消解动态曲线 她3 1 6 t h e d e 鲫山t j n eo fc h l 州枷枷出y i ms o 27 7 0 一里普一谜璐 置盐盔些拦亟生僮迨塞 塾喳熊壁垒盍星里殛蜜趁查星基隆竖萱塑挂丝盟塞 第四章氯嘧磺隆降解菌的分离鉴定及特性研究 生物修复是利用微生物催化降解污染物，从而消除环境污染的一种新的生物治理 技术。直接向遭受污染的土壤接种外源的污染物降解菌能加速污染物的降解，快速消 除土壤污染，国内外已有应用成功的报道“。 土壤微生物系包括细菌、放线菌、真菌、藻类等，它们均对农药具有分解作用， 而且在土壤中分布甚广。往往某种农药会同时有多种降解微生物，另外，同一种菌也 会对多种农药有分解作用。关于土壤微生物对农药分解的研究，最早要数a u d u s 有关 2 ，4 一滴的分解研究。反复处理的药剂会使该药剂的分解能出现积聚。用2 ，4 一滴 回流土壤，先是被土壤吸附少量的2 ，4 一滴，经过一段时间后则会迅速吸附，随后 在回流土壤中出现一定的分解能，这时再加入2 ，4 一滴后，第二次滞停时间就比第 一次要短得多。另外，用化学结构相似的化合物也出现相同的现象。在农场中连续施 用相同或相似的土壤处理剂也出现不少快速分解、效果下降的例子。处理的药剂达到 初定目标后即会出现迅速分解，其虽能保证耕地环境，但亦因分解迅速在农业上也会 引起问题。有关土壤中农药的代谢至今已进行了大量的研究。对于其分解途径可以常 法获得。综合微生物对农药主要反应可包括：氧化、还原、水解、络合、脱卤、异构 化等。 目前人们对农药降解菌和分解酶的分离、鉴定己进行了不少工作”1 。农药降解 菌主要是从土壤、水体或污泥等污染环境中直接分离 x 直盐壅些盍燮趟盘堂焦诠寞 氢堕道隧垄盎星里毯鱼融查丛基睦鲤菌数技性! 左童 4 2 试验方法陋嘲 4 。2 。1 氯嚷磺隆降解麓的分离与缝俄 取1 9 污泥样品加入盛有5 0 m l 无机盐培养基的三角瓶中，樽将浓度为2 5 0 m g 几 的氯嘧磺隆溶液4 m l 直接加到该锥形瓶中作为微生物生长的唯一碳源( 5 m g l ) ，在摇 痰上培养2 纛( 3 ，8 0 r 瓣i n ) 转接蘩贪氯癌磺隆浓度更裹的培雾基孛，壹至转接 至含氯嘧磺隆2 0 m g l 的培养基中培养2 d 后，在含阋样成分的琼脂平板上接入0 1 m l 培养液，涂布后于3 0 细菌培养基中培养2 d ，挑出单菌落划线分离3 4 次进行纯 化，缝化聪接裁嚣保存俘实验菌株建。 4 2 2 菌株生长及对氯嘴磺隆降解能力的测定 菌株生长量的测定：以末接种的培养基作空白对照，用7 2 3 型分光光度计在5 0 0 n m 波长下测定菌悬液的0 d 值。 液相色谱测定样品的前处理：将含有氯嘧磺隆的培养液以1 0 0 0 0r m i n 离心 5 m i n ，收集上清液，移取2 5 m l 于1 2 5 m l 分液漏斗中分别加入二氯甲烷2 0 m l 、l o m l 、 1 0 m l 三次，剧烈振荡1 m i n ，静置5 m i n ，使水相与二氯甲烷相分层，二氯甲烷相过无 水硫酸钠后，浓缩至近干，吹干后用甲醇定容5 m l ，用于液相色谱分析。 氯嘧磺隆浓度的测定：采用高效液相色谱仪c ，。( 1 0 c m 4 6 咖) ，流动相为甲醇 水乙酸( 7 0 3 0 o 3 ，v v v ) ，流量为l _ o m l m i n ，u v 检测器，波长2 5 4 n m 。进样量 1 0 u l 。 通过菌株生长和氯嘧磺隆降解情况判定降解菌的降解能力。 4 2 3 降解菌株的鉴定 经过对土壤微生物的分离、纯化得到氯嘧磺隆的降解菌株，其形态特征为短杆 状，大小约为0 3 一1 5 0 6 6 o u m ，菌体平直，有时稍膨大，单个、成对或短链状 排列，无鞭毛和芽胞，具有 x 萱盐盔些盘雯亟圭掌焦迨塞 氢堕建睦垄盘垦堕熊笪动查丛基睦盟萱盟壁世巫窒 试验结果表明，在氯嘧磺隆浓度为1 0 一2 0 m g l 的范围内，菌株的生长量及氯嘧 磺隆的降解率随底物浓度增大而增加，当氯嘧磺隆浓度大于2 0 m g l 时，菌株的生长 速度减慢，氯嘧磺隆的降解率也降低。因此，菌株降解氯嘧磺隆的最适起始浓度应为 2 0 m g l 。 表4 1 氯嘧磺隆起始浓度对菌生长的影响 t a m e4 1e f f to f c o n c e n t 随0 o f c h l 嘶m 1 1 r o ne 廿1 y 10 n 掣o w l h0 f 胁6 。把妇啊 凸 。 趔 趟 掣 蓉 01 01 52 02 53 5 氧嘧磺隆起始浓度( 瑚 美 褂 黠 世 图4 1 氯嘧磺隆起始浓度对菌生长的影响 丘g4 1e 慨to f 蛳l c 曲t 血o no fc h l o r i i 哪m l y l 锄g n ) w 廿lo f 她撕如池印 4 3 2 细菌不同接菌量时氯嘧磺隆的降解率 m舳加如们如加加o 们弱筋地：。n=兮0 o 0 0 o o 壹楚盔韭盘芏亟雯壁丝 氢堕熊隆查盘亘里巍壁垒查丛基隆鲤萱曲挂蛙煎童 测定结果表明，接种量对氯嘧磺隆降解速度有一定影响，当接种量在o 5 一1 5m l 时，氯嘧磺隆的降解速率随接种量的增加而加快；但当接种量从1 5 增加到2 5 m l 时，氯嘧磺隆的降解率下降。由此可知，菌株的最适接种量为1 5 m l ( o d 。为o 2 ) 。 表4 2 接菌量对氯嘧磺隆的降解率的影响 t a b l e4 _ 2e 缸o f 叩m 计yo f 尉咖妇如早衄c h l 刚m u r o n 甜l y ld e g m 血t i o n 术 瓣 整 世 0o 5ll5 22 5 接菌量( l l ) 固4 2 接苗对氯嘧磺隆降解的影响 丘g4 - 2e f 诧c to f q u 时o f 蹦j 把池m 衄c h l o 咖l u r o ne c i l y id e g r a d 撕0 n 4 33 氯嘧磺隆降解的影晌因素 无机盐培养基中氯嘧磺隆的起始浓度为2 0 m g l ，加入经预培养的菌体( 0 d 。为 0 2 ) 1 m l ，分别改变温度、摇床转速和溶液的p h 值，培养2 4 小时后测定氯嘧磺隆的 降解率，研究温度、转速和p h 值对氯嘧磺隆降解的影响。 34 蛐鲫加卯如加加加。 置盐垂些太堂塑芏焦造窒 氢壁瑾隆垄盍亘里基置盘查丛基睦鲤菌塑壁世壁塞 4 33 1 温度对氧嘧磺隆降解的影响 在2 5 4 0 培养温度下测定氯嘧磺隆的降解率，结果见表4 3 、图4 3 。研究表 明：菌株降解氯嘧磺隆的最适温度为3 0 ，此时降解率可达到9 1 5 7 。 表4 3 不同温度时氯嘧磺隆的降解率 t a b l e4 _ 3 掣a d 撕o no f c l l l o n m u r o ne t i l y ll l i l d e rd i 脏枷tt a n p i e h 此 1 0 0 8 0 喜6 0 菱4 0 2 0 0 2 02 53 03 54 0 4 5 温度 图4 3 不同温度时氯嘧磺隆的降解率 6 94 - 3d m d a 垃0 no f c l a s s i c 瑚d 盯d i m 妇n p 州吡e 4 3 3 2 摇床转速对氯嘧磺隆降解的影响 摇床不同转速对氯嘧磺隆降解率的影响见表4