（作物遗传育种专业论文）对优质亚基、抗白粉病小麦的分子标记辅助选择方法研究.pdf

贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 摘要 本研究以含p r 0 2 1 的材料和含有5 + 1 0 优质亚基的材料进行多基因聚合育种，并 利用与p m 2 1 基因相连锁的s c a r 分子标记和控制1 d x 5 和1 d y l 0 基因序列的特异 p c r 引物对其杂交后代进行分子标记辅助选择( m a s ) ，通过分析得到以下结论： 1 利用5 亚基和1 0 亚基的特异p c r 标记鉴定几个已知亚基组成材料的i d x 5 基 因型和1 d y l 0 基因型与其s d s p a g e 验证结果相符，而且p c r 标记的结果重复性好， 特异性较强。说明利用i d x 5 亚基和1 d y l 0 亚基的特异p c r 标记选择携带5 亚基和 1 0 亚基的优质基因型不仅可行，而且准确可靠，用于小麦群体改良品质性状的辅助 选择的有效率高，为优质小麦的分子辅助选择提高了可靠依据。 2 利用p m 2 1 抗白粉病基因的特异s c a r l 4 0 0 引物进行辅助选择，在贵农 2 1 n e e p a w a 杂交组合中，m a s 选择正确率为9 5 3 ；在j y 9 7 0 0 1 2 矮2 0 0 2 杂交组 合中，m a s 选择正确率为9 4 1 。两个组合m a s 选择正确率相差1 2 。研究结果 说明，该s c a r l 4 0 0 引物与砌2 j 抗病基因的连锁较紧密，对在育种工作中进行p m 2 1 抗病基因的标记选择十分有效，可以提高小麦抗病种质的育种效率，大大缩短育种进 程。 3 通过亚基和抗病基因的p c r 标记鉴定，在1 0 0 个贵农2 1 x n e e p a w ab c l f l 后代群 体单株和5 0 个j y j y 9 7 0 0 1 2 x 矮2 0 0 2f 3 后代群体单株中可选择到具有抗白粉病基因标 记和不同亚基组合的不同单株。因而，通过分子标记辅助选择可以在较早的世代鉴定 目的基因，为小麦的优质、抗病育种提供了进一步选育的材料，从而提高了选择的效 率。 4 借助与抗病基因相连锁和与小麦品质基因相关的分子标记，初步建立优质抗 病小麦育种的分子辅助选择体系，在育种过程中可以对早代材料进行亚基组成和抗病 基因的分子标记辅助选择，可大大提高杂种后代选择的准确性和育种效率，从而缩短 育种年限，加快小麦品种的繁育速度。 关键词：小麦；g l u 1 位点；抗白粉病基因；p c r ) 分子标记辅助选择 中国分类号：$ 5 1 2 贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 t h e s t u d yf o rm o l e c u l a rm a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o nm e t h o di n w h e a to fg o o ds u b u n i ta n dp o w d e r ym i l d e wr i s i s t a n c eg e n e a b s t r a c t t h eg e n ep y r a m i d i n gi nt h em a t e r i a lt h a tc o n t a i n e dp m 2 la n dt h em a t e r i a lt h a t c o n t a i n e ds u b u n i tp a i r5 + 1 0w e r ed e t e r m i n e d ，a n dt h es c a r - b a s e dm a r k e r sl i n k i n gw i t h p o w d e r ym i l d e wr e s i s t a n c eg e n ea n dt h es p e c i a lp c rp r i m e r sc o n t r o l l i n gt h eg e n e s e q u e n c eo f1 d y l 0a n d1 d x 5w e r eu s e df o rm o l e c u l a ra s s i s t e ds e l e c t i o ni nh y b r i d o f f s p r i n g t h em a i nr e s u l t sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w e d ： 1 t h er e s u l to f1 d x 5a n d1 d y l 0s p e c i f i cp c rm a r k e r sw a sa c c o r d e dw i 也t h er e s u l t o fs d s p a g ei ns o m em a t e r i a l s ，a l s ot h er e p e t i t i o na n ds p e c i a l i t yo fp c rr e s u l t sw e l e g o o d i ti n d i c a t e dt h a tu s i n gt h e1 d x 5a n d1 d y l os p e c i a lp c rp r i m e rt os e l e c ts u b u n i tp a i r 5 + 1 0w a sn o to n l yf e a s i b l e ，a n da c c u r a t e l yr e l i a b l e ，a n di tw a se f f e c t i v et os e l e c tt h eg o o d q u a l i t yi nw h e a ta n dp r o v i d e dt h er e l i a b l eb a s i so nm a s o f w h e a t 2 n 玲m a se f f i c i e n c yo fs c a r m oi nb c i f lb e t w e e ng u i n o n 9 2 la n dn e e p a w a r e a c h e d9 5 _ 3 n l em a s e f f i c i e n c yo fs c a r l 4 0 0i nf 3b e t w e e n j y j y 9 7 0 0 1 2a n da i 2 0 0 2 r e a c h e d9 4 1 t h et w oe f f i c i e n c yd i f f e r e d1 2 1 1 他r e s u l ts h o w e dt h a tt h es c a r t 4 0 0 p r i m e rl i n k e dt op m 2 lm o r ec l o s e l y , t h e nt h i sm a r k e rc o u l db ec o n v e n i e n t l yu s e df o r m a r k e r - a s s i s t e ds e l e c t i o ni nw h e a tb r e e d i n gp r o g r a m sf o rt h ei d e n t i f i c a t i o no rp y r a m i d i n g o f p r 0 2 1 ，a n ds h o r t e nt h eb r e e d i n gp r o c e s s 3 i nt h ep o p u l a t i o no f1 0 0p l a n t sf 3i ng u i n o n 9 2 1 x n e e p a w aa n d5 0p l a n t sb c i f li n j y j y 9 7 0 0 1 2 a i 2 0 0 2c o u l ds e l e c tt h ed m r e n ts u b u n i tc o m b i n a t i o no f p l a n t sw i t hr e s i s t e d p o w d e r ym i l d e wg e n eb yt h es p e c i a lp c rp r i r a e r s t h u sb yw a yo f m a s ，i tc o u l da p p r a i s e t h ep u r p o s eg e n ei ne a r l yf i l i a lg e n e r a t i o n , a n dp r o v i d et h ef i l r t h e rm a t e r i a lo fs e e d s e l e c t i o nf o rt h ew h e a tb r e e d i n go fg o o ds u b u n i ta n dr e s i s t a n t e dg e n e ，t h u sr a i s i n gt h e s e l e c t i o ne f f i c i e n c y 4 h a v i n gt h ea i do f t h ep c r m a r k e rt h a tl i n k e dt ot h er e s i s t a n t e da n dq u a l i t yg e n et o e s t a b l i s hm a ss y s t e mo fg o o ds u b u n i ta n dr e s i s m n t e dw h e a tb r e e d i n g , i tc o u l dt a k et h e p l a c eo fm a st oa s s i s ts e l e c t i n gt h es u b u n i tc o m p o s i t i o n sa n dr e s i s t a n t e dg e n ei ne a r l y f i l i a lg e n e r a t i o n , a n di tc o u l dg r e a t l yi n c r e a s ea c c u r a c ya n db r e e d i n ge f f i c i e n c ya n ds p e e d u pt h eb r e e d i n gs p e e do f w h e a t v a r i e d 髓 k e yw o r d s ：w h e a t ；g l u - 1l o c i ；p o w d e r ym i l d e w ；p c r ；m a s 2 贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 第一章文献综述 小麦是世界上重要粮食作物之一，其种植面积、总产量和总贸易额均居各类作物 之首位。在我国，小麦是第二大粮食作物，其种植面积和产量仅次于水稻，在国民经 济中占有十分重要的地位。随着我国人口继续增长，耕地面积急剧减少和人民生活水 平逐步提高，高产、抗病、优质新品种的选育已成为当前小麦育种工作的重要目标。 传统小麦基因鉴定方法，技术要求较高，影响因素多，实际操作有局限性，尤其 在鉴定和筛选含两个以上基因的材料时更为复杂，难以准确区分基因的具体归属和涉 及的基因数目，许多重要性状( 如品质) 都必须到发育后期或成熟期时才得以表现， 因而选择也只能等到那时才能进行。而利用与目标基因紧密连锁的分子标记追踪基 因，可使目标基因的鉴定摆脱上述因素带来的困难且结果更加准确可靠。以d n a 多 态性为基础的分子标记，目前已在作物连锁图谱构建、重要农艺性状的标记定位、种 质资源遗传多样性与品质指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用。尤其是近年来发 展起来的分子标记辅助选择( m a r k e ra s s i s t e ds e l e c t i o n ，m a s ) 为育种者提供了对目 标性状进行高效选择的手段( t a n s l e ys d 等，1 9 8 9 ) ，已成为近年发展分子育种的重 要组成部分。 目前小麦的许多重要性状已获得分子标记，包括与抗病、抗逆有关的质量性状和 与产量品质等有关的数量性状，在育种过程中，利用与这些基因紧密连锁的分子标记 进行辅助选择，从d n a 水平上进行选择，判断目的基因是否存在，并可鉴定某一个 体可能带有的基因，检钡6 出多个基因的累加体，极大地提高了遗传育种的效率( 刘景 芳等，2 0 0 2 ) 。 1分子标记成功应用于辅助选择的基础与应用 1 1 分子标记成功应用于辅助选择的前提与基础 分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能，因为分子标记的基因型是可以 识别的。如果目标基因与某个分子标记连锁紧密，那么通过对分子标记基因型的检测， 就能获知目标基因型( 方宣钧等，2 0 0 1 ) 。因此，我们能够借助分子标记对目标性状 的基因型进行选择，这称为分子标记辅助选择( m a s ) 。这是分子标记在育种中应用 的最主要方面。 小麦基因与分子标记的紧密连锁为利用分子标记进行辅助选择提供了可能。三个 贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 方面的进展使分子标记在小麦遗传育种研究中应用已经或正在变为现实( l u o 等， 1 9 9 6 ) 。第一，小麦基因组的研究已为小麦若干重要性状的基因提供了可用于选择的 分子标记；第二，p c r 技术已简化到可以推广应用程度，每人每天可进行4 8 0 0 份材 料的分析；第三，应用分子标记辅助选择已有一定成效。如l u o 等( 1 9 9 6 ) 对位于中 国春4 d l 端部的耐铝基因a l t 2 用x p s r - 9 1 4 和x p s r l 0 0 5 1 进行了标记，确定a l t 2 位于 x p s r 3 9 末端，而与x k s u c 2 相邻，同时与k n a l ( k + n a + 选择吸收基因和耐盐基因) 相 邻，以此为标记，在硬粒小麦的4 d 代换系后代中选出了两个4 b s 、4 d l 易位系，将 中国春耐铝、耐盐基因导入了硬粒小麦，提高了硬粒小麦的抗铝和抗盐性。t a b l e r t 等( 1 9 9 6 ) 用与抗小麦条纹花叶病w s m l 连锁的r a p d 标记克隆测序后，合成了专化 r a p d 引物，该引物使w s m l 的抗性在实验室进行大批量早代选择，进而加速了w s m l 导入生产品种的进程。 至今，在玉米、水稻、番茄、棉花、小麦等作物中定位了许多重要农艺性状的基 因，如抗病、抗虫、育性恢复基因等。这些是成功应用m a s 的基础。分子标记不仅 能对质量性状进行辅助选择，还可以对产量、成熟期、品质、抗旱性等数量性状位点 ( q t l s ) 进行辅助选择。现已成功地定位了水稻粒型、生育期、产量构成因素，番 茄圆形物含量、成熟期、水分利用率等许多数量性状位点( t a n k s l e ys d ，1 9 9 6 ) ，这 使分子标记应用于多基因控制的数量性状的辅助选择，并最终对其进行遗传操作成为 可能。 1 2 分子标记辅助选择在回交育种中的应用 回交育种一般是将具有特异种质的地方品种、近缘材料或育种中间材料作为供 体亲本，与综合性优良但必须改良个别性状的受体亲本杂交，再用该受体亲本不断回 交，达到改良受体亲本的目的。由于连锁累赘( l i n k a g e d r a g ) ，在回交过程中不仅转 入了目标性状，而且也会转入与目标基因连锁的其他基因t a n k s l e y 等( 1 9 9 6 ) 地模 拟研究表明，在传统的回交育种中，即使回交2 0 代，在目标基因周围还能发现长达 1 0 c m 长的供体亲本染色体片段，而对于大多数作物来说，1 0 c m 长的染色体片段中 d n a 足以包含几百个基因。传统回交育种无法鉴别目的基因周围发生的重组，难以 消除连锁累赘。而采用高密度的分子标记连锁图谱有可能直接找到在目标基因附近重 组的个体，在较少的回交代数中缩短外源片段长度以达到去除不利基因的导入，从而 避免或减少连锁累赘加快育种进程：同时，应用目的基因的紧密连锁分子标记辅助育 4 贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 种，可选择只含目标性状的个体进行下一轮回交，省去自交，可大大缩短育种年限。 基于d n a 分子辅助选择( m a s ) ，可利用目的基因的特异分子标记直接对基因 型选择，以提高群体中目的基因的频率和选择的准确性。因此，分子标记辅助选择是 小麦轮回选择中提高育种效率的重要手段。 1 3 分子标记辅助选择多个基因的聚合 基因聚合( g o n ep y r a m i d i n g ) 已成为现代作物育种的一个重要手段，就是将分散 在不同品种中的有用基因聚合到同一基因组中。通过利用各目的基因的分子标记先在 不同亲本中将基因定位，然后通过杂交或回交将不同的基因转移到一个品种中，通过 检测与不同基因连锁的标记的基因型来判断该个体是否含有某一基因，以帮助选择， 可有效地完成基因的垒集。 基因聚合在抗病育种中是一个重要的育种目标。人们在抗病育种实践中，逐渐认 识到单个抗病基因的使用会导致品种抗性很快在生产中丧失，而把抗不同生理小种的 抗病基因聚合到一个品种中，不仅可以提高品种的抗病性和抗病持久性，而且聚合有 不同抗性基因的品种抗谱拓宽了。c i m m y t 利用抗性聚合方法，通过多点鉴定培育 出一批多抗小麦品种，在世界许多地区大面积推广。南京农业大学细胞遗传所( 刘金 元等，2 0 0 0 ) 利用常规育种结合分子标记辅助选择也培育出了一批含p m 基因的小麦 抗白粉病基因聚合体的品种( 系) 。张增艳等( 2 0 0 2 ) 利用分子标记选择得到了小麦 抗白粉病基因p m 4 b 、p m l 3 和砌2 聚合体；刘景芳等( 2 0 0 2 ) 利用分子标记辅助选 择得到了小麦抗白粉病基因p m l 3 及p m 4 的累加体。 目前，在小麦中已建立了多个性状的r a p d 、s s r 、r f l p 和a f l p 等标记，充 分利用这些p c r 标记，在小麦育种实践中开展标记辅助选择和多基因聚合。对于促 进小麦育种材料农艺性状的不断改进，实现小麦品种的优质、抗病和高产目标具有重 要的作用。 2 分子标记辅助选择在小麦优质抗病育种中的研究进展 在整个作物新品种培育过程，就是育种家在自觉或不自觉地用于性状遗传变异规 律，创造性地将控制目标性状的有利基因有机地结合于某一植株个体或某一作物群体 中。因此，对控制目标性状的有利基因的正确选择是育种工作的中心环节。 传统的基于表型的选择方法存在许多缺点，效率较低。要提高选择的效率，最理 想的方法应是能够直接对基因型进行选择。分子标记辅助选择实际上就是将表型的检 贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 测转移成了基因型的检测，可以大大缩短育种进程并提高育种效率( 方宣钧等，2 0 0 1 ) 。 利用易于鉴定的遗传标记来辅助选择是提高选择效率和降低育种盲目性的手段。 在小麦育种过程中，常常需要将不同亲本材料的优良性状结合起来。在对抗病性 和品质等性状进行鉴定和选择的时候，如何准确和快速鉴别需要转移的抗病及品质基 因，对选育新一代优质、抗病小麦品种具有重要意义( 徐如宏等，2 0 0 5 ) 。 2 1 小麦品质育种中分子辅助选择的研究 2 1 1h m w 谷蛋白亚基类型及其遗传控制 h m w 谷蛋白亚基是由染色体l a ，l b ，l d 长臂上的位点控制，总称为g l u - 1 位点， 分别用g l u - a 1 ，g l u b 1 ，g i u - d 1 ( p a y n e ，1 9 8 0 ) 表示。每个g l u - 1 位点都有两个相距 很近、表现为紧密连锁的基因( h a r b e r de ta l ，1 9 8 6 ) ，分别控制分子量较高的x _ 型亚 基和分子量较低的y - 型亚基( p a y n e ，1 9 8 2 ，l a w r e n c e1 9 8 3 ) 。理论上，在普通小麦应 有六条h m w - g s 谱带，但由于h m w - g s 部分基因处于沉默或不表达状态，所以每个 品种只含有3 5 条带( a n d e r s o n0d ，1 9 8 9 ) ，其中2 条由l d 位点控制，l 条或2 条由l b 位点控制，1 条或n u l l i 扫1 a 立点控制。且各位点存在大量的变异，其中以1 b 的最大， 1 a 的最小。g l u - a 1 位点编码亚基n u l l 、2 + 和l ；g l u - b 1 位点编码1 7 + 1 8 、1 3 + 1 6 、7 + 8 、 7 + 9 、6 + 8 、7 、2 0 、1 4 + 1 5 、2 2 等亚基；g l u - d l 位点编码5 + 1 0 、2 + 1 2 、3 + 1 2 、4 + 1 2 、 2 + 1 0 、1 2 等亚基( p a y n e ，1 9 8 3 ) 。这些位点上的差异以及不同亚基的组合都会导致小 麦加工品质的差异( a l v a r e zjb ，1 9 9 9 ) 部分亚基及其命名见图1 。 专o 士。 o - ：u o i ：士垒三当一 图1 1 耶唧n g s 主要变异类型及编号 f i g 1 1 v a r i o u sh m w - g sa n dt h ec a t a l o g u e 2 1 2h m w 谷蛋白亚基与小麦品质的关系 p a y n e 和c o r f i e l 于1 9 7 9 年首次发现了单个h m w 亚基与小麦品质的高度相关性 之后，国外许多研究者对h m w 麦谷蛋白亚基与烘烤品质的关系进行了继续研究。他 6 上苎敏。 藕一 贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 们的研究结果大多一致，就是g i u - a i 编码的l 和2 + 亚基，g l u - b 1 编码的7 + 8 、1 7 + 1 8 、 1 3 + 1 6 、1 4 + 1 5 亚基，g i u - d i 编码的5 + 1 0 亚基，均与面包加工品质存在着正相关关 系，其中以亚基5 + 1 0 对烘烤品质的贡献最大，几乎所有的研究都证明了这一点( 张 金莲，1 9 9 8 ) ，而亚基n u l l 、6 + 8 、2 + 1 2 与烘烤品质呈负相关( b r a n l a r dg 等，2 0 0 1 ； b n f i e s c 等，2 0 0 1 ：j o h a n s s o n e 等，1 9 9 5 ；l u o c 等，2 0 0 1 ；毛沛等，1 9 9 5 ；m o o n e n j h e 等，1 9 9 3 ；p a y n e p i 等，1 9 8 7 ) 。 不同高分子量谷蛋白亚基对面包烘烤品质具有相对重要性( 马传喜，1 9 9 5 ) 。赵 和( 1 9 9 4 ) 等认为g i u - d i 的效应明显高于g i u - a i 和g i u - b i 的作用，这与国外其他 学者的研究结论一致( p e t e ri ，1 9 8 1 ) 。许自成( 1 9 9 8 ) 等，认为5 + 1 0 亚基对小麦品 质的贡献明显大于其它亚基( b u o n o c o r ef1 9 9 6 ) ，其次是7 + 8 、2 + ，和4 + 1 2 亚基； 而6 + 8 、2 + 1 2 、2 0 、n u l l 亚基的作用较小；个别亚基如7 + 9 亚基的重要性因试验材料 不同而有出入。关于7 + 8 、1 7 + 1 8 亚基的相对重要性，大多数研究者认为这两对亚基 对面包烘烤品质的贡献要好于7 + 9 。 p a y n e 等( 1 9 8 7 ) 根据不同亚基对烘烤品质的贡献，制定出了g l u - i 位点亚基评分 标准，见表l _ l 。 表i ig k i 品质评分比较 t a b l e1 1t h ec o m p a r i s o no f g l u - 1q u a u t ys c o r e s 品质得分1 广 b 生i d l al 由表1 1 可看出，由g i u - d i 位点编码的亚基组合5 + 1 0 得分最高，对烘烤品质的贡 献作用最大，是最强效的优质亚基，这一结果已经得到国际公认。但在p c n a 博士等 ( 1 9 9 5 ) 研究中报道在以往普通小麦中未曾发现过来自t t a u s c h i i ( 节节麦) g i u - d i 位点编码的各种等位基因新类型，在这些g i u - d i 等位基因中，发现具有5 + 1 2 亚基和具 有1 5 + 1 0 j e 基的合成种，它们在一些品质性状和面包体积上优于含有其它g i u - d i 编码 的h m w - g s 的合成种，包括国际公认的优质亚基5 + 1 0 。同时，p e n a ( 1 9 9 5 ) 对一些 具有相同硬粒小麦遗传背景但g l u - d 1 位点不同的合成六倍体群体的品质性状进行比 贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 较，表明具有h m w g s 组合5 + 1 2 或1 5 + 1 0 的合成六倍体比具有其它亚基的合成六倍体 具备更好的品质性状。 我国小麦具有高分子量谷蛋白优质亚基及其组合d x 5 + d y l 0 、a x 2 + 、b x l 7 + b y l 8 的品种较少，其中具有5 + 1 0 亚基品种的比例只有国外品种的3 0 ，而具有2 + 1 2 等 亚基的品种较多。因此，今后小麦品质育种的主要目标之一是转育和增加优质高分子 量谷蛋白亚基。 2 1 3 分子技术在h m w 麦谷蛋白亚基研究中的应用 在传统育种中鉴定高分子量麦谷蛋白亚基的组成，主要依据s d s - p a g e 的迁移率 不同。该方法不仅破坏种子，无法实现自动化操作，而且在电泳图谱上亚基的迁移率 与分子量并不是总一致的，从而混淆分子量不同而迁移率相似的亚基，因此在精确筛 选和检测杂种后代时受到限制。利用分子标记技术，不仅可以在小麦的各生育期进行 高分子量麦谷蛋白亚基的检测，而且可以保证评价亚基的正确性。 p c r 技术操作技术要求不高，是一种比较简单、快速的测定方法。利用特异p c r 标记检测出样品中是否携带该蛋白质亚基的编码基因，从而达到检测该蛋白亚基的目 的。目前，已有3 5 个h m w - g s 的基因被克隆和测序，包括1 a x l 、l a x 2 + 、n u l l 、1 b x 7 、 l b y 9 、1 b x l 7 、1 b x 2 0 、1 d x 5 、1 d y l 0 、1 d x 2 n 1 1 d y l 2 等( a n d e r s o n0 de t a l ，1 9 8 9 a ： a n d e r s o n 0 d ，1 9 8 9 b ；t h o m p s o n r de l a l ，1 9 8 5 ；s u g i y a m a te t a l ，1 9 8 5 ；f o r d e j ， 1 9 8 5 ) ，i b l 4 + 1 5 i ! 基也已被测序( 邓志勇，2 0 0 1 ) 。获得的这些小麦贮藏蛋白编码的 基因序列都为 i m w - g s 的遗传转化和小麦品质分子标记辅助选育奠定了基础( r o o k e l ，1 9 9 9 ) 。 d ，o v i d i o 和a n d e r s o n ( 1 9 9 4 ) 据1 d x 5 基因的序列设计了一对特异引物，该引物的 扩增结果表明，凡d x 位点携带d x 5 基因的材料都能扩增i 4 5 0 b p 的特异片段，而具有 d x 2 的品种没有此片段。检测结果不受g l u - 1 d x 相同位点2 、2 2 、2 2 + 、a m 4 基因的影 响。v a r g h e s e 等( 1 9 9 6 ) 利用相同引物也得到相同的结论，检测结果与s d s p a g e 结 果相符合，结果不受小麦生长时期的影响。同年，s m i t h 等( 1 9 9 4 ) 根据已发表的1 d y l 0 基因( g l u d 1 2 b ) 序列，设计并合成引物并对已知亚基类型的的l o 个普通六倍体小 麦栽培种和6 个黑小麦种进行了特异扩增，结果表明，引物p 3 和p 4 从d y l o 基因型中扩 增出5 7 6 b p 的片段，从d y l 2 a i 天i 型中扩增出6 1 2 b p 的片段，根据这两个片段很容易区 分这两种基因型。b u s t o s 等( 2 0 0 0 ) 根据g l u - a 1 和g l u - d i 的核酸序列设计了一套 贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 a s p c r 的分子标记，结果与h m w - g s 的蛋白质电泳结果一致。因此，h m w - g s 的特 异p c r 标记可作为检测小麦染色体上的h m w - g s 的另一种方法。 梁荣奇等( 2 0 0 1 ) 利用5 亚基和1 0 亚基的特异性p c r 标记，对1 9 个已知的h m w - g s 组成的品种进行了扩增。结果表明，对d x 5 的扩增片段为4 5 0 b p ，对d y l 0 的扩增片段 为5 7 6 b p ，而具有1 2 亚基的材料扩增片段为6 1 2 b p ，结果与h m w - g s 的蛋白质电泳结果 一致。孙辉、刘志勇等( 2 0 0 2 ) 也通过实验证明了s i i l i t h 设计的引物可以准确鉴别d y l 0 和d y l 2 亚基，同时发现这个引物还可以初步鉴定g l u - b 1 位点的1 4 + 1 5 亚基。 到目前为止，利用等位基因特异p c r 弓i 物辅助选育研究的h m w - g s 有：l 、2 + 、7 、 1 7 、5 、l o 和1 2 等。基于p c r 的品质辅助选择在国内外刚刚起步，在小麦育种早代应 用的报道很少，大多在转基因后代检测、纯系品系引物验证和遗传研究等方面。随着 分子标记等新技术的应用，与s d s - p a g e 相结合，将大大推进h m w - g s 研究利用进程。 总之，将优质亚基的特异p c r 标记应用于面包小麦烘烤品质育种中杂种后代的选 择，可望加速育种过程，把分子标记技术和常规育种经验相结合，具有重要的现实意 义和潜在的应用前景。 2 2 分子标记辅助在小麦抗白粉病育种中的研究 小麦白粉病( e r y s i t h e g r a m i n i s f s p t r i t i c i ) 是小麦世界性病害，主要分布于潮湿及半 干旱地区。我国小麦白粉病自7 0 年代末期以来发病范围和严重程度都有显著增加。 近年来，小麦白粉病在我国所有小麦种植区均有发生和流行，已成为我国小麦生产的 第一大病害。 小麦白粉病菌具有小种多、变异快、适应范围广等特点，因此是一种难以防治的 小麦病害。小麦白粉病菌群体往往会因寄主抗性基因的选择作用而发生协同进化，大 规模种植单个抗性基因的品种，会使病原物产生优势小种，克服该抗性基因，这将导 致病害大流行，给小麦生产带来灾难性后果( 盛宝钦等，1 9 9 5 ) 。到目前为止，最为经 济，安全和有效的防治小麦白粉病的方法是选育和推广抗病品种( 张增艳等，2 0 0 2 ) 。 近年来，随着分子标记逐步发展和完善，使得小麦众多抗性基因被不断标记出来， 这为分子标记辅助选择育种尤其是筛选多抗性基因聚合体提供了条件a 2 2 1 小麦抗白粉病基因的来源及抗性基因利用评价 截至目前己发现4 9 个小麦抗白粉病主效基因，分布在3 2 个位点上，其中包括 1 8 个复等位基因，已命名的基因编号从p m l 到p m 刀。目前，除3 a 、2 d 、4 d 和6 d 9 贵州火学2 0 0 6 届硕士学位论文 外，小麦其它染色体上都有抗白粉病基因分布( 解超杰等，2 0 0 1 ) ，这些抗性基因共有 两类来源，一类是来自普通小麦，包括p m l ( a - c ) 、p m 3 ( a - j ) 、p m 5 ( b - e ) 、p m l 8 、 p m 2 2 、p m 2 3 、p m 2 4 、p r 0 2 9 等；另一类斯来自小麦的野生近缘物种，如高大山羊草、 拟斯卑尔脱山羊草、黑麦、簇毛麦、斯卑尔小麦、波斯小麦等。大多表现显性遗传， 少数为隐性遗传( p m 5 、p m 9 和p r 0 2 6 ) ，许多p m 基因来源于小麦的近源种属，因此 利用外源抗病基因可以极大地丰富普通小麦的抗病基因资源，同时也有助于扩大小麦 育种的遗传基础。 4 9 个小麦抗白粉病基因的抗性是不尽相同的，且存在着地区差异。在中欧地区， p 肌j + 尸肌2 + p m 9 和p m 2 + p m 6 基因组合表现出较高的抗性( z e l l e r ，1 9 9 3 ) ，而单基因 中p m 3 d 、p m 4 b 和p m 6 抗性最好( p e 廿o v ae la l ，2 0 0 0 ；z e l l e re ta l ，2 0 0 2 ) 。在我国栽 培小麦品种中的小麦白粉病抗性基因包括：p m 2 、p m 3 d 、p m 4 a ，p m 5 ，p m 6 ，p m 8 ， p m 2 1 、p r 0 2 3 和p m 2 4 ，以及p m l + p m 2 、p m 2 + p m 3 d 、p m 2 + p m 4 a 、p m 4 b + p m 6 、 p m 2 + 尸珊铀+ 砌6 等基因组合( 王瑞等，2 0 0 0 ；周益林，2 0 0 2 ) 。p 历门、p r 0 1 3 、p m l 4 、 p m l 6 、p m l 8 、p ，”j 9 、p r 0 2 1 、p r 0 2 2 、p r 0 2 3 、p r 0 3 0 在我国表现出良好的抗性( 张海 泉等，2 0 0 3 ：邱永春等，2 0 0 4 ) 。在这些抗病基因中，p r 0 2 1 不仅抗中国目前报道的所 有白粉病菌毒力小种及被检测的1 2 0 个欧洲生理小种，而且栽培品种无明显的不良性 状，在不同小麦遗传背景下抗病性均表现稳定( 刘金元等，1 9 9 9 ) 。应在多样化的原 则上加速腑2 在育种中的应用。 2 2 2 小麦白粉病抗性基因的分子标记 小麦白粉病抗性基因的分子标记筛选研究始于上世纪9 0 年代初，通过筛选有效 的近等基因系和利用分离群体分组分析法( b s a ) ，已有许多个小麦白粉病基因获得 了至少一种类型的d n a 分子标记。在小麦抗白粉病基因分子标记研究中，常用的 d n a 分子标记有：r f l p 、r a p d 、s s r 、a f l p 、s c a r 等。 2 2 2 1r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) r f l p ，即限制性片段长度多态性，是基于s o u t h e r n 杂交的分子标记方法，是指 用限制性内切酶酶切不同个体基因组d n a 后，酶切片段长度所显示的差异。该技术 利用一组放射性同位素( 通常是3 2 p ) 或非放射性物质( 如生物素、地高辛等) 标记 的探针进行分子杂交，通过放射性自显影( 或非同位素技术) 观察酶切片段的差异， 以检测遗传位点的多态性。 o 贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 r f l p 是研究最早的分子标记技术，1 9 8 0 年b o t s t e i n 等首先提出利用r f l p 作为 标记构建遗传图图谱。h a r t l 等最早于1 9 9 3 年以n i l s 为材料，用该技术找到了与小 麦抗白粉病基因p m 3 紧密连锁的r f l p 标记。m a 等( 1 9 9 4 ) 用近等基因系和它们的 轮回亲本c h a n c e l l o r ( c c ) 来鉴定与抗白粉病基因p m l 、p m 2 、p m 3 、p m 4 连锁的r f l p 标记。随后，又相继找到了p m 5 ( c h a o 等，1 9 8 9 ) 、p m 6 ( 陶静文等1 9 9 9 ) 、p m l 2 ( 贾 继增等，1 9 9 3 ) 、p m l 3 ( c e n e i 等，1 9 9 9 ) 、p m j 7 ( h s a m 等2 0 0 0 ) 、p r 0 1 8 ( h s a m 等， 1 9 9 8 ) 、p r 0 2 6 ( r o n g 等，2 0 0 0 ) 、p m 2 7 ( j i r v e 等，2 0 0 0 ) 、p m 2 9 ( z e l l e r 等，2 0 0 2 ) 连锁的r f l p 标记。 由于小麦相对狭窄的遗传基础，它的r f l p 多态性较低( c h a o 等，1 9 8 9 ) ，再加之 该技术克隆可表现基因组d n a 多态性的探针较为困难，实验操作较繁琐，检测周期 长，即使应用非放射性的s o u t h e r n 杂交技术，仍是个耗时费力的过程，因而在一定程 度上限制了小麦r f l p 标记的筛选和其在分子辅助育种中的应用。 2 2 2 2r a p d ( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) r a p d ，即随机扩增多态性d n a ，是由w i l l i a m s 等( 1 9 9 0 ) 和w b l s h 等( 1 9 9 0 ) 分 别发展起来的一种分子标记技术。该技术是以随机引物( 一般为8 1 0 b p - ) 通过p c r 反 应非定点扩增d n a 片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染色来显示扩增d n a 片 段的多态性。扩增片段多态性反映了基因组相应区域的d n a 多态性。r a p d 的特点是 有多个不依赖于种属和基因组结构的非特异性引物。与r f l p 相比，其简单易行、d n a 用量少、无需放射性同位素、周期短等优点，尤其在寻找与目的基因连锁的分子标记 方面可得到广泛应用。 h a r t l 等( 1 9 9 5 ) 利用f 2 分离群体构建的d n a 池进行r a p d 分析，筛选到一个 与t r i g o b r 4 3 中的未知抗白粉病基因连锁的r a p d 标记( 1 3 士1 6 c m ) 。随后，鉴定出 了与p m l a ( h u 等，1 9 9 7 ) 、p m 2 ( 刘金元等，2 0 0 0 ) p m 4 a ( 李松涛等，1 9 9 5 ) 、p m 6 ( 王心字等，2 0 0 0 ) 、p r 0 1 2 ( s h i 等，1 9 9 7 ) 、p m l 7 ( 张旭等，1 9 9 8 ) 、p r 0 2 1 ( q i 等， 1 9 9 6 ) 、p r 0 2 5 ( s h i 等，1 9 9 8 ) 连锁的r a p d 标记。 2 2 2 3 s s r ( s i m p l es e q u e u n c er e p e a t s ) s s r 是基因组充分序列中的一种类型，又称为微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) ， 重复单位很短，只有l 5 b p ，总长度为几十个b p ，随机分布于整个基因组的不同位置 上。s s r 标记的最大优点是具有大量的等位差异，多态性十分丰富。目前s s r 标记 贵州大学2 0 0 6 届硕士学位论文 已广泛应用于遗传作图和种质鉴定等，由于它具有操作简便和稳定可靠等优点，似有 逐渐取代r f l p 标记的趋势( 方宣均，2 0 0 1 ) 。 在小麦中，s s r 已被证实是一种非常有效的分子标记，与r f l p 相比能检测到更 高的多态性( r o d e r 等，1 9 9 5 ；d e v o s 等，1 9 9 5 ) 。s s r 标记在小麦的遗传研究中有很 大的应用潜力。但s s r 检测部分同源位点的频率低于r f l p ，且小麦的s s r 标记不 会象r f l p 标记那样容易检测其它种属的部分同源位点。 目前，s s r 标记已用于抗白粉病基因的标记定位研究中。h u a n g 等( 2 0 0 0 ) 找到 了与p m 2 4 紧密连锁的s s r 标记，j g r v e 等( 2 0 0 0 ) 在定位p m 2 7 ，l i u 等( 2 0 0 2 ) 在 定位p r 0 3 0 ，解超杰等( 2 0 0 3 ) 在鉴定新的抗白粉病基因p m 3 1 时也应用了s s r 标记。 2 2 2 4 s c a r ( s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n ) s c a r 即序列特征扩增区，是在r a p d 技术的基础上发展起来的。其基本步骤是： 先作r a p d 分析，然后把目标r a p d 片段( 如与某目的基因连锁的r a p d 片段) 进行 克隆和测序，根据原r a p d 片段两末端的序列设计特定引物( 一般比r a p d 引物长， 通常1 8 砣4 个碱基) ，再进行p c r 特异扩增，这样就可把与原i l a p d 片段相对应的单 一位点鉴定出来，这样的位点就称为s c a r 。s c a r 标记一般表现为扩增片段的有无， 为一种显性标记；但有时也表现为长度的多态性，为共显性的标记。 s c a r 标记比r a p d 技术有如下优点：由于使用较长的引物和高退火温度而具有 高的稳定性；有将显性r a p d 标记转化为共显性的s c a r 标记的可能性；如果是显 性标记，则在检测中可以直接染色而无需电泳检测基于这些优点，s c a r 标记成为目 前分子标记在育种实践中能直接应用的首选标记。 在近几年开展的抗病基因标记研究中，许多研究者均将r a p d 标记转化s c a r 标记，并在转育后代中得到了验证。“u 等( 1 9 9 9 ) 将p m 2 1 的r a