药品生测技术.ppt

药品生测技术,授课人:汪穗福(高级讲师)苏惠虹(助理讲师)广州市医药中专学校,教学目标：、述说生物测定概念、应用范围与任务、简述生物测定的由来和发展、与相科的关系、熟知生物测定的统计符号与常用代号教学重点：、述说生物测定概念、应用范围与任务、生物测定的统计符号与常用代号教学难点：、生物测定概念、生物测定的由来和发展、生物测定的统计符号与常用代号,无菌检查抽测滤过程影片,细菌内毒素检测,讲授新课：第一章绪论,第一节药品生物测定技术的范围与任务药品生物测定技术是指利用药物对生物体(整体动物、离体组织、微生物和细胞等)所起的药理作用或毒理作用及其它反应来测定药品的有效性(生物活性或效价)、安全性(毒性或某些有害物质限度检查、无菌和控制菌检查)和研究药物量效关系，以反应临床功能及效价和安全的一门学科。它是以生物学的方法和药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计与对比检定的方法或其它方法(如微生物法)来进行各种反应、试验、检查，最终来评价(或评定)药品的有效性、安全性的一门综合性实验技术学科。,由于药品是用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能，并规定有适应症、用法和用量的物质。因而其质量特性必需具有效性与安全性。而药品有效性必须是疗效确切，且含有特定的有效活性成分和一定浓度含量。凡是不能用理化方法测定其含量或有效成分或虽有理化方法测定，但不能真实反映临床实际应用价值的药物效价测定，可用生物测定法进行测定，其原理是利用其药物效价(浓度)在一定范围内，其药理作用随着浓度的增加而增强。即在一定条件下存在直线关系，因而可应用生物测定方法，把供试品和标准品在一定条件下进行比较，以计算出供试品的效价。我们将这种利用药物对生物体的作用，选择适当的反应指标(如抑菌圈直径、升降血压指标等)将药物的供试品(T)与标准品(S)在同一条件下进行对比，以对T的效价(毒力)进行检定的方法称为对比检定。,在生物测定中所选择的药理作用必须能反映所含主要有效成分的作用，但亦不一定是该药物在治疗上的作用。因此，生物测定主要的任务是测定药品效价和有害物质的检查(药品中存在的某些有害物质，可对生物体产生生理作用，影响用药的安全，如异常毒性、毒力、热原、细菌内毒素、升降物质、过敏性杂质等)、无菌检查和微生物限度检查。归纳起来，药品生物测定技术的任务和应用（用途）包括以下方面:,（1）药品活性（效价）测定中国药典（一部）（二部）(2005年版)规定了肝素、绒促性素、胰岛素、缩宫素(催产素)、洋地黄、硫酸鱼精蛋白、精蛋白锌胰岛素注射液、升压卵泡刺激素、黄体生成素、降钙素及抗生素效价等都需用生物测定方法来测定效价或其生物活性。,（2）药品有害物质检查中国药典（一部）（二部）(2005年版)规定抗生素类药物、注射剂等多种药物要进行有害物质检查。如降压、升压物质的检查，异常毒性、毒力实验，热原质检查、细菌内毒素检查、过敏物质的过敏反应检查、葡萄糖酸锑钠毒力、溶血与凝聚检查,缩宫素的生物测定,返回,细菌内毒素检查,（3）药品无菌检查无菌制剂(注射液、滴眼制剂等)不得含有活菌，因此必须进行无菌检查，以保证用药安全。（4）药品微生物限度检查非无菌制剂(口服片剂、胶囊剂等)不得含有控制菌和染菌数不得超过一定限度，必须对其进行微生物限度检查。,降压物质检查与大肠杆菌检查图,药品微生物计数与无菌检查图,（5）检验方法的核对和标准品或对照品的标定。（6）神经介质、激素及其微量生理活性物质的测定。（7）中药及其制剂质量的控制。（8）新药的寻找及其活性研究。,前面四种的任务和应用是药品生物测定技术的主要用途，后面几点用途在研制新药，中药制剂等其它方面才应用，在此不详细论述。同时，本教材对中国药典（三部）的生物制品，血液制品和不能用化学测定效价的某些生化制剂方面的生物测定技术暂不予讨论。,第二节药品生物测定的由来和发展,一、动物单位表示效价阶段早期生物、药理工作者运用生物反应的程度来代表药物的效价，如洋地黄对治疗心力衰竭有好疗效，但因各批次产品的作用强度不一致，导致有时效力过强或不足，有人就利用洋地黄能使青蛙死于心室收缩期停止这样一个生物反应，建立早期的洋地黄蛙法生物测定，即以能使青蛙心室收缩期停止的按每g体重所需的洋地黄用量，称为洋地黄的一个蛙单位。也有人早期以能使家兔每100ml血液中血糖下降至45mg所需的胰岛素最低用量称为胰岛素的一个兔单位。,这就是早期以“动物单位”来表示药物效价的生物测定的早期阶段。“动物单位”初步解决了药物效价的表示方法，但因动物单位表示法易受动物种属、来源、体质、年龄、性别、季节以及实验操作等因素的影响使各项测定结果间相差悬殊，同时又因“动物单位”可用多种动物表示，如洋地黄可有蛙单位，猫单位。猫单位和蛙单位相比效价相差多少，如何换算，而且也会因检验的时间、地点、条件和动物来源等因素不同，导致测出的单位差异很大。显然用“动物单位”来表达药物效价有很大的缺陷。,二、对比检定阶段1897年Ehrlich首先采用了供试品和标准品对比的效价表示方法，即对比方法。它是在同样试验条件下，测得标准品和供试品产生相同生物反应时的剂量比值，作为供试品相当于标准品的效价倍数。它在1914年首次制出白喉抗毒素的对照标准品，并将供试品与标准品在同一试验条件下比较其产生相同反应的剂量，从而计算出供试品相当于标准品的效价。Ehrlich创立的这种对比检定和标准品的方法，明显地缩小了由于生物差异性所产生的误差，它不同于动物单位这种绝对的效价单位表示法，而是以与标准品对比的相对效价表示。这样同一药物在不同检验室检验时，即使实验条件和其他因素对生物反应产生影响，但因采用了对照方法，这些因素同时对标准品、供试品都起着同样的作用，在对比检定时可使这些影响因素彼此抵消，使它们之间的强度比值保持不变，这就大大提高了生物测定的可靠性和重现性。,从此，改变了用“动物单位”来表示效价单位的概念，而以对比检定和标准品的概念奠定了现代生物测定的基础，因此要求建立那些不能用化学量和物理量表示强度的生物测定用标准品的呼声越来越高，国际联盟首先承担了统一制备激素、抗生素、血清、疫苗和血液制品等标准品的任务，国际联盟撤销后，由世界卫生组织(WHO)设置了生物标准化专家委员会，继续此项工作。具体工作仍由丹麦哥本哈根血清研究所和英国生物标准检定所两个单位承担。1935年后各国都成立了生物标准品研究中心，制定本国的国家标准品，使生物测定技术迅速得以发展。目前已成为各国药典中许多药物测定效价的经典方法之一。,三、通用标准品阶段随着药物纯化、合成、分析和鉴定技术的发展，特异、灵敏、通用检验方法的建立，致使用生物测定方法测定的品种日见减少，现主要集中在结构尚未具体弄清的活性物质，多组分的抗生素和一些组成不均一的多肽、蛋白质类激素等。因此国际生物标准物质的品种也相应集中，而内在的质量要求(效价)却在不断提高。如人绒毛膜促性腺激素(HCG)第一次国际生物标准品为片剂，每片重10mg，含HCG10IU，第二次国际生物标准品为冷冻干燥品，原料效价提高到2180IU/mg。现行的第三次国际生物标准品原料效价提高到9286IU/mg，成为供生物和免疫测定用高纯通用国际标准品。,随着分子生物学的发展与基因工程的诞生，医药用基因工程产品正在临床上替代从人体提取的产品，如人生长激素。因此WHO组织研制了供理化和生物法检定用的基因工程人生长激素国际标准品，并组织了国际协作研究与标定，保持其活性单位与第四次人垂体提取的人生长激素国际生物标准品的连续和一致，从而完成了从生物标准品向理化和生物通用标准品的过渡。目前WHO又在组织由提取的促卵泡激素(FSH)生物标准品向基因工程生产的高纯FSH标准品的过渡，以适应基因工程生产的生产与应用。相信不久的将来越来越多的理化和生物通用标准品问世与不断发展。,第三节生物测定用的标准物质药品标准物质是执行药品标准的基础，它是用于检查药品质量的一种特殊的专用量具，是一类与其它领域不同的特殊标准物质。国际上标准物质根据不同的使用对象与测定方法，分为生物标准物质与化学标准物质两类，再根据使用要求不同又分为国际、国家、工作用三级标准物质。分别由WHO、国家、研究生产单位制备供各自使用。作为生物标准物质是用于那些不能用化学或物理量表示强度，而只能用生物方法测定效价的品种。只有当被测物质纯度提高，结构清楚后用理化方法控制质量分析条件成熟后，该品种的化学测定用标准物质即应建立，生物标准物质则完成其使命而停用。,一、生物标准物质效价单位的含义与表示方法效价单位是生物测定中表达药物效力强弱或活性物质含量的一种公认的计量单位，每种对比用的标准品都有法定的效价单位含义，以资统一。最初用动物单位，即在规定的实验条件下，把对于某种动物产生一定程度的药理反应的药量作为该药品的效价单位。如胰岛素的一个国际单位仍沿用过去“动物单位”的原始含义，定义为能使一定条件的实验家兔血糖下降到45mg100ml血所需胰岛素的最少的量。而有些则经专家协议规定一定重量作为一个效价单位，如脑垂体后叶缩宫素的效价定为每0.5mg相当于一个国际单位。,以上效价单位的定义，无论是用何种方法确定，凡一经确定，以后就不再变更，且原来确定单位的定义亦不再起作用了，这时所谓一个国际单位仅有生物效价上的相对意义，即供试品与标准品对于某些生物体产生相同反应时，供试品的用量就可以用相应标准品的效价单位数来标示。一个国际单位的供试品有产生一个国际单位标准品相同的特定生物反应的含义。另外，随着技术的发展，制品的纯度越来越高，但重量单位的含义依然不变，只是将单位重量内所含的效价单位数不断提高。由于新标出的国际标准品的国际单位都是根据前一次国际标准品的标示效价标化出来的，故每一个单位的效力前后都是一致的。供试品不论与那一次国际标准品对比，都可得出相同的标示效价，以保持国际单位生物效价的连续性。,二、标准品1.国际标准品(IS)与国际参考品(IRP)1897年Ehrlich首次开始使用标准品后，到第一次世界大战后，国际联盟首先承担了统一制备激素、抗生素、血清、疫苗和血液制品等标准品的任务，国际联盟撤销后，由WHO设置了生物标准化专家委员会，继续此项工作。具体工作仍由丹麦哥本哈根血清研究所和英国生物标准检定所两个单位承担。国际标准品单位的确定是由世界卫生组织邀请有条件的国家检定机构或药厂参加协作标定后，最后由生物测定专家委员会通过决定的。生物参考试剂(IRR)，两者总称为生物标准物质,我国从1975年参加了生物标准化专家委员会会议，1976年承担了部分品种的国际协作标定。这些由生物测定专家委员会通过决定、表示药物效能强度的单位即称国际单位，IU/mg、IU/ml、IU/安瓿方式表示。另外1958年起，又建立了一类不用国际单位表示效价的国际参考品。由此有了IS与IRP二类标准品，到了1986年第37次生物测定专家委员会决定对以国际单位表示的称为国际标准品(IS),而其它的都称为国际,2.国家标准品标准品制备中必须严格考核其同质、均一、准确和稳定性，一般制成干燥粉末，熔封于装有惰性气体或真空安瓿里，或准确定量分装后冷冻干燥，标准品应按规定条件保存。它是各国指定的机构选定一批性质完全相同的药物与国际标准品进行比较，定出它的效价，统一向全国检定，科研、教育、生产单位分发，作为检定产品效价时使用。我国从1952年开始逐步建立药品和生物制品国家标准品，由中华人民共和国卫生部审定，具体工作由中国药品生物制品检定所统一负责。从1952年至于1995年间共建立了供生物测定用标准物质19个品种92批，已建立的品种中，当前尚有9种作为国家生物标准品，一种作为生物参考试剂在使用。其余品种已不使用或停发。,3.工作参考品通常由产品的研制、生产单位自己制备的，仅供地区内部使用的称之。第四节生物测定技术与相关学科的关系生物测定技术是药物分析专业一门重要的专业课，它涉及到许多门学科，与许多门学科关系十分密切。首先它是运用了生物学、药理学的实验方法,即利用药物对生物体的药理反应来测定该药物的生物活性(效价)。采用对比检定方法，通过等反应剂量间比例的运算，从而测得供试品的效价。因此，使到生物测定成为了一种测定药物效价必不可少的方法之一。,同时生物测定中许多的检定实验方法都直接借鉴和应用了生物学、药理学的实验方法，如实验动物的捉拿、注射、动物的选用等都和生物、药理实验有密切关系，并在此基础上不断完善和发展，目前己成为了一门重要的独立检测技术。药品生物测定技术与微生物学的关系。微生物是生物测定中使用最多的生物材料之一，如效价的测定要使用微生物指示菌，药品的微生物限度(细菌、霉菌或酵母菌计数测定、控制菌检查)、无菌检查要检测微生物。检验所用的材料和培养基要灭菌、消毒等,都涉及到微生物学的基础知识与原理。,更重要的是抗生素的效价检定，药物的无菌检查、微生物限度检查(细菌、霉菌总数、控制菌检查)是生物测定中应用最多、最广泛的项目之一。抗生素的效价检定就是直接利用药物对微生物的反应来测定抗生素效价的，它具有许多理化方法不能代替的优点。而生物测定中的药品无菌检查和微生物限度(微生物总数、控制菌检查)检查是保证药品的安全性、卫生质量和卫生标准的重要工作。在这些检验中，无论是实验操作，还是理论知识都渗透了许多微生物学基础知识，诸如菌种的生物学特性、培养与菌悬液制备、繁殖、灭菌、检验方法、生化反应鉴定等都与微生物学紧密相关。因此、学习生物测定时，一定要和微生物学紧密结合，这样才能学好学活。,药品生物测定技术与生物统计学(数理统计)的关系。生物统计是应用数理统计的原理与方法来分析和解释生物界各种现象和数量资料的科学，这就形成专门以生物为对象的数理统计分支，称为生物统计。在药品生物测定和研究药物对生物体的作用时，所研究的对象是生物，由于生物本身病理、生理状态不同，生物间普遍存在着变异现象，在种与种之间，个体与个体之间存在着差异性，加之机体与药物相互作用的不同，导致生物试验的结果常常是参差不齐。要想通过有限的实验数据，概括出一个药物对生物作用的普遍规律，除了在实验前进行周密的实验设计外，在实验结束后，对这些生物差异性及试验数据整理、归纳、研究分析这些差异是由许许多多内外因素偶然性的配合而引起的，还是存有普遍性与规律性。,这就需要借助数理统计的知识予以综合和分析，找出规律性的东西，从偶然出现的表面现象中揭示其中必然性的规律，这就形成了以生物为对象的数理统计分支-生物统计。由于生物测定是利用活性物质对生物所致的各种反应，从定量的角度研究剂量和反应间的关系。且生物差异性普遍存在于生物测定中，实验设计、操作程序、结果计算和结论推导等等，无不贯穿着数理统计的一般原理及其应用。如差异规律及其分布，概率、显著性水平、线性关系、方差分析等，同时由于生物测定是采用了对比设计，还包括了对比试验中所特有的一些设计和计算方法，如平行线原理，误差的一些特殊估计方法等，都是贯穿了各种统计原理及其应用。它是在应用统计学领域中对学生最具有实践意义的一门学科。在生物测定中，只有正确地应用统计的原理进行实验设计，数据处理和统计分析，才能用最少量的动物，最经济的时间与方法得到相对可靠的结果。因此生物测定离不开生物统计作指导，同时又是生物统计在数理统计方面的具体体现和实际应用。,因此，生物测定统计是认识药品生物测定实验中各种现象数量特征的重要工具，正确地运用生物测定统计分析，能够帮助我们正确认识事物客观存在的规律性。应用生物统计时要防止统计万能论和统计无用论，如果不顾条件和具体情况，一切依赖于生物统计这是有害无益的。生物统计只能帮助我们在合理的科学设计基础上分析认识问题，而关键是科学实验数据本身的可靠性，所以良好的实验设计是正确运用统计的先决条件。在生物测定的平行线测定实验设计类型就采用随机设计、随机区组设计、交叉设计三种类型。,但实验数据不可靠，统计分析的结果也徒劳的。对于那种认为一切科学实验都是通过大