（临床医学专业论文）成年豚鼠膝状神经节细胞及螺旋神经节细胞的体外培养.pdf

中文摘要 目的：研究成年豚鼠面神经膝状神经节解剖。对比不同培养条件下膝状神经节细胞 ( g g c s ) 和耳螺旋神经节细胞( s g c s ) 的体外生长特征以确定适宜的体外培养方 法。 方法：在解剖显微镜下对成年豚鼠颞骨内段面神经进行解剖和观察。通过光镜下观 察解离细胞数，比较胰酶和i 型胶原酶对面神经和螺旋神经节的消化效果。消化后 采用下列两种培养方案：( 1 ) 用含血清培养基接种，待细胞贴壁后全量换为含血清 替代物的无血清培养基维持培养，( 2 ) 用含低浓度血清及有丝分裂抑制剂的培养基 接种并维持培养。分别在培养后第4 天、第7 天、第1 l 天和第1 6 天在光学显微镜 下观察g g c s 和s g c s 的生长特征。选取状态良好的生长期进行神经元细胞的免疫 荧光鉴定。 结果：成年豚鼠的膝状神经节与面神经主干相比没有明显膨大，不易定位。胰酶无 法消化膝状神经节组织，但对螺旋神经节有一定消化能力。i 型胶原酶消化后的膝 状神经节组织和螺旋神经节组织可以解离出大量游离细胞。体外g g c s 主要为较小 的梭形细胞，细胞核不明显，突起少但长而纤细；细胞呈链状聚集排列：g g c s 培 养至第l l 天时即出现大量解体。体外s g c s 的胞体较大、形状不规则，细胞核清晰 可见，突起较多，临近神经元间形成突触联系；细胞呈片状聚集生长；培养1 1 天 时，含有有丝分裂抑制剂的低浓度血清培养组s g c s 出现明显衰退现象；培养至第 1 6 天，两组神经元均大量死亡。杂质细胞多见于低浓度血清培养组。 结论：( 1 ) 膝状神经节取材时可选择颞骨内的全程面神经，从而保证膝状神经节取 材的完整性。( 2 ) 成年豚鼠的g g c s 和s g c s 可以在体外成功培养。( 3 ) 膝状神经 节组织与螺旋神经节组织适宜用i 型胶原酶进行化学消化，而胰酶仅对螺旋神经节 组织有一定的消化解离效果。( 4 ) 采用低浓度血清培养基联合有丝分裂抑制剂培养， 或者用高浓度血清培养基接种后换用含有血清替代物的无血清培养基维持生长，都 可以成功培养g g c s 和s g c s 。但低浓度血清的存在促进非神经元细胞的增殖，有 丝分裂抑制剂虽然可以在一定程度上抑制非神经元细胞的增殖，但其长时间存在可 加速神经元细胞衰退、死亡。用无血清培养基进行培养，可以减少非神经元细胞的 增殖，神经元生长状态良好。( 5 ) 体外培养的g g c s 和s g c s 在细胞粘附、细胞形 态和聚集方式上均有不同 关键词：膝状神经节，螺旋神经节，解剖，细胞培养，成年豚鼠 3 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t ea n a t o m yo fg e n i c u l a t eg a n g l i o ni na d u l tg u i n e ap i g t o d e t e r m i n eo p t i m a li n v i t r oc u l t u r es y s t e m sf o rg u i n e ap i g sg e n i c u l a t eg a n g l i o nc e l l s ( g g c s ) a n ds p i r a lg a n g l i o nc e l l s ( s g c s ) b yc h a r a c t e r i z i n gt h ei n v i t r og r o w t ho fg g c s a n ds g c su n d e rd i f f e r e n tc u l t u r es y s t e m s m e t h o d ：a n a t o m i s ef u up a t ho ff a c i a ln e r v ec o u r s i n gt h r o u g ht h et e m p o r a lb o n ea n d d i s s e c ts p i r a lg a n g l i o no fa d u l tg u i n e ap i gu n d e ra n a t o m i cm i c r o s c o p e d i g e s tt h ef a c i a l n e r v ea n ds p i r a lg a n g l i o nt i s s u ew i t ht r y p s i no rc o l l a g e n a s et y p ei a f t e re n z y m a t i c t r e a t m e n t ，t h er e m a i n i n gt i s s u ei sc u l t u r e df o l l o w i n gt w op r o c e d u r e s o n eg r o u pi s p l a n t e dw i t hab a s i cc u l t u r em e d i u ms u p p l e m e n t e dw i mh i 曲c o n c e n t r a t i o no fs e r u m s u b s t i t u t et h ep l a n t i n gm e d i u mw i t has e r u m f l e em e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t ha s u b s t i t u t eo fs e r u ma ss o o na st h a tm o s tc e l l sh a v ea d h e r e dt ot h ew a l l so fc u l t u r ep l a t ei s o b s e r v e d t h eo t h e rg r o u pi si n c u b a t e di nab a s i cc u l t u r em e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t h1 0 w c o n c e n t r a t i o no fs e r u ma n dm i t o t i ci n h i b i t o rd u r i n gt h ew h o l ep e r i o do fi n v i t r oc u l t u r i n g c h e c kt h es u r v i v a la n da p p e a r a n c eo fg g c sa n ds g c sa td a y4 ，7 ，1 1a n dl6f o l l o w i n g p l a n t i n g n e u r o n sa r ei d e n t i f i e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c em e t h o d r e s u l t ：g e n i c u l a t eg a n g l i o no fa d u l tg u i n e ap i gh a sn oo b v i o u se n l a r g e m e n ti nd i a m e t e r c o m p a r e dw i t hf a c i a l n e r v et r u n k g e n i c u l a t eg a n g l i o nt i s s u ed o e s n tr e s p o n s et o t r y p s i nw h i l es p i r a lg a n g l i o nt i s s u ei sd i s p e r s e di n t os i n g l ec e l l sb yt h i se n z y m e m u c h m o r es i n g l ec e l l sa r eo b s e r v e di nt h ev i s u a lf i e l da f t e re n z y m a t i ct r e a t m e n tb y c o l l a g e n a s et y p ei i n v i t r og g c sa r el i t t l es p i n d l ec e l l sw i t hf e wb u n d l ef i n en e u r i t e s g g c sd i s t r i b u t ei nc h a i n l i k ep a t t e r n a td a y1 1d i s i n t e g r a t i o no fm a j o r i t yo fg g c si s o b s e r v e d i n v i t r os g c sa r eb i gc e l l sw i t hl a r g er o u n dn u c l e u s s g c sa r ei r r e g u l a ri n s h a p eh a v i n gs e v e r a ln e u r i t e sp r o j e c t i n gf r o mt h eb o d yo fc e l l s g c st e n dt og a t h e r a r o u n da n dt h ei n t e r c o n n e c t i o n sb e t w e e nn e u r o n sa r ea p p a r e n t a td a y1 1 d e g e n e r a t i o n o fs g c si sm o r es i g n i f i c a n ti nt h em e d i u mc o n t a i n i n gs e r u ma n dm i t o t i ci n h i b i t o r t h e a p p e a r a n c eo fn o n n e u r o nc e l l si sm o r ep r o f o u n di nm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t hs e r u m c o n c l u s i o n ：g e n i c u l a t eg a n g l i o no fa d u l tg u i n e ap i gi sd i 衢c u l tt ol o c a t e g g c sa n d s g c so fa d u l tg u i n e ap i gc o u l ds u r v i v ei na p p r o p r i a t ei n v i t r oc u l t u r ec o n d i t i o n t i s s u e o fg e n i c u l a t e g a n g l i o na n ds p i r a lg a n g l i o nc o u l db ed i g e s t e dw i t hc o l l a g e n a s e t y p e1 w h i l et r y p s i nc a no n l yd i s p e r s et h et i s s u eo fs p i r a lg a n g l i o n b o t ht h em e d i u m w i t hl o wc o n c e n t r a t i o no fs e r u ma n dm i t o t i ci n h i b i t o ra n dt h es e r u m f r e em e d i u m s u p p l e m e n t e dw i t has u b s t i t u t eo fs e r u ma r ea b l et om a i n t a i nt h eg r o w t ho fg g c sa n d s g c si nv i t r o e x i s to fl o wc o n c e n t r a t i o no fs e r u mf a c i l i t a t e st h eg r o w t ho fn o n n e u r o n c e l l s m i t o t i ci n h i b i t o ri sa b l et op r e v e n tt h em u l t i p l i c a t i o no fn o n n e u r o nc e l l st oa c e r t a i nd e g r e eb u ti ta l s op r o d u c ec y t o t o x i ce f f e c tt on e u r o n s u s i n gs e r u m f r e em e d i u m n o to n l yc a ni n h i b i tm u l t i p l i c a t i o no fn o n n e u r o nc e l l sb u ta l s oa v o i dt h ep o t e n t i a l c y t o t o x i ce f f e c tp r o d u c e db ym i t o t i ci n h i b i t o r k e yw o r d s ：g e n i c u l a t eg a n g l i o n ，s p i r a lg a n g l i o n ，a n a t o m y , c e l lc u l t u r e ，g u i n e ap i g 4 1 - 1 日i j 舌 神经元细胞原代培养是研究神经细胞形态、功能以及病理生理变化的重要手段 之一。而取材于实验动物的原代神经元培养物，更是创建人类神经系统疾病动物模 型的重要材料。其中，细胞培养在病毒学方面的研究最为广泛，除用作病毒的病原 分离外，还可研究病毒的繁殖过程及其细胞的敏感性和传染性( 细胞的病理变化及 包涵体的形成) 、观察病毒传染时细胞新陈代谢的改变，探讨抗体与抗病毒物质对 病毒的作用方式与机制等。应用细胞培养来研究病毒时有下列优点：1 、减少隐性 感染的机会；2 、离体细胞没有免疫力，利于病毒生长；3 、容易选择易感细胞以满 足实验要求；4 、接种量大；5 、培养条件易于控制；6 、提高疫苗的产量和质量；7 、 加速病毒分离过程等。 面神经膝状神经节和耳螺旋神经节是中耳内的重要结构，膝状神经节细胞 ( g e n i c u l a t eg a n g l i o nc e l l s ，g g c s ) 和螺旋神经节细胞( s p i r a lg a n g l i o nc e l l s ，s g c s ) 的离体细胞培养物在人类面神经和内耳病变的研究中应用前景广泛。豚鼠由于其颞 骨结构与人类极为相似，是研究人类中耳及内耳病变的良好动物模型【1 ，2 】。在已有 的豚鼠颞骨解剖的文献中，均未对膝状神经节的具体位置作出描述。目前已发表的 文献报道中仅有新生或胚胎啮齿类g g c s 和s g c s 体外培养研究成果，以及少量的 成熟s g c s 的培养报道 3 5 】。g g c s 和s g c s 的体外纯化培养主要采用联合有丝分 裂抑制剂的含低浓度血清的合成培养基，以及含有其它血清替代物的无血清合成培 养基，可以得到纯度较高的g g c s 和s g c s 体外培养物。至今，尚无成年豚鼠g g c s 和s g c s 体外培养的研究。 本实验将探讨成年豚鼠膝状神经节和螺旋神经节的解剖，以及不同培养基成分 对g g c s 和s g c s 的体外培养产生的影响。 5 实验材料 1 实验动物与主要试剂 选用协和医院实验动物中心提供的成年h a r i l e y 豚鼠( 图1 ) ，体重1 8 0 2 0 0g ， 雌雄= _ j - = 限。3 戊巴比妥钠腹腔注射处死，注射剂量1 25 1 5m l k g 。 图1 成年h a r i l e y 豚鼠 2 主要试剂及器材： 幽22 4 孔培养扳。 ( 1 ) 细胞培养：d m e m f 1 2 混合培养基( g i b c o ) 、b 2 7 ( g i b e o ) 、胎牛血清( f e t a l b o v i n es e r l l m ，f b s ；g i b c o ) 、两性霉素b ( f t m g i z o n e t m ，2 5p g m l ；g i b c o ) 、 青一链霉素( 1 ，v v ；g i b c o ) 、i 型胶原酶( 1m g m l ；g i b c o ) 、i 型脱氧核 糖核酸酶( d n a s e l ，1m g m l ；s i g m a ) 、胰蛋白酶( 02 5 w v ig i b c o ) 、 h a n k s 平衡盐溶液( h b s s ；g i b c o ) 、d - h a n k s 平衡盐溶液( d h b s s ；g i b c o ) 、 左旋多聚赖氨酸( p o l y - l l y s i n e ，p l l ，00 1m g m l ；s i g m a ) 、阿糖胞苷( c y t o s i n e b - d - a r a b i n o f i a r a n o s i d e ，a r a - c ，5g m o l m l ；华尔博) 、去离子水( 自制) ：2 4 孔培养板( c o s t a r ) ( 图2 ) 。 ( 2 ) 免疫荧光：a l e x a f l u o r 4 8 8 标记的鼠抗神经元细胞核( n e u n ) 单克隆抗体 ( 1 ：1 0 0 ；m i l l l i p o r e ) 、磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ，oo l m o y l ；) 、无水丙酮。 ( 3 ) 仪器：倒置光学显微镜( l e i e a ) ，荧光显微镜( o l y m p u s ) 。 实验方法 1 主要试剂配制及培养板包被 1 1 培养基 ( 1 ) 含高浓度血清( f b s1 0 ，v v ) 的d m e m f 1 2 培养基，添加青一链霉素( 1 ， v v ) 及f u n g i z o n e ( 2 5p g m l ) ： ( 2 ) 含低浓度血清( f b s2 ，v v ) 的d m e m f 1 2 培养基，添加a r a - c ( 5 “r n o v m l ) 、 青一链霉素( 1 ，v v ) 及f u n g i z o n e ( 2 5p , g m l ) ； ( 3 ) 含营养添加剂( b 2 72 ，v v ) 的无血清d m e m f 1 2 培养基，添加青链霉素 ( 1 ，v v ) 及f u n g i z o n e ( 2 5p g m l ) 。 1 2 培养板包被 1 2 1 原理 体外培养的神经元对底物有较高的要求，使用经过某些大分子物质包被的玻璃 或塑料器皿更适于神经元细胞的黏附和生长。常用的包被底物有多聚阳离子分子 ( 如p l l ) 、细胞外基质成分和细胞粘附分子。其中以p l l 最为常用，包被方法简 便，价格适中。p l l 通过结合血清内的特定成分，改变器皿表面的电荷以促进细胞 的黏附和贴壁。 1 2 2 步骤 用p l l 进行包被的常用工作液浓度为0 0 1m g m 1 广0 1m g m l 。研究采用0 0 1 m g m l 的包被浓度，首先将p l l 用灭菌去离子水配制成lm g m l 储存液，一2 0 。c 冷 冻保存，使用前用灭菌去离子水稀释到工作浓度。将稀释后的p l l 滴入灭菌后的 2 4 孔培养板的孔中，覆盖底面即可，3 7 培养箱中过夜包被。次日取出培养板，吸 净孔中剩余的p l l ，用灭菌去离子水冲洗2 3 次，超净台中风干后即可使用。 2 豚鼠面神经与耳蜗的解剖 2 1 原理 豚鼠颞骨及其内容物的结构与人类大致相似。面神经由脑干发出，经内耳门的 括号内均为最终浓度。 7 面神经孔直接进入颞骨岩部1 - 2m m 。内耳门被横嵴分为上f 两部分，f 方为窝神经 i l ：上方又被垂直嵴分为前方的面神经孔和后方的前庭神经孔。进入颓骨后，面神 经在耳蜗底面的内侧面向上移行为面神经的中耳水平段，水平向后跨过卵圆窗的上 方，发 i 鼓素神经后，在水平半规管下方，移行为第三段经过鼓环后上方的骨孔离 开颞骨( 图3 ) 。人类面神经迷路段与鼓室段移行处的膨大结构即为膝状神经节，但 豚鼠膝状神经节的具体位置尚无文献进行描述。豚鼠耳蜗大致呈水平方向悬吊在听 泡内侧壁，底部在后上，窝尖在前下，圆窗面向鼓膜。【1 ，2 。：蔑区鑫爹鼍 图3 豚鼠面神经侧面观。a 面神经主干b 面神经分支c 锤砧复合体，d 后鼓室气房。 2 2 步骤 将注射过量麻醉剂处死的豚鼠在4 酒精中浸泡5 分钟，络合碘冲洗头部平 卧位放置于解剖台上。 ( 1 ) 定位面神经出颞骨位点。用直剪沿中线将头部皮肤纵向剪开，向两侧钝性剥 离至外耳道，剪丌外耳道软骨，可见软骨环后方面神经主干的颞骨外段( 图 4 ) 。 嘲4 面神经颗骨外段侧面观( 左侧) 。a 面神经b 外耳道。 ( 2 ) 定位面神经入颞骨位点面神经孔。剥离顶枕部肌肉层，用咬骨钳钳开两 侧项骨、部分枕目擞颢骨岩部。小心将大脑半球推向中线，暴露内耳门。如 图5 所示，可见位于前卜方的而神经孔和后上方的前庭神经孔。 幽5 内耳门r 面观( 左侧) 。a 面神经孔，b 前庭神经孔。 ( 3 ) 解剖颞骨内面神经全程。在解剖显微镜下沿面神经走行方向逐步开放面神经 骨管。豚鼠骨质薄而脆，崩血管钳或眼科镊即可钳开，操作精确简便、对神 经损伤小。将面神经游离至颞骨外段，分别在内耳门和外耳道后方处剪断神 经主干，放入4 d h b s s 中短暂保存( 图6a d ) 。 图6 鼓宣腔及面神经上面观( 左侧) 。a 从面神经孔逐步开放面神经哥管，可见面神经( a ) 乖直进 颢骨约2m m 后转为向后外侧沿水平方向走行，从锤砧复合体( b ) 上方跨过。b 面 神经中耳水平段部分主干仍穿行于骨管中。c 颍日内面神经全程，箭头标示处为面神经孔( c ) 。 d 取f 面神经后可见锤砧复合体、残留的部分面神经骨管以及耳蜗底面( d ) ， ( 4 ) 完整取下耳蜗( 图7 ) ，放入4 d - h b s s 巾短暂保存。 j 簟 创7 豚鼠耳蜗 3 分离细胞培养法培养g g c s 及s g c s 3 1 原理 常用的原代神经元细胞培养法有分离细胞培养法、组织块培养法以及重聚集培 养法。用分离细胞培养法获得的单层细胞培养物最适宜进行形态学观察，并且细胞 易于受到培养环境中某些因素的控制，符合本实验的主要研究目的。 将组织解离成单细胞悬液的方法主要包括机械分离法和化学消化法。某些类型 细胞的黏附需要二价阳离子，因此减少二价阳离子的存在有助于细胞的离散。因此 在不含c a 2 + 、m 矿的平衡盐溶液( 如d h b s s ) 中对组织进行漂洗、粉碎和收集， 有利于细胞的分散。用于组织消化的酶有多种，最常用的是胰蛋白酶( t r y p s i n ) 。而 在消化含较多结缔组织的成年动物外周神经节时，也可使用胶原酶( c o l l a g e n a s e ) 。 在消化过程中可能有部分细胞溶解，释放的d n a 可形成黏性的“糊状物”，因此可 在消化液中加入d n a s e 以水解细胞释放的d n a ，从而促进细胞的分散。 用作神经元体外培养的理想培养基需要同时满足两个条件，提供神经元生长必 需的营养物质和抑制非神经元细胞的生长。有实验证明，采用联合有丝分裂抑制剂 的含低浓度血清的合成培养基，以及含有其它血清替代物的无血清合成培养基，均 可以得到纯度较高的原代神经元体外培养物 3 6 】。由于实验采用的培养板用p l l 进 行了预先包被，为了促进细胞贴壁粘附，在使用无血清培养基培养之前，需要用含 有血清的培养基进行接种，待细胞贴壁后再换为无血清培养基。 3 2 步骤 将取下的面神经和螺旋神经节分别放入盛有4 cd h b s s 的无菌培养皿中，用 眼科剪将组织剪碎。用以下两种方法进行化学消化： 1 m g m li 型胶原酶3 7 。c 消化4 0 分钟，1m g m ld n a s e l 继续消化2 0 分钟，f b s 终止消化； 0 2 5 胰酶3 7 c 消化3 0 分钟，lm g m ld n a s e l 继续消化2 0 分钟，f b s 终止消 化。 终止消化后，将组织块、细胞悬液在8 0 0r p m 下离心l o 分钟，小心吸弃上清。 将用i 型胶原酶和胰酶处理后的组织分别按下列两种程序进行培养。 加入含1 0 f b s 的d m e m f 1 2 培养基，吹打混匀后接种在2 4 孔板中。接种后 每2 4 小时观察一次，细胞贴壁后全量换为无血清培养基：含2 b 2 7 的 d m e m f 1 2 培养基。此后每4 天半量换液。 加入含2 f b s 的d m e m f 1 2 培养基，吹打混匀后接种在2 4 孔板中。此后每4 天用相同的培养基半量换液。 表1 用胰酶或i 型胶原酶消化后用低浓度血清和无血清培养法的交叉分组。 实验组培养物消化方法培养方法 g t lg g c s胰酶+ d n a s e含1 0 f b s 的d m e m f 1 2 接种， s t ls g c s细胞贴壁后全量换无血清培养基 g t 2g g c s胰酶+ d n a s e含2 f b s 的d m e m f 1 2 直接培 s t 2s g c s养，每四天半量换液一次 g c l g g c si 型胶原酶含1 0 f b s 的d m e m f 1 2 接种， + d n a s e细胞贴壁后全量换无血清培养基 s c ls g c s g c 2 g g c si 型胶原酶含2 f b s 的d m e m f 1 2 直接培 + d n a s e养，每四天半量换液一次 s c 2 s g c s 4 形态学观察 在倒置光学显微镜( l e i c a ) 下观察神经元细胞贴壁情况、贴壁细胞形态、细胞 维持生长状态；非神经元细胞存在情况等。 5 免疫荧光鉴定 5 1 原理 鼠抗n e u n 单克隆抗体是一种神经元特异性抗体，可以用于鉴定中枢神经系统 多种类型的神经元细胞，包括小脑、大脑皮质、海马、丘脑、脊髓神经元，以及周 围神经系统中的背根神经节、交感神经节和肠道神经节神经元。免疫荧光染色主要 位于细胞核内，胞浆淡染。该抗体适用于人类、其它灵长类、小鼠、大鼠、猪、鸟 类、鸡和鼬类等物种来源的神经元细胞。用于免疫荧光的稀释比例为1 ：1 0 0 ( 抗 体：p b s ) 。a l e x af l u o r 4 8 8 是结合在该抗体上的荧光素。因此需要鉴定的细胞经过 一抗孵育后即可在荧光显微镜下进行观察。 + 实验组编号的第一位为所培养细胞种类的英文首字母，g 代表膝状神经节细胞，s 代表螺旋神经节细胞；第 二位为主要消化酶的首字母，t 代表胰酶，c 代表胶原酶：第三位数字，l 代表无血清培养法，2 代表低浓度血 清培养法。 1 2 5 2 步骤 将培养第7 天的细胞用8 0 丙酮室温下固定l o 分钟，p b s 冲洗3 次。用含 1 0 f b s 的p b s 室温下封闭3 0 分钟，p b s 冲洗3 次。加入a l e x af l u o r 4 8 8 标记 的鼠抗n e u n 单克隆抗体4 。c 孵育过夜，p b s 冲洗3 次，每次5 分钟。荧光显微镜 ( o l y m p u s ) 观察培养细胞染色情况。 1 3 结果 1 光学显微镜下神经元细胞生长特性 采用02 5 胰酶消化后的g g c s 和s g c s 培养物中( g t l 、s t l 、g t 2 和s t 2 组) ， 仅有少量单个细胞从组织块中游离出来，其中s g c s 培养物中的游离细胞数略多于 g g c s 。接种2 4 小时后观察，g t l 和g t 2 组分散的单个细胞呈圆形，仍悬浮在培养 液r l ；延长观察至4 8 小时，仅偶见单个细胞贴壁，即停止后续培养。s g c s 接种至 2 4 小时，仅有少量细胞贴壁；延长观察至4 8 小时，可见较多细胞贴壁，此时s t l 组与s t 2 组未见明显差异( 图8 ) 。 口 c i ) 圈8 用02 5 胰酶消化2 4 小时和4 8 小时后的臃状神经节和螺旋神经节组织。a 膝状神经节 组织消化2 4 小时后仅有少量分散的单个细胞。b 膝状神经1 ，组织消化4 8 小时后，偶见贴肇 细胞。c 螺旋神经节组织消化2 4 小时后，可见少量细胞贴壁。d 螺旋神经节组织消化4 8 小 时后，贴壁细胞增多，胞体上伸展出突起。 接种4 8 小时后，将s t l 组培养液全量换成添加有b 2 7 的无血清培养基，培养 至第4 天时，贴壁生长的神经元胞体明显增大，细胞核清晰可见，核仁1 4 个不等， 从胞体伸出的突起较短。用含低浓度血清和a m c 的培养基接种的s t 2 组，培养至 第4 天时，胞体上伸展出的突起纤长临近神经元间形成突触联系、 父i cd 幽9s t l 组s g c $ 茌尢血福堵荞基中的维持生长情况，a 培养第4 大，神经元胞体明显增人， 细胞坎清晰可见，从胞体伸展山较短的突起。b 培养第7 天，突起生长延长。c 培养第l i 天 部分神经元细胞出现衰退现象。d 培养第1 6 天，人量神经元e 亡。 口哥 凹1 0s t 2 组s g c s 在低浓度血清培养摹中的维持生长情况。a 培养第4 天，神经元突起纤k ， 柑互交织。b 培养第7 无，突起增多，胞体呈较大的不规则形状。c 培养第1 i 天，部分神经 元细胞核空泡样变人，部分细胞开始裂解。d 培养第1 6 天人量神经元死亡。 突起相互交织。培养至一周时，s t l 和s t 2 组神经元的突起均有所延长、突起增多， 胞体较大呈不规则形状。培养1 1 天时，s t 2 组部分神经元的细胞核呈空泡样扩大， 有些细胞开始裂解，突起消失，胞体挛缩。s t l 组螺旋神经节细胞衰退现象不如s t 2 组明显。培养至第1 6 天，两组神经元均大量死亡。( 图9 ，图1 0 ) 培养过程中，s t l 组和s t 2 组培养物中均未见明显的非神经元细胞增殖。 用i 型胶原酶消化的膝状神经节和螺旋神经节组织( g e l 、g 0 2 、s e l 和s c 2 组) ， 产生的游离细胞明显多于胰酶消化后的游离细胞。接种2 4 小时后，膝状神经节和 螺旋神经节组织悬浮液中均有较多细胞贴壁。延长观察至4 8 小时，两种组织培养 物中的贴壁细胞数进一步增多。血清含量对细胞贴壁没有明显影响( 图1 1 ) 。接种 4 8 小时后，将g e l 组和s c l 组培养液全量换成添加b 2 7 的无血清培养基。 c 工；0 ；妻l 攀；投d 图1 1 爿j l m g m l i 型胶麒酶消化2 4 小时和4 8 小时厉的膝状神经节和螺旋神经节组织。a 膝 状神经口组织消化2 4 小时后，少量细胞贴壁。b 膝状神经节组织消化4 8 小时后，贴螭细胞增 多，胞体增人、胞核可见。c 螺旋神经节组织消化2 4 小时后，少量细胞贴壁。d 螺旋神经节 组织消化4 8 小时后，贴壁细胞增多。贴壁细胞主要聚集在来消化的组织块附近。 g g c s 在添加b 2 7 的无血清培养基( g c l 组) 与在添加a r a - c 的含低浓度血清 的培养基( g c 2 组) 中生长的情况没有明显差异，神经元胞体主要为较小的梭形细 胞，细胞核不如s g c s 明显，突起较少，但长而纤细( 图1 2 ) 。体外培养的g g c s 培养至第1 1 天时即出现神经元大量解体。培养过程中，g c l 组与g c 2 组均可见少 量非典型细胞，形态上主要有两类：( 1 ) 无明显细胞形态的扁平细胞，无明显细胞 核，地毯样平铺在其它细胞底层( 图15 a ) ；( 2 ) 三角形扁平细胞，无明显细胞核 ( 图1 5 c ) 。这些不典型细胞在g 0 2 组中更为常见。 蟹 削1 2g g c s 在无血清培养基( g e l ) 和含低浓度血清的培养基( g 0 2 ) 中的维持生长情况。g e l 组与g e 2 组无明显差异。a 培养第4 天胞体较小，呈梭形，细胞核不明显，突起长而纤细， 交织成网。b 培养第7 天，神经元细胞早束状排列，相互形成突触联系。c 培养第1 i 天，人 量神经元死亡。d 视野中偶见大而扁平的不规则形胞体细胞核偏向胞体的一侧核仁清晰可 见，胞体上突起较多( 拍摄于培养第7 天) 。 维持生长状态的s e l 组和s c 2 组s g c s 的特征与s t l 组和s t 2 组基本相同，胞 体明显大于主要为小梭形细胞的g g c s ，神经元胞体形状不规则，细胞核明显，突 起多而纤长，l 临近神经元形成突触联系。与呈束状排列的g g c s 不同，s g c s 多呈 片状聚集分布。培养至第1 1 天时部分神经元开始解体s c 2 组细胞的衰退现象比 s c l 组明显。至第1 6 天时两组神经元已大量死亡( 图1 3 ，图1 4 ) 。在图1 6 中可以 更加明显地看到s g c s 与g g c s 的区别。在s c l 组和s e 2 组除了在g g c s 培养物中 出现的无明显细胞形态的无核扁平细胞( 图1 5 a ) 外，还存在两类不典型细胞：( 1 ) 密集生长的有明显大圆形胞核的细胞，突起少或短，胞体形态极不规则( 图1 5 b ) ； ( 2 ) 呈束状或链状排列的棱形有核细胞( 图1 5 d ) 。这两类细胞在s c l 和s c 2 组分 布无明显区别，图15 a 所示的细胞在s c 2 组更为多见。 | ! i ：i 卫 cd 图1 3s o l 组s g c s 在无血清培养基中的维持生长情况。a 培养第4 天胞体增人，长山较多 突起，b 培养第7 天，胞体呈较大的不规则形状，神经元之间形成突触联系。c 培养第1 l 天 部分神经元开始衰退胞核空泡| 羊变大。d 培养第1 6 天，大量神经元死亡。 蟹 蔓 cd 图1 4s c 2 组s g c s 在无血清培养基中的维持生长情况。各时期与s c l 组无明显差异。a 培养 第4 天。b 培养第7 天。c 培养第1 l 天崩解的细胞多丁s c l 组。d 培养第1 6 凡。 坚 王 翌 卫 目1 5 培养中山现的非典型细胞。a 无明显细胞形态的扁平细胞无明显细胞核，地毯样平铺 在其它细胞底层，备组中均有山现。b 密集生长的有明显大圆形胞核的细胞，核内有多个核r ， 清晰可见，突起少或短，胞体形态极不规则，仅见丁s g c s 培养物中，c 三角形扁平细胞，无 明显细胞核，仅见tg g c s 培养物中。d 呈束状或链状捧列的棱形有核细胞。仅见于s c , c s 培 养物中， 图1 6 培养第7 天时的g g c s 与s g c s 。a g g c s ，小梭形胞体，突起少而纤长早链状聚集排 列。bs c , c s ，胞体较大，形状不规则，突起多，临近细胞呈片状聚集分布。 2 免疫荧光鉴定 根据光镜下观察的膝状神经节与s g c s 生长特性，取接种第7 天的g g c s 和 s g c s 神经元培养物进行免疫荧光染色。荧光显微镜下观察看到，特异性神经元核 蛋白阳性的细胞，胞体和突起发出绿色荧光，与光镜下确认的神经元细胞是一致的。 s g c s 的细胞核深染，胞质淡染，胞体不规则，突起较多( 图1 8 ) 。而g g c s 因细胞 核不明显，胞体呈比较均匀的绿色荧光( 图1 7 ) 。图1 5 a 中的无核扁平细胞以及图 1 5 c 中的无核三角形细胞，在荧光显微镜下无法显示，考虑可能为雪旺细胞或成纤 维细胞。图1 5 b 和图1 5 d 所示的带有明显胞核和核仁的细胞，在荧光显微镜下有典 型的利1 经细胞荧光染色，胞核染色较深，核仁更显示出明亮的绿色荧光，胞浆淡染。 在细胞群的周边可见移行的有典型s g c s 形态的染色阳性细胞。考虑这种不典型细 胞足聚集生长的s g c s 因细胞密集，所以没有伸展出明显地突起，细胞形态也不 似比较分散的s g c s ( 图1 9 ) 。 图1 7 免疫荧光鉴定培养的g g c s 。a 光镜观察结果。b 与a 同一视野的荧光显微镜下观察结 果，绿色荧光聚集在胞体，只有接近胞体的小段突起可以显色。c 光镜f 局部放大的视野。 d 与c 同一视野的荧光显微镜f 观察耋古果，细胞质为绿色荧光演然，胞核染色略深丁胞浆， 胞体近端的突起可以显色。 ( 荧光染色物质：荧光素a l c x af l u o r 0 4 8 8 标记的鼠抗n e u n 单克隆抗体，稀释比例l1 0 0 ) ，f t 、b ，t d 图l8 免疫荧光箍定培养的s g c s 。a 光镜观察结果。b 与a 同一视野的荧光显微镜下观察结 果，绿色荧光聚集在胞体，只有接近胞体的小段突起可以显色。c 光镜f 局部放大的视野。 d 与c 同一视野的荧光显微镜下观察结果，细j 胞质为绿色荧光溃然，胞核染色略深于胞浆， 细胞核显示比g g c s 清晰，胞体近端的突起可以显色。 ( 荧光染色物质：荧光索a l e x a f l u o r 0 4 8 8 标记的鼠抗n c u n 单克隆抗体，稀释比例i1 0 0 ) 嘲蠖嫠镤凄嚣 够。0 一 a 图1 9 免疫荧光鉴定培养的非典型细胞。a 光镜观察结果，照片上半部为束状聚集生k 的胞体 较小的梭形有核细胞，r 半部为胞体较人、突起少而短的有核细胞。b 与a 同一视野的荧光 显微镜下观察结果，胞核染色较深，核仁更显示出明亮的绿色荧光，胞装渍染。在细胞群的周 边可见移行的有典型s g c s 形态的染色日l 性细胞。 ( 荧光染色物质：荧光素a l e x a f l u o r 0 4 8 8 标记的鼠抗n e u n 单克隆抗体，稀秆比例i ：1 0 0 ) 蘸 讨论 1 物种及取材动物年龄的选择 在哺乳类动物中，啮齿类是最常用作神经细胞培养组织来源的物种，它们的神 经系统比较发达，与人类相似性大，也具有中枢神经系统和外周神经系统。啮齿类 中的豚鼠，不但价格低廉、体型小，而且性格温、易于操作，其颞骨结构近似于人 类的颞骨结构【1 ，2 】，是研究人类中耳疾病的良好动物模型。 与其它类型的细胞不同，成熟的神经元由于已在原位组织完成分裂和分化，因 此培养的神经元将不再进行分裂和增殖。因此，大多数用作体外培养的神经元细胞 取自胚胎或新生动物组织。关于g g c s 体外培养，目前文献中仅有大鼠胚胎或新生 大鼠膝状神经节体外培养成功的报道 4 ，5 】。 如果神经细胞的分离培养是在轴突和树突广泛分支发育之前进行，神经元细胞 就不易在分离过程中受到损伤。但是在体外培养系统中，胚胎来源的神经元细胞并 不都会发育成熟。某些类型的神经细胞在其发育早期有明显的表型可塑性，它们“正 常”成熟特性的获得高度依赖于环境条件，而这些条件在培养过程中可能难以控制 得恰到好处。从理论上来说，若要研究成熟的神经细胞特性，最好使用在分离培养 之前，已经在取材的原位组织能够表现该性质的神经细胞 1 2 】。从建立耳科疾病动 物模型的角度来说，医学科学工作者关注得更多的是出生后发病的一些疾病，因此 在成熟的神经元培养物中进行操作是比较合理的。通过较成熟动物的神经细胞培 养，可研究具有特殊神经病变动物细胞的特性。并且，从出生后动物的神经组织取 材有操作方便、节省动物等优点。 2 膝状神经节与螺旋神经节解剖 在已发表的有关豚鼠中耳解剖的文章、以及一些研究豚鼠g g c s 体外培养的文 章中，均未详细描述豚鼠膝状神经节在颞骨内的确切位置 1 ，2 ，5 ，7 】。与人类不同， 豚鼠的膝状神经节与面神经主干相比没有明显膨大。为了完整地取到膝状神经节， 本实验取材的部位是颞骨内的整段面神经主干。这样做的最大缺点是操作费时。决 定原代细胞培养质量优劣的一个重要问题就是取材后对组织进行处理并接种是否 及时。为了最大限度的保存细胞活力，建议将取下的组织在接种前低温保存。或采 取团队合作的方法，同时进行解剖与组织培养的工作。螺旋神经节的解剖相对于膝 状神经节来说则要方便得多，定位明确，容易完整取下。 3 底物 原代神经元培养常用的底物有左旋多聚赖氨酸( p l l ) 和多聚鸟氨酸、细胞外 基质成分、细胞粘附分子和单层非神经元细胞。其中以多聚赖氨酸最为常用，价格 适中且易于获得。采用经p l l 处理的培养器皿进行神经元培养时，需要采用含有血 清的培养基进行接种或直接培养，因为经过处理的器皿表面能够吸收血清中的成 分，有助于细胞的黏附和生长，并且可以降低p l l 可能对神经元细胞产生的毒性。 此外，在啮齿类神经元细胞的培养中，胶原和层粘连蛋白也是常用的底物。有 实验证明，将胶原、层粘连蛋白与p l l 联合包被培养器皿，可以促进神经元突起的 生长，有利于神经元细胞的长期存活【8 】。 有文献报道，豚鼠肠道感觉神经元细胞( e n t e r i cg a n # i o nc d l s ，e g c s ) 在用p l l ( o 1m # m l ) 和鼠尾胶原( o 0 1m # m l ) 包被的器皿中，可以稳定生长长达两个月 【9 】。本实验仅采用p l l 工作浓度范围下限的0 0 1m # m l 对培养板进行包被，g g c s 和s g c s 的