流式细胞仪原理及应用HIV.ppt

碧迪医疗器械（上海）有限公司 上海市静安嘉里中心3座10楼 李苏辉,流式细胞仪 原理及仪器维护保养,白细胞的组成,白细胞的组成及其分化抗原 白细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或消失的表面标记，这是区分白细胞的重要标志。1986年世界卫生组织命名委员会建议应用CD系列来统一命名白细胞分化抗原,SHA- LF4N 13E for Jerel,细胞毒性T淋巴细胞;分泌穿孔素、IFN、 、TNF等。特点：MHC-1类分子限制、 直接接触、反复杀伤,自然杀伤细胞（NK)：抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、淋巴因子介导细胞毒作用、,抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用,补体系统的活化（经典、凝集素、替代途径）。作用（溶胞作用、吞噬条理作用、趋化性、 炎症反应等）,中和抗原：形成免疫复合物，被吞噬细胞清除（条理作用）、毒素中和作用、感染中和作用,体液免疫和细胞免疫的作用,淋巴因子依赖的细胞毒作用,免疫应答的过程及Th细胞的作用,免疫应答： 细胞免疫 体液免疫 Th细胞作用： Th1分泌IL-2、INF等，前者可诱导 Th、Tc分裂增值； Th2分泌IL-4、 IL-5,可使B细胞活化，产生抗体 B细胞完全活化需要Th帮助,流式细胞仪原理,流式细胞术(Flow cytometry) 对于处在流动状态的细胞或生物颗粒同时进行多参数的快速的分析和定量的技术,BD公司HIV领域流式细胞仪产品,FACSCount流式细胞仪,FACSCalibur流式细胞仪,T,T,C,H,CD3,CD3,CD8,CD4,流式细胞仪检测原理及在T细胞分析中应用,Analyze,激发光源与荧光标记物,FACSCalibur流式细胞仪仪器结构,液流系统 光学系统 激光光源 光收集系统 电子系统 光电转换 数据处理系统 软件系统,液流系统-鞘液,流式细胞仪原理,光学系统,激光 (Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的光照 激光波长: 488nm, 635nm,检测信号,散射光信号 FSC: 前向角散射光 SSC: 侧向角散射光(90度散射光) 荧光信号 荧光染料 光学滤片,检测信号,前向角散射光信号,前向角散射光信号,散射光信号前向角散射光信号(FSC),FSC-Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FSC的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 FSC用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小,侧向角散射光信号,侧向角散射光信号,侧向角散射光信号(SSC),SSC-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 SSC的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 SSC用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比,流式细胞仪的检测信号：散射光,FSC，前向角散射光，代表细胞大小 SSC，侧向角散射光，代表细胞粒度,Right Angle Light Detector Cell Complexity SSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,荧光信号,每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号,光学系统,FCM的光学系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成,光路 - 滤片特性,长通滤片 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 允许一定带宽的波长通过,460 500 540,460 500 540,460 500 540,SP 500,LP 500,BP500/50,长通 短通 带通,光学滤片,荧光信号,荧光信号,光路 - 滤片特性,当以 45o 角放置长通滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 这种方式的滤片称为二向色性长通滤片( dichroic filter),光学系统,电子系统,当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时, 受激激发, 产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号, 这些信号经A/D转换成数字信号, 送计算机进行储存、 作图、 统计分析,发射波长,Wavelength (nm),400,450,500,550,600,650,700,1000,800,600,400,200,0,PE,FITC,PerCP,750,流式细胞仪原理,荧光信号,650nm,700nm,500nm,600nm,Relative Intensity,Wavelength (nm),550nm,检测器,Photomultiplier tube (PMT) 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号,单平台绝对计数,管中预先加有准确定量的Beads 流式细胞仪获取数据后，由各目标群的含量，可以计算出相对含量% 由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量 计算公式： 细胞获取数 Beads总量 细胞/L= Beads获取数 样本量 注： Beads总量见TruCOUNT管外包装 MultiSET系统中，样本量为50 L,单平台绝对计数,使用TriTEST或MultiTEST试剂，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴细胞绝对计数 TruCOUNT管中预先加有准确定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致 由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量 使用直接荧光标记抗体组合，一步处理外周血 使用免洗技术，溶血后直接上机检测标本 操作简便，省时省力，计数结果重复性好,淋巴细胞分析,使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 淋巴细胞分析 TriTEST：三色试剂CD4/CD8/CD3，CD3/CD4/CD45 MultiTEST ：四色试剂CD3/CD8/CD45/CD4 TruCOUNT：单平台绝对计数管 报告Th,Ts,Th/Ts 百分含量%与绝对含量cells/uL,TriTEST CD4/CD8/CD3,T Lymph Events CD3+CD4+ %T Lymph CD3+CD8+ %T Lymph CD3+ CD4+CD8+%T Lymph T H/S Ratio,Bead Events CD3+ Abs Cnt CD3+CD4+ Abs Cnt CD3+CD8+ Abs Cnt CD3+CD4+CD8+ Abs Cnt,淋巴细胞四色分析,Lymph Abs Cnt CD3+ % Lymph CD3+ Abs Cnt CD3+CD4+%Lymph CD3+CD4+ Abs Cnt CD3+CD8+%Lymph CD3+CD8+ Abs Cnt CD3+CD4+CD8+%Lymph CD3+CD4+CD8+ Abs Cnt T H/S Ratio,MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4,MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,FacsCalibur仪器样本操作,仪器校正：加入校正试剂内的液体必须和鞘液桶的一样。 样本操作：溶血、有凝块的血不要做 加样前，抗凝血颠倒混匀810次（避免混匀器混匀） 使用反向加样法，枪头贴壁。加样枪在试管内不要放松,FACSComp没有通过怎么办？,FSC或SSC没有通过： 原因：1.由于仪器的管路没有清洗干净 2.使用的鞘液杂质太多(换鞘液）BD公司专用鞘液 3.校准品失效 4.仪器故障 措施：1. 用蒸馏水高速运行仪器10分钟30分钟 2. 过滤鞘液 3. 使用新的校准品 4. 致电BD工程师,FacsCalibur仪器,BD原装鞘液：过滤、消毒。0.22um滤膜过滤 鞘液桶放入3升鞘液（不要放满），清除废液桶废液，装200毫升漂白剂 先开仪器再开电脑 在按Prime按钮去除流动池气泡时，上样架处在偏离位置 做好每日维护，建议每次关机时做FacsClean和FacsRinse清洗。 （1） FacsClean，Run Hi 支架旁位2分钟；支架正位3分钟 （2） FacsRinse，步骤同上 （3）蒸馏水， Run Hi2分钟旁位，5分钟正位（4）去除鞘液压力（5）选择Standby模式10分钟后关机 月维护中鞘液桶装入FacsClean (0.51的漂白剂)，旁路鞘液过滤器。 每3个月6个月清洗空气过滤网（用水冲洗再晾干）。过滤器6个月更换,FACSCount,仪器性能,样本稳定性 制备后室温(2025 0C)储存48小时 全血稳定性 采集后室温(2025 0C )储存48小时,FacsCount样本处理,FacsCount质控：正常血，样本用前颠倒混匀（避免 混匀器上混匀）。反向加样法，枪头贴管壁,分离最后一滴。 试剂在开盖前可以在混匀器上颠倒混匀 每次更换枪头，样本多时，每次更换试剂对管管盖 加入固定液后30分钟以后再操作更安全,FacsCount仪器,用水冲洗开盖器，用轻柔的去污剂或70酒精清洗电子 加样枪,用1：10的漂白剂清洗Workstation 避免在废液桶里装高浓度的漂白剂 每次试验结束后废液桶必须清空,然后用自来水冲洗.建议关机后取出废液桶,下次实验时再放置在仪器里 电子加样枪不用时需从支架上取下. 软盘复制（已做过质控的软盘作为母盘） 连续做15个标本需要做清洗，如果试验中间中断1小时 以上，需要清洗；将装有蒸馏水的上样管置于上样针位置， 保持上样针湿润，防治结晶；关机。 如果长时间不做试验，建议每周用蒸馏水清洗,FacsCount仪器,FacsCount的每日维护； 1.运行CLEAN程序， 2.上样管放置稀释的FacsClean（稀释10倍次氯酸钠） 3分钟 3.再放置装有FacsRinse（Tween 稀释10倍1/00%)上样管清洗3分钟 4.重新执行CLEAN程序，FacsRinse （Tween 稀释10倍1/00%)再洗3分钟 5.放置装有蒸馏水的上样管清洗3分钟 6.试验结束后，放置装有蒸馏水的上样管浸泡上样针，避免管道结晶 6.仪器无用时建议取出废液桶,FacsCount仪器,FacsCount的长冲洗； 1.短路过滤器,并在鞘液桶内和试管中放置稀释5倍的次氯酸钠 2.运行CLEAN程序(二个循环)后进入UTILITY程序，按“Shutdown”键，使上样针浸泡在装有次氯酸钠的试管中，将仪器电源关掉，让仪器管道浸泡30分钟 2.倒掉鞘液桶内的次氯酸钠，将鞘液桶洗干净，换上干净的（蒸馏水或纯净水