课件：第五章细菌和病毒的遗传分析.ppt

第五章 细菌与噬菌体的遗传,2019,-,1,第一节 细菌与噬菌体的突变型,2019,-,2,一、细菌突变型及突变型的筛选 （一）合成代谢功能的突变型 （anabolic functional mutants) 营养缺陷型 （二）分解代谢功能的突变型 （catabolic functional mutants) （三）抗性突变型（resistant mutants) 抗性(resistant) 敏感(sensitive),2019,-,3,2019,-,4,2019,-,5,例如：Lac-的选择 伊红美蓝培养基（EMB培养基） Lac+ 可以发酵乳糖，菌落为有金属光泽的紫色； Lac- 不能发酵乳糖，菌落为白色,2019,-,6,印记法（replica_plated method),完全培养基,基本培养基,生长后影印,选择培养基,2019,-,7,二、噬菌体的突变型： 1.寄主范围突变型 2.快速融菌突变型 3.条件致死突变型,2019,-,8,无义突变与无义抑制基因 无义突变：原来正常的密码子突变成为终止密码子，从而使多肽链变短，失去活性。 可分为：琥珀型（amber）UAG 赭石型（ocher）UAA 乳石型（opal） UGA 无义抑制基因：在终止密码处可以插入一个特定的氨基酸，防止在终止密码位置上提前终止多肽链的合成。,2019,-,9,第二节 细菌的遗传与做图,2019,-,10,一、细菌的细胞及细菌的染色体 细胞膜、细胞壁：一层或多层 染色体：12条（一定部位与细胞膜相连） 无核膜包裹，称为拟核（nucleoid)DNA双链分子形成闭合的环状结构； 长度：25035000um裸露，不与蛋白质结合，易于DNA 的重组，但有RNA结合，有利于DNA分子的折叠和螺旋。,2019,-,11,二、大肠杆菌的有性生殖 1946年，发现不同品系的大肠杆菌可以进行杂交，从而首次发现了大肠杆菌的性别。 A品系：met- bio- B品系：thr- leu thi ,2019,-,12,2019,-,13,实验结果分析： 1.基因突变； 2.营养物质互补或转化； 3.遗传物质重新组合；,2019,-,14,U型管实验：,2019,-,15,2019,-,16,正反交实验： A strs B strr A strr B strs,A为供体，相当于雄性； B为受体，相当于 雌性。 遗传物质,鉴别培养基含有str,2019,-,17,细菌中的接合,2019,-,18,F因子与高频重组品系： F因子（F factor or F element) 性因子（sex factor) 致育因子（fertility factor) F因子是一种环状的DNA分子，具有赋予中性细菌以性别的性质。 F因子相对分子量为3.5106,全长约为6 104个bp，约为大肠杆菌环状染色体全长的2%。,2019,-,19,F,质粒的转移,2019,-,20,F,质粒的转移,2019,-,21,附加体（episome): 将既可以存在于染色体之外作为一个独立的复制子，也可以整合到细菌染色体中作为细菌复制子的一部分的遗传因子称为附加体。,2019,-,22,E.coliF因子存在状态有三种类型： 没有F因子，即F 游离状态的F因子，即F+ 整合的F因子，即Hfr,2019,-,23,低频重组（low frequency recombination,Lfr)： 重组率约为百万分之一； 高频重组（high frequency recombination,Hfr） 重组频率可达10-2,2019,-,24,2019,-,25,细菌重组的特点： 1.异宗配合； 2.DNA传递是单方向的； 3.所传递的基因都是连锁在一起的； 4.偶数次交换有效，奇数次交换无效； 5.只产生一种重组子。,2019,-,26,三、中断杂交与重组做图 中断杂交实验（interrupted mating experiment） 把接合中的细菌在不同时间取样，并把样品猛烈搅拌以中断细菌的接合过程，以此来研究细菌接合过程中基因转移方式，分析受体细菌基因型的实验方法。,2019,-,27,2019,-,28,图717 中断杂交后，重组体中Hfr遗传性状出现的频率,2019,-,29,例如：中断杂交实验结果 基因 转入时间（min） 频率 Thr+ 8.0 100(选择标记） Leu+ 8.5 100(选择标记） Azi+ 9 90 Ton+ 11 70 Lac+ 18 40 Gal+ 25 25,2019,-,30,E.coli 的连锁群,5 10 15 20 25,o azi ton lac gal,2019,-,31,2019,-,32,2019,-,33,例：现有5个Hfr品系的DNA转移到F细菌中去的基因顺序如下： Hfr品系 转移顺序 BKARM DLQEOC 3 OEQLDN MCOEQLDN RAKBN 请画出基因转移顺序及各品系转移方向。,2019,-,34,大肠杆菌的Hfr菌株与营养缺陷型的F-菌株杂交，利用中断杂交实验得到以下实验结果： 供体的基因不同的Hfr品系及进入的时间（分钟） （1）试用上述结果建立一个大肠杆菌的染色体图（以分钟表示距离）。 （2）在图上标出菌株中F因子插入的位置和方向。,2019,-,35,重组做图（recombination mapping) 以基因间重组率进行基因定位。 例：根据中断杂交实验已知lac、ade是紧密连锁的，杂交 Hfr lac+ ade+Flacade是lac+ 先进入受体，而ade+后进入。 重组率（RF）=,lac ade+,(lac ade+ )+(lac+ ade+),2019,-,36,重组率时间=20 1min等于20个图距单位（m.u.）,2019,-,37,2019,-,38,四、F因子与性导 F因子（ Ffactor）： 带有细菌基因的环状F因子。 性导（sexduction或Fduction）： 利用F因子将供体细胞的基因导入受体，形成部分二倍体的过程叫性导。,2019,-,39,2019,-,40,五、转化与转导作图 转化（transformation): 游离的外源DNA片段进入到受体细菌细胞内，使受体细菌细胞的遗传物质与外源DNA发生重组，产生各种类型重组子的过程。 转化子（transformant）： 细菌细胞经过转化所形成的各种重组子。,2019,-,41,在一般情况下，大约只有1%的受体细胞可吸收外源DNA，并发生遗传转化。转化频率低的主要原因在于： 1.DNA只有在受体细胞细胞壁的特殊受体部位才能进入受体细胞； 2.外源DNA进入受体细胞需要有酶或蛋白质分子以及能量等因素的协同作用。 外源DNA只有在酶促旺盛的受体部位才能进入受体细胞。,2019,-,42,转化过程： 1.双链DNA分子与细胞表面受体部位进行可逆性结合； 2.供体DNA进入受体细胞，并可防止受DNA酶的破坏； 3.供体DNA解链成为单链结构，其中一条被降解； 4.未被降解的DNA单链与受体细胞进行同源重组； 5.形成各种重组子。,2019,-,43,2019,-,44,进行转化作图应首先确定同时进行转化的基因是否具有连锁关系，依据在于：在较低的浓度范围内，转化频率与转化DNA的浓度呈正比。 1.如果A与B是连锁的，当DNA浓度下降时，A、B同时转化频率下降和A或B转化频率下降程度相同； 2.如果A、B不连锁，当DNA浓度下降时，则AB转化频率下降远远超过A或B转化频率下降的程度。,2019,-,45,感受态细胞（competence）： 能接受外源DNA分子并被转化的细菌细胞被称为感受态细胞（competence）。 感受态因子（competence）： 促进转化作用的酶或蛋白质分子被称为感受态因子（competence）。,2019,-,46,以枯草杆菌进行实验， 供体基因型： trp2+ his2+ tyr1 + 受体基因型： trp2- his2- tyr1- 实验结果： 座位 转化体类别 trp2 + - - - + + + his2 + + - + - - + tyr 1 + + + - - + - 11940 3660 685 418 2600 107 1180,2019,-,47,解题思路： 1.首先确定三基因是否连锁； 2.如果连锁，三基因位置关系如何； 3.确定重组类型，计算重组值。,2019,-,48,转导（transduction）： 以噬菌体为载体把遗传信息从一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞，并实现遗传物质的重新组合的过程被称为转导。 普遍性转导： 在转导过程中，细菌细胞 内的遗传物质有同等机会转移到受体细菌细胞内的情况叫普遍性转导。,2019,-,49,Lederberg和Zinder（1951)首先在鼠伤寒沙门氏菌中发现转导现象 phetrptryr methis 在基本培养基上发现原养型的菌落 可能性：（1）接合 （2）转化 （3） ？,2019,-,50,U型管试验 将上述两种菌株分别放在戴维斯U型管 的两臂内，中间用玻璃滤板隔开，以 防止细胞直接接触，但允许比细菌小 的物质通过，获得了野生型重组体， 说明不是接合 这种重组是通过一种过滤性因子(FA) 而实现的。FA不受DNA酶的影响，说明 不是转化 进一步研究证明，FA是一种噬菌体， 称为P22（用抗P22血清处理后失活）,2019,-,51,2019,-,52,2019,-,53,共转导（cotransduction ）： 两个或两个以上基因同时转导的现象被称为共转导 。 例如:以基因型为ABC的细菌转导基因型为abc的细菌细胞，转导完毕后，将受体细胞转移到不含A的培养基上，只有具有A基因的受体细胞可以生存，然后再将这些菌落分别接种到不含B、C的培养基中，测得A与B和A与C的共转导频率，以得到三基因的顺序关系：,2019,-,54,如果转导子类型中以AbC最少，则基因顺序为：abc; 如果转导子类型中以ABc最少,则基因顺序为：acb或bca。 可以用,单基因转导型,所有转导型,表示二基因的连锁程度。,2019,-,55,一个非溶源性菌株带a+和b+基因受到噬菌体的感染，然后用新的噬茵体感染一带ab基因的溶源性细菌菌株，实验结果如下：8ab+和7a+b，585a+b+，问a和b连锁吗?如果连锁，计算a和b的连锁强度。,2019,-,56,本实验是一个共转导实验，在转导子中，a+b+的共转导频率=585/(585+8+7)100%=97.5% 由于共转导频率非常高，所以a与b基因为连锁基因。 利用普遍性转导进行两点或三点转导实验作图，需筛选出一个供体标记的转导子，即通过转导而能表达外基因子的受体细胞，再分析其他供体标记的存在状况。如从一供体为a+ b+ 转导给a b 受体，转导会产生a+ b、a b+ 和a+ b+ 转导子，若选择a+ 转导子作为供体标记， 则a b间重组率为： RFab = (a+ b)(a+ b) + (a+ b+ ) 100 % ； 若选择b+ 转导子作为供体标记，则a b间重组率为： RFab = (a b+ )(a b+ ) + (a+ b+ ) 100 %。 所以，如果选择a+ 转导子作为供体标记，则此时a b间重组率为：1.18%；若选择b+ 转导子作为供体标记，则a b间重组率为：1.34%。,2019,-,57,2019,-,58,2019,-,59,实验1 说明leu和azi相近 leu和thr则远 leu azi thr azi leu thr 或 实验2 说明leu比azi更接近thr azi leu thr 实验3 说明这个顺序是正确的，因为leu+thr+片段从未携带有aziR 这也说明了转导片段的大小。在 thr和leu之间的DNA长度已接近于 这个片段大小的极限,2019,-,60,E.Singer, J.Beckwith, S.Brenner用大肠杆菌trpA+ supC+ pyrF+供体细胞和trpA- supC- pyrF-受体细胞进行三因子转导杂交实验其结果如下： 1 C+ A+ F+ 36 2 C+ A+ F- 114 3 C+ A- F+ 0 4 C+ A- F- 453 C-A并发转导率=（36+114）/603=0.25 A-F并发转导率=36/603=0.06,C A F,2019,-,61,d=L(1-,),d:同一染色体上两基因之间的距离； L：转导DNA的平均长度； X：两个基因共转导的频率。,2019,-,62,噬菌体 染色体长度/um 碱基对/bp T2，T4 54.0 162000 T5 39.0 117000 P22 13.7 51900 T7 12.5 37500,2019,-,63,(二）局限性转导（restricted transduction) 专一性转导（specialized transduction) 噬菌体只把细菌基因组中特定部分基因整合到自己的DNA中，并转移给受体细菌的过程。 局限性转导必须以温和型噬菌体为媒介，并大多在溶源性细菌品系之间进行。,2019,-,64,2019,-,65,2019,-,66,2019,-,67,普遍性转导 局限性转导 1.噬菌体的遗传物质不直 噬菌体的遗传物质直 接参与转导过程 接参与转导过程 2.细菌可为溶源性细菌 细菌为溶源性细菌 和非溶源性细菌 3.转导基因具有随机性 转导基因为紧邻细菌附 着位点两边的基因,2019,-,68,应用中断 杂交技术 、重组作 图、转化 和转导相 结合的方 法已经得 到细菌的 非常详细 的染色体 图,2019,-,69,1963年E.Coli遗传图。图距单位是分钟,2019,-,70,总结： 大肠杆菌遗传物质传递的方式有： 无丝均等分裂 接合生殖（在部分二倍体中进行遗传物质重组） 转化 转导 性导,2019,-,71,2019,-,72,第三节 噬菌体的遗传与做图,A virus is a simple replicating structure made up nucleic acid (linear or circular) surrounded by a protein coat. Double stranded DNA virus, Single stranded DNA virus, Double stranded RNA virus, Single stranded RNA virus.,2019,-,73,一、噬菌体的基因重组,2019,-,74,野生型 r+(小噬菌斑） h+(只侵染B菌株） 突变型 r（大噬菌斑） h可侵染B及B/2 h r+ h+ r h r+ h+ r h r h+ r+ （ h r+h+ r+）,重组值=,h r+ +h+ r+h r + h+ r+,2019,-,75,杂交 每一基因型的% 重组值 h+ r+ h+ r- h- r+ h- r- ra h h+ r 12.0 34.0 42.0 12.0 24% rb h h+ r 5.9 32 56 6.4 12.3% rch h+ r 0.7 39 59 0.9 1.6%,ra rb rc h,ra rb h rc,ra h rc rb,ra rc h rb,2019,-,76,二、T4噬菌体突变型的三点测验： 小噬菌斑（m） 快速溶菌（r） 混浊溶菌（tu） m r tu 3467 69.6% + + + 3729 m + + 520 9.6% + r tu 474 m r + 853 17.6% + + tu 963 m + tu 162 3.2% + r + 172 合计 10340,2019,-,77,m r tu,12.8 20.8,27.2+23.2,2019,-,78,三、 X174突变型三点测交： 亲本：amA tsC + + + amB,2019,-,79,两点和三点测交结果显示： 每个基因都与它两侧的基因连锁 由此证明：基因组为一环状分子。,2019,-,80,噬菌体杂交的特点： 1.噬菌体在杂交中，每个亲代对子代所提供的遗传贡献取决于感染细菌时每种亲代噬菌体的相对数量； 2.噬菌体的基因重组是发生在噬菌体DNA的复制之后，在一个细菌细胞中已经是亲本基因组的群体； 3.噬菌体不同基因型之间可以发生多次交换； 4.噬菌体的基因重组频率可以随着宿主细胞裂解时间的延长而增加。,2019,-,81,噬菌体基因重组杂交时应注意问题： 1.控制每种亲代噬菌体基因型的投放量； 2.控制许可发生复制和重组的时间。,2019,-,82,四、拟等位基因（pseudollele) 紧密连锁的功能性等位基因，但不是结构性的等位基因。 顺反位置效应（cis-trans position effects): 由于排列方式不同而表型不同的现象被称为顺反位置效应。,a,2019,-,83,拟等位基因的发现证明了：基因的可分性 基因的可分性： 即基因内有大量的突变子和重组子。,2019,-,84,五、Benzer的重组实验(recombination test) S.Benzer利用T4噬菌体的两个突变体的基因结构分析证明了基因的可分性。 S.Benzer所用T4的r突变是遗传研究中所用的第一个条件致死突变型。 其作用为使所侵染细胞迅速裂解形成大的噬菌斑。,2019,-,85,T4野生型和几种突变型的区别,2019,-,86,实验材料： 大肠杆菌T4的 r47、r104基因 大肠杆菌B菌株 实验方法： r47、r104 大肠杆菌B菌株 菌液A 、B,2019,-,87,A 大肠杆菌B r47 + + r104 r47 r104 + + 计数: n,2019,-,88,B 大肠杆菌K(入) + + 计数 :m,2019,-,89,重组频率=,2（r + 噬菌斑） 噬菌斑总数,100,=,2m,n,100,2019,-,90,实验结论：recombination test可以遗传图的方式确定突变子之间的空间关系。 灵敏度：10-6 实际最小重组频率为0.02% 实际最低图距：0.02,2019,-,91,由于T4染色体有1.8 105核苷酸对，其长度为1500个图距，因此0.02个图距单位约等于2个核苷酸对，因此可以认为基因相邻核苷酸位置上的碱基突变是可以重组的。 当有些r突变不能发生重组时，可以认为是同一核苷酸对的不同改变。,2019,-,92,六、互补测验（complementation test): 研究确定突变功能关系的实验方法。 如果一个突变型可以补偿另一个突变型所不具有的功能，这两个突变型 就称为彼此互补；如果两个突变型不能互补，说明两突变型一定有一个相同功能受到损伤。 常用方法：斑点测试法（spot test),2019,-,93,通过条件致死突变型的互补测验，可以确定许多不同来源的条件致死突变型影响的是否为相同的遗传功能 在致死条件下，如果双重感染细菌的“二倍体”细胞产生子代噬菌体，表明： 这两种突变彼此互补，并分属于不同的顺反子； 在致死条件下，如果双重感染细菌的“二倍体”细胞不能产生子代噬菌体，表明： 这两种突变彼此不能互补，所以属于同一顺反子。,2019,-,94,例：T4突变型的互补实验 利用条件致死突变型，可以研究这些条件致死突变基因在基因组中的线性顺序； 研究这些基因在发育过程中的功能； 利用互补实验，可以确定它们属于哪一特定的顺反子。,2019,-,95,2019,-,96,实验表明： T4颗粒的装配是循着严格规定的形态发生途径进行的。所以，控制形态发生，编码结构蛋白的晚期基因的表现完全依赖于控制DNA复制等的早期基因正常功能的行使。,2019,-,97,突变噬菌体之间的互补作用检测,2019,-,98,结论说明： 在互补测试中，如果两个隐性突变表现出互补效应，则证明这两个突变型分别属于不同的基因； 如果两个隐性突变不表现出互补效应，则证明这两个突变型属于同一个基因。,2019,-,99,顺反子（cistron）： 不同突变之间没有互补的功能区的一个区段称为顺反子。即功能水平上的基因。,2019,-,100,基因内互补（intragenic complementation） 同一基因内两个不同位点突变使两条原来相同的多肽链转变成两条分别在不同位点上发生变异的多肽链，而后这两条多肽构成双重杂合子，表现出不同的恢复酶活性部位，这种现象称为基因内互补。,2019,-,101,2019,-,102,2019,-,103,2019,-,104,第四节 缺失作图,2019,-,105,点突变（point mution）:由于核苷酸对发生改变所造成的突变称为点突变。 缺失突变（deletion mution）:由于缺失了许多相邻的核苷酸对所造成的突变称为缺失突变。,2019,-,106,点突变 单个位点的突变； 可以发生回复突变； 点突变与点突变之间可发生重组。,缺失突变 多个位点的突变； 不可发生回复突变； 同另一基因组内缺失区的点突变之间不可能重组。,2019,-,107,缺失作图（deletion mapping)的原理： 缺失突变同另一基因组内缺失区的点突变之间不可能重组。 反之，缺失突变如不能与一待测点突变发生重组，则说明该突变与点突变位于同一区域；如缺失突变如可以与一待测点突变发生重组，则说明该突变与点突变不位于同一区域。,2019,-,108,缺失作图方法： 0.5ml大肠杆菌B菌株