生物化学-蛋白质3.ppt

第五节 蛋白质的理化性质,一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质 三、蛋白质的沉淀反应 四、蛋白质的变性和复性 五、蛋白质的颜色反应,一、蛋白质的酸碱性质,C,O,O,Pr,H,3,N,+,C,O,O,Pr,H,2,N,pH pI,pH = pI,pH pI,由于蛋白质是由氨基酸组成，氨基酸所具有的两性游离性质，蛋白质也同样具有。,一、蛋白质的酸碱性质,当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正离子和负离子的趋势相等，为兼性离子，即总净电荷为零，此时在电场中，蛋白质分子既不向阳极移动，也不向阴极移动，这个pH值称为蛋白质的等电点，用pI来表示。,二、蛋白质的胶体性质,分散相质点小于1 nm时称为真溶液，分散相质点大于100 nm时称为悬浊液，而分散相质点在1100 nm之间时称为胶体溶液。 蛋白质在水溶液中的颗粒约为1100 nm，所以蛋白质溶液属于胶体系统，是一种亲水胶体，蛋白质分子颗粒是分散相，水是分散介质。 蛋白质溶液也具有布朗运动、丁达尔效应以及不能透过半透膜等性质。,二、蛋白质的胶体性质,利用蛋白质不能透过半透膜的性质，常将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋中，置于流水中逐渐将小分子杂质除去，起到纯化的目的，这种方法即为透析。 利用蛋白质不能透过半透膜的性质发展了的另一蛋白质纯化方法超滤。,二、蛋白质的胶体性质,形成水化层 形成双电层,为什么蛋白质具有胶体性质,三、蛋白质的沉淀反应,1盐析和盐溶法 2有机溶剂沉淀法 3重金属盐沉淀法 4生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 5加热凝固,1盐析和盐溶法,等电点时，无电荷间的相互作用，聚合沉淀；加入少量盐离子后破坏了这种作用，使分子分散，溶于水中,1盐析和盐溶法,盐溶：少量的中性盐，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。 原理：蛋白质吸附某种盐离子双电层蛋白质彼此排斥。 蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，因而溶解度提高。,1盐析和盐溶法,盐析,蛋白质分子表面聚集了许多水分子，当盐浓度高时，水分子被盐抽出，蛋白质的疏水区域暴露并相互结合，沉淀。,1盐析和盐溶法,盐析：向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层，同时中和了蛋白质的电荷，降低了蛋白质的溶解度，从而使蛋白质沉淀。 常用：以硫酸铵（中性盐）最常应用。因其溶解度大，且不易伤害蛋白质，另外还有硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等。,2有机溶剂沉淀法,可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。如酒精的消毒作用。 在低温条件下，变性进行较缓慢，可以用来制备蛋白质。其优点在于：不像盐析那样存在有大量盐类，必须经透析除去，而且有机溶剂很易通过稀释透析及蒸发等方法除去。,3重金属盐沉淀法,pH稍大于等电点为宜，因为此时蛋白质带负电，易与金属离子结合成盐。 通常这种沉淀为变性的，如控制温度（低温）并控制重金属离子浓度，则可用于分离制备不变性的蛋白质。,4生物碱试剂以及某些酸 类沉淀蛋白质,某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、鞣酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、水杨磺酸、硝酸等）与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。 沉淀条件应当是pH小于等于电点，这样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。,5加热凝固,将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热可使蛋白质发生凝固而沉下。 鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都变成固体样的东西了。,四、蛋白质的变性和复性,1蛋白质变性的概念 2蛋白质变性的诱因与结果 3蛋白质变性的机理 4蛋白质的复性,1蛋白质变性的概念,蛋白质变性是指通过某些物理或化学因素的作用，使蛋白质天然的空间构象破坏，从而引起蛋白质若干理化和生物学性质的改变。 蛋白质变性作用的实质是维持蛋白质分子高级结构的次级键和二硫键被破坏，引起天然构象解体，但维持主链的共价键肽键并未被打断，即一级结构保持完好。,1蛋白质变性的概念,2蛋白质变性的诱因与结果,能使蛋白质变性的因素很多，可分为化学因素和物理因素两大类。 化学因素有强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、三氯醋酸、磷钨酸、苦味酸、浓乙醇等。 物理因素有加热（70100）、剧烈振荡或搅拌、紫外线及X射线照射、超声波等。,2蛋白质变性的诱因与结果,蛋白质变性后，常常会有如下表现: 生物学活性丧失; 某些侧链基团暴露出来; 生物化学性质的改变; 一些理化性质改变;,3蛋白质的复性,复性:某些变性蛋白质，再除去变性因素后，可以“复性” 。,蛋白质的复性是一个十分复杂的过程，除了要去除变性因素，多数蛋白还需要一些其他因素的协助来恢复蛋白质的正确折叠。在复性过程中，不同的蛋白质充分体现出自身的特性，没有可以通用的方法。,五、蛋白质的颜色反应,蛋白质的颜色反应是指利用蛋白质的结构或利用肽键、以及酚基等特殊氨基酸残基的特性，使其与一些试剂发生反应而生成有色物质。 蛋白质由氨基酸组成，氨基酸的一些颜色反应蛋白质往往也都具有。 氨基酸所没有的一些颜色反应，主要是双缩脲反应，是蛋白质常用的定量分析方法。,五、蛋白质的颜色反应,原理:蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色混合物。 应用:可以用此反应来定性测定蛋白质；也可在540nm处比色，定量测定蛋白质。,五、蛋白质的颜色反应,2H2NC NH2,H2NCNCNH2NH3,1320C,O,O,H,O,尿素,双缩脲,双缩脲,CuSO4+NaOH,紫红色物质,第五节 蛋白质的理化性质,蛋白质 性质,含量测定,第六节 氨基酸及蛋白质的分析和分离,一、氨基酸的分析分离 二、蛋白质的分离和纯化 三、蛋白质的定量检测 四、蛋白质的纯度分析,一、氨基酸的分析分离,1层析法的基本原理 2常用的氨基酸层析方法,类型：分配层析法(包括柱层析、纸层析和薄层层析)。 基本原理：所有的层析系统通常都为两个相组成。一个为固定相的或静相；一个为流动相或动相。,1层析法的基本原理,利用层析法分离混合物，例如氨基酸混合物，其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异，哪怕是很小的差异，一般差异越大，越容易分开。,1层析法的基本原理,2常用的氨基酸层析方法,（1）纸层析 （2）薄层层析 （3）离子交换层析 （4）高效（高压）液相色谱,（1）纸层析,纸层析是利用混合物各组分在流动相和固定相两种不同溶剂中分配系数的差异，将它们分离开。 纸层析以滤纸为隋性支持物，滤纸纤维和水有较强的亲和力，在一般条件下较难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱，所以纸层析的固定相是被滤纸纤维吸附的结合水。纸层析以有机溶剂为流动相，也称为层析液，在毛细拉力的作用下，层析液能不断由下向上流动。,（1）纸层析,层析时，混合氨基酸在水和有机相之间不断进行分配，使它们分布在滤纸的不同位置，从而使物质得到分离和提纯。 最后用茚三酮显色。,（1）纸层析,氨基酸的混合物点在滤纸的一个角上，把这个点称为原点。 氨基酸在滤纸上移动的速度称为比移值或迁移率，以符号Rf代表。Rf也就是原点到层析斑点（即原色点）中心的距离(DA)与原点到溶剂前沿的距离（Ds）的比值。 RfDA/ DS,（2）薄层层析,薄层层析的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附性能、溶解性能（即分配）或者其它亲和作用性能的差异，使混合物溶液中的各种物质，进行反复的吸附或者分配等作用，从而将各种组分分开。 根据分离的原理不同，薄层层析可以分为吸附薄层层析和分配薄层层析两类。,（2）薄层层析,（3）离子交换层析,离子交换层析是一种用离子交换剂作为支持剂的层析方法。 分离原理是在一定离子强度和pH等条件下，由于样品中目标纯化分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附与解吸能力不同，达到分离纯化目标分子的目的。 一般需经过加样、吸附、洗涤、洗脱和凝胶再生几个环节。,（3）离子交换层析,（3）离子交换层析,常用于氨基酸分离的离子交换剂是树脂。带有正电荷的树脂称之为阴离子交换树脂。 而带有负电荷的称之为阳离子树脂。它们分别和不同带电性质的离子基团发生离子交换。,（ 4）高效（高压）液相色谱,液相色谱法是以液体为载体，将样品带入色谱仪进行分析的方法。 高效液相色谱（HPLC）采用了高压泵、高效分离柱、高灵敏度检测器等，使分离效能、分析速度、检测灵敏度比经典液相色谱有了很大的提高。 HPLC适用于分析分离不易挥发的极性物质。,（ 4）高效（高压）液相色谱,高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成。,（ 4）高效（高压）液相色谱,氨基酸的高效液相色谱图,二、蛋白质的分离和纯化,1蛋白质分离纯化的一般步骤 2蛋白质分离纯化的常用方法,1蛋白质分离纯化的一般步骤,（1）材料的预处理及细胞破碎 （2）蛋白质的抽提 （3）蛋白质粗制品的获得 （4）样品的进一步分离纯化,（1）材料的预处理及细胞破碎,预处理的主要目的是去除原材料中的部分可溶性杂质，分离含有蛋白的细胞。 分离提纯某一种蛋白质时，首先要采用适当的方法将组织和细胞破碎。 常用的破碎方法有：机械破碎法、渗透破碎法、反复冻融法（对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法）、超声波法和酶法等。机械破碎法是最常用的细胞破碎方法 。,（1）材料的预处理及细胞破碎,选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来，首先获得蛋白质粗制品。 方便有效的方法是根据蛋白质溶解度的差异进行分离。 常用下列几种方法：等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法。,（2）蛋白质的抽提,选择适当的缓冲液把蛋白质提取出来，即为蛋白质的抽提。 抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备蛋白质的性质而定。 在抽提过程中，应注意选择合适的温度条件，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。,（3）蛋白质粗制品的获得,常用的方法有：层析法（凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等）；电泳法和超离心法等。 有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品 。,2蛋白质分离纯化的常用方法,（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法 （2）利用溶解度差别的纯化方法 （3）根据电荷不同的纯化方法 （4）利用选择性吸附的纯化方法 （5）利用对配体的特异亲和力的纯化方法,（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法,透析法 超滤法 离心法 凝胶过滤法,（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法,血液透析,小分子被带出,透析机,透析液,血液,加压,透析,透析法是利用蛋白质的分子比较大，不能透过半透膜的特点，实现蛋白质与小分子物质分离的方法。,（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法,超滤,利用一定的压力使样品通过半透膜，这时，小分子和水组成的溶质可以被滤过，而大分子的蛋白质则留在膜内，这种方法称为超滤法，亦称微滤法。,（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法,离心分离是利用离心惯性力的作用分离非均相混合物的方法。 由于悬浮液中颗粒的沉降速率不仅取决于颗粒本身的性质，而且也取决于悬浮颗粒介质以及作用在颗粒上的力，因此常采用密度梯度离心法对蛋白质进行分离。 密度梯度离心法是在离心管中通过某种介质来提供一个密度梯度环境，然后加入待分离的物质，通过离心的方法达到分离的目的。,离心法,蔗糖浓度,4,8,12,16,20,塑料离心管,滴加样品,蛋白质的位置决定于它的大小，密度。,（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法,离心法,（1）根据蛋白质分子大小不同的纯化方法,凝胶过滤层析也称为分子筛层析，可以对含有不同大小分子的混合物进行分离。 凝胶过滤层析是通过一定的载体来实现的，载体的孔径不同，分离的分子大小范围也不相同。 分离过程是基于蛋白质在自由流动溶剂和存在于多孔凝胶中的固定溶剂间的分配。,凝胶过滤法,（3）根据电荷不同的纯化方法,A 装好的凝胶过滤层析柱； B 蛋白质混合物上样； C 不同大小的蛋白质分子通过层析柱； D 蛋白出峰图；,凝胶过滤法,利用凝胶过滤层析，除了可以进行混合物的分离外，还能测定样品的相对分子质量。,（2）利用溶解度差别的纯化方法,溶液的pH会影响蛋白质的溶解度。 溶液中的盐离子浓度也会影响蛋白质的溶解度。 溶剂的极性同样会影响蛋白质的溶解度。,（2）利用溶解度差别的纯化方法,当溶液的pH与蛋白质的等电点相同时，蛋白质分子呈现电中性，分子间无斥力，分子易于积聚和沉淀，此时蛋白质的溶解度是最小的，这种使蛋白质沉淀的方法称为等电点沉淀。 不同蛋白质具有不同的等电点，利用这一特性，可以通过改变溶液的pH，使要分离的蛋白质沉降出来，这些蛋白质仍然能够保持天然的生物学活性，该方法可以应用于蛋白质的粗分离。,（2）利用溶解度差别的纯化方法,盐溶现象。 盐析现象。,（2）利用溶解度差别的纯化方法,与水混溶的有机溶剂能减少水和蛋白质间的作用力，使蛋白质脱水。 有机溶剂的加入能降低溶液的介电常数，使蛋白质分子间的作用力增强，蛋白质分子易于聚集沉淀。,（3）根据电荷不同的纯化方法,电泳 离子交换层析,电泳,电泳是溶液中带电粒子（离子）在电场中移动的现象。利用带电粒子在电场中移动速度不同而使目标分子分离的技术称为电泳技术。 在一定的pH溶液中，蛋白质的迁移方向取决于它们带电的性质和数量，同时也受蛋白质形状的影响。 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以完全依据蛋白质的相对分子质量，来对蛋白质进行分离。 蛋白质电泳通常使用的支持物是聚丙烯酰胺凝胶。,电泳,SDS-PAGE电泳示意图,电泳,等电聚焦在等电聚焦时，蛋白质分子是在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中进行电泳。 不同等电点的蛋白质分子在等电聚焦电泳结束后，会分别聚集于其等电点的位置，这样不同的蛋白质分子就得以分离。,离子交换层析,是用离子交换树脂作支持剂的一种层析法。离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯酸等不溶性高分子化合物。,离子交换层析,R,CH,COOH,NH3+,+M1A+,R,CH,COOH,NH3M1,+A+,氨基酸（在酸性溶液中）,阳离子交换剂,氨基酸盐,R,CH,COO,NH2,+M2B ,R,CH,COO M2,NH2,+ B ,氨基酸（在碱性溶液中）,阴离子交换剂,氨基酸盐,M1为酸性基团，M2为碱性基团,（4）利用选择性吸附的纯化方法,吸附层析是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同，达到使它们分离的目的。 硅胶、氧化铝、活性炭等物质为固体吸附剂，能够将其它分子吸附在表面。 吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和蛋白质的性质三个因素。,（5）利用对配体的特异亲和力的纯化方法,原理：利用蛋白质分子能与其相对应的配体进行特异的、非共价的、可逆的结合来分离纯化，即亲和层析法。 配体：指能与某些蛋白质进行特异结合的化合物，如配体的作用物及抑制剂、激素和受体、抗原和抗体、酶及底物等。,（5）利用对配体的特异亲和力的纯化方法,亲和色谱颗粒,三、蛋白质的定量检测,1凯氏定氮法 2紫外-分光光度计法 3双缩脲法（Biuret法） 4Folin-酚试剂法（Lowry法） 5考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法） 6BCA法,1凯氏定氮法,原理：氮在蛋白质分子中含量恒定（平均占16%），因此测出样品中氮的含量后，即可求得样品中蛋白质含量。 每克样品中含氮的克数6.25100=100克样品中蛋白质的含量（克%）。,2紫外-分光光度计法,由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸在280nm左右具有最大吸收，所以在280nm吸收值与浓度成正比，可用于蛋白质含量测定 蛋白质浓度mg/ml=1.45A2800.74 A260 由于此法非常简便，条件要求低，因此常作为粗略定量蛋白质的方法来使用 。,3双缩脲法（Biuret法）,包含肽键基团的化合物能与硫酸铜-氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物。 在540 nm处测定其吸光值，此值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。 双缩脲法的测定范围为110 mg蛋白质。 优点是快速，缺点是灵敏度差。,4Folin-酚试剂法（Lowry法）,又叫Lowry法 其原理是碱性铜试剂与蛋白质发生双缩脲反应，然后蛋白质中的酚基（如酪氨酸）在碱性条件下很容易将混合试剂（含有磷钼酸和磷钨酸）还原或蓝色的钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，在650660nm下测定光吸收值，即可测定蛋白质含量。 此法比双缩脲法灵敏100倍。蛋白质测量范围在25250mg/ml，因此是通用的方法之一。但其受还原剂、EDTA、Tritonx-100及酚的影响，并且蛋白质的种类不同，有较大的变动。,5考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法）,用考马思亮兰G-250染色蛋白质，出现的颜色深浅与蛋白质浓度呈正比。其颜色在595nm的光波下，有强烈吸收峰。 常用