常规真核表达与鉴定.ppt

1,常规真核表达与鉴定,刘宗梁 2013-10-19,2,一、真核表达概述； 二、常用真核表达系统； 三、细胞与载体的选择； 四、哺乳动物细胞转染； 五、Western-blot法对转染结果的检测； 六、间接免疫荧光法（IFA）对转染结果的检测； 七、Cell-ELISA法对转染结果的检测；,主要内容：,3,一、真核表达概述,1、真核表达：通过将外源基因克隆到真核表达载体，并转染到合适的真核细胞中，最终获得外源目的基因高效表达产物的过程。 2、真核表达相对原核表达的优点：在真核表达的过程中，可以通过真核细胞的转录及修饰系统（如甲基化修饰、糖基化修饰、乙酰化修饰等）获得具有一定构象和生物活性的蛋白质；表达目的蛋白更的结构及生物学功能（如免疫原性等）更接近于该蛋白的天然状态，且表达的蛋白不存在原核表达中“包涵体”这一现象。 3、真核表达缺点：表达量低，一般难以持久表达。,4,二、常用真核表达系统,1、毕赤酵母表达体系：酵母细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但纯化难度大。 2、慢病毒表达系统：商品化的慢病毒表达系统（如Lenti-X）在病毒包装时获得VSV-G泛嗜性重组慢病毒，通过膜质偶联和膜质融合的方式感染靶细胞，可感染几乎所有类型的哺乳动物细胞。 3、哺乳动物细胞表达体系：对蛋白的加工与修饰与酵母及昆虫表达系统完全不同，可通过脂质体等直接将外源表达质粒导入哺乳动物细胞，进行表达。哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白，但其表达量低。,5,4、杆状病毒昆虫细胞表达体系：蛋白表达水平高，可长晶体，多用于蛋白结果与功能的研究，但重组质粒构建及融合十分复杂。,6,三、细胞与载体的选择,1、常用于表达的哺乳动物细胞：COS-7、BHK、293T、Sf-9、Sf-21等，具体选择可根据实际需要或者表达载体所含的表达原件等进行选择。 2、表达质粒的选择：常用的真核表达质粒有pCAGGS、pCDNA 3.1、 pEGFP等（均为SV40 origin）。 3、某些特殊的表达载体：如反向遗传表达载体，昆虫表达系统载体等。,7,四、哺乳动物细胞转染,1、引物设计：构建重组真核表达质粒，一般在引物设计时首先会在引物中引物一些能够促进蛋白表达（如Kozak序列）或者便于后期检测的序列或标签（如flag、HA、His等），注意这些序列在引物中的位置。 2、实验材料：真核表达细胞系、DMEM、FBS、OPTI-MEM、PBS、trypsin、携带有外源基因的重组质粒（去细胞内毒素法抽提）、转染试剂（或仪器）、细胞计数器、盖玻片、六孔板等。 3、转染细胞密度约25106/mL,一般在细胞铺板后1218h内进行转染，转染的质粒要测定浓度，按2ug/孔进行。,8,细胞转染步骤 以DFV-E基因转染cos-7细胞为例,1、cos-7细胞消化后计数，铺六孔板，培养1224h，观察细胞生长情况，至适宜密度 (铺板后的细胞尽可能在24h内进行转染，一般选择过夜)即可进行转染。 2、质粒及脂质体处理 （1）及脂质体 ：脂质体为4、6、8uL/孔（脂质体+OPTI-MEM，250ul/1.5 tube，孵育5min） （2）质粒：质粒终浓度分别为2、3、4ug/孔（质粒+OPTI-MEM，250ul/1.5 tube，不需孵育，在脂质体孵育5min中的过程中，把质粒配好）,9,3、将第二步中（2）加入（1）中，混匀，不要剧烈吹打，孵育20min（在两者作用的20min时间内，洗涤细胞） 4、细胞的洗涤：先弃掉原培养液，以维持液DMEM（未加血清）洗涤两遍1mL/孔；再用OPTI-MEM洗涤一遍，约1mL/孔。细胞洗涤也可用预热的PBS或者Hanks液洗涤，最后一遍洗涤最好使用维持液。 5、将六孔板中的以上液体弃掉，再加入1.5mL的OPTI-DMEM； 将孵育的脂质体及质粒（500uL/孔）均匀 滴入其中，轻摇六孔板使之混合均匀。,10,6、将六孔板放入培养箱，一般56小时后换液，具体是否要换液根据细胞具体生长状态进行调整。 7、弃去原培养液，补加2mL/孔的OPTI-MEM，或者加入2mL/孔的含10%血清的DMEM培养基，继续培养至3648h。 8、培养至48h后收细胞即可停止培养，然后进行表达蛋白的鉴定。若用IFA法检测，则在此处即可进行细胞固定；若进行Western bolt法检测，则此处需要将细胞消化下来，裂解，然后进行SDS-PAGE，最终通过WB检测。 9、转染时注意做空白细胞对照和空质粒转染对照。,11,五、Western-blot法对转染结果的检测,1、培养至48h后收细胞(视细胞状态决定何时收集细胞)，弃去六孔板中的培养液，然后以胰酶消化500uL/孔、作用1min。 2、以预冷的PBS反复吹打洗脱细胞，PBS 1mL/每孔(最好再用PBS 500uL重复洗细胞孔一次，彻底收集所有的细胞)，为了提高细胞量，可做两转染孔合一管。 3、吸取消化下来的细胞于1.5mL tube中，4、12000r/m、2min；弃上清。,12,4、再以1mL PBS洗涤离心细胞沉淀，在管口沿壁加入，吹起沉淀；离心：4、12000r/m、2min；弃上清。 5、每个离心管加入100uL细胞裂解液(RIPA)，吹打混匀，冰上作用30min裂解细胞。 6、离心4 12000r/m、5min；吸取上清约30uL；煮样，加上样loading buffer，蛋白电泳。 7、转膜、封闭，进行western blotting鉴别。 8、注意：由于真核表达的蛋白量较低，因此在做WB检测时，最好采用ECL发光，然后通过X胶片曝光或者使用低温冷冻CCD仪器进行曝光，而不采用化学发光试剂DAB进行显色，因为检测的灵敏度差异较大。,13,细胞裂解液RIPA配方,强裂解液（50mL） 弱裂解液（50mL） Tris-HCL(pH=7.4) Tris-HCL(pH=7.4) NaCL 0.44g NaCL 0.44g Triton-X 100/NP40 500uL Triton-X 100/NP40 500uL 脱氧胆酸钠 0.5g 脱氧胆酸钠 0.125g SDS 0.05g SDS 0.05g 1mM EDTA 0.0186g 1mM EDTA 0.0186g,14,六、间接免疫荧光法（IFA）对转染 结果的检测,1、转染细胞培养至48h后，弃掉六孔板中培养基，用PBS洗涤细胞35次，每次1mL/孔，加入PBS后将培养板放在水平摇床中轻摇1min。注意：千万不能用冷的PBS，否则细胞会从培养板中大片脱落。 2、细胞固定：以4%多聚甲醛将细胞固定在六孔板中，防止脱落；1mL/孔，室温固定2030min。 3、洗涤细胞板：PBS（或PBST）洗涤35次，每次1mL/孔，1min/次。,15,4、透膜：对于胞内表达的分泌蛋白需要进行透膜，而在膜表面表达的可以不透膜。此时以冷的Triton-X 100，1mL/孔，室温孵育1520min进行透膜。 5、洗板：同上。 6、封闭：以1% BSA（PBST溶解）封闭六孔板，1mL/孔，室温孵育3060min。 7、洗板：同上。,16,8、孵育一抗：一抗可选择制备的多抗或针对特定标签的单抗，以1% BSA稀释抗体。500uL1mL/孔，37，孵育1h。 9、洗板：同上。 10、孵育荧光二抗：二抗为FITC荧光标记抗体，孵育时需要用锡箔纸将六孔板完全包裹住，37，避光孵育1h。 11、洗涤：此处洗涤同上，但仍需要避光。 12、置于荧光显微镜同一设置参数下，分别进行对照孔及转染孔的拍照。,17,18,七、Cell-ELISA法对转染结果的检测,1、该方法用于在96孔板进行的转染，转染至48h后，前期操作同IFA，只是在孵育二抗的时