蛋白质的测定方法.doc

天津农学院职业技术学院毕业论文题目：有机酸的测定方法及其研究进展作者：曲洪双 系别：生物工程系班级：08生物技术指导教师：童应凯目录1.引言（前言）2. 蛋白质的总量的测定方法2.1半微量凯氏定氮法（水蒸气蒸馏法）2.2双缩脲比色法2.3紫外吸收法2.4考马斯亮蓝染色法2.5蛋白氮与非蛋白氮含量的测定2.6 Folin酚试剂法 3蛋白氮与非蛋白氮含量的测定3.1游离氨基氮的测定3.2赖氨酸含量的测定3.3色酸氨含量的测定3.4蛋氨酸含量的测定3.5苯丙氨酸含量的测定3.6混合液中各种氨基酸含量的分离测定4蛋白质分析的研究进展4.1 分光光度法4.2 荧光光度法4.3 共振散射光度法参考文献蛋白质和氨基酸的测定方法与研究进展摘要：综述了近年来蛋白质分析的研究进展，重点阐述了国内分光光度法、荧光光度法以及共振瑞利散射光度法在蛋白质测定研究中的应用，探讨了相关领域的研究发展趋势及方向。：综述了近年来蛋白质分析的研究进展，重点阐述了国内分光光度法、荧光光度法以及共振瑞利散射光度法在蛋白质测定研究中的应用，探讨了相关领域的研究发展趋势及方向。关键词：蛋白质、氨基酸 、测定原理、 分析方法、研究进展1引言 蛋白质是生命物质的基础，是生命科学研究的其中主要内容之一，不同的蛋白质种类具有不同的生物功能，它是由二十种 -氨基酸通过酰胺键 （肽键）特定联成的长链分子 （即所谓的肽链）。部分蛋白质还以上包含非肽链结构的其它组成成分，这种成分称为配基或辅基。蛋白质的元素组成除含碳、氢、氧、氮和少量硫外，还含有微量的磷、铁、锌、铜、钼、碘等元素。其中氮的含量较恒定，平均为 16%。因此，一般可由测定生物样品中的氮，粗略地计算出其中蛋白质的含量 （每 1g 氮相当于6.25 克的蛋白质）。蛋白质的基本组成单位为氨基酸，构成天然蛋白质的氨基酸共约20 种。除脯氨酸外，均为 -氨基酸，即羧酸分子中 -碳原子上的一个氢原子被氨基取代而成的化合物。各种蛋白质所含的氨基酸的数目和种类都各不相同。每一种天然的蛋白质都有自己特有的空间结构，而这种空间结构通常称为蛋白质的构象1。为了表示蛋白质结构的不同组织层次，科学家们采用了专门的术语：一级结构指组成蛋白质分子的氨基酸的排列顺序。二级结构即多肽链的局部在一维空间上的排布 （构象）关系，其中最常见的类型是 -螺旋和 -折叠片。三级结构指多肽链借助各种次级键 （非共价键）盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象。如果蛋白质由一条以上多肽链构成，称为四级结构，它涉及多肽亚基的空间排布和它们之间相互作用的性质。蛋白质的种类繁多，结构复杂，迄今为止没有一个理想的分类方法。近年来有些学者提出依据蛋白质的生物功能进行分类，把蛋白质分为酶、运输蛋白质、营养和储存蛋白质、收缩蛋白质或运动蛋白质、结构蛋白质和防御蛋白质。据估计每个人大肠杆菌约有3000 种不同结构的蛋白质分子，复杂的人体则有100000 种以上。正是依靠这些多种多样的蛋白质分子生物体才能精确地完成某种复杂的生理功能。因此，蛋白质的定量分析在生命科学、临床医学和食品分析等方面具有重要意义。本文综述近年来国内蛋白质分析研究的某些进展，内容涉及分光光度法、荧光光度法、共振散射光度法测定蛋白质研究的进展。测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。2、蛋白质的总量的测定 蛋白质含量可以从它们的物理化学性质如折射率、相对密度、紫外吸收、染色等测定而得知;或用化学方法如凯氏定氮、双缩尿反应、Folin酚试剂反应等方法来测定。其中，凯氏定氮法氏蛋白质定量的经典方法，但操作繁琐。Folin酚试剂法和染色法氏一般实验室中经常使用的方法。这类方法操作简便、迅速、不需要复杂好昂贵的设备，又能适合一般实验室的要求，若作一般测定较为适宜。2.1半微量凯氏定氮法（水蒸气蒸馏法）2.1.1样品与硫酸一同加热消化，含氮有机物即分解产生氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵留在溶液中。在定氮仪中，加入强碱碱化，使硫酸铵分解放出氨，借水蒸气将氨蒸至硼酸溶液中，生成四硼酸按，用标准盐酸溶液滴定，即可求的样品中总氮量，并换算出蛋白质含量。消化：有机含氮物+H2SO4CO2+SO2+H20+NH3 2NH3+H2SO4(NH4)2SO4蒸馏：(NH4)2SO4+2NaOH 2H2O+Na2SO4+2NH3吸收：2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO32.1.2.试剂(1) 浓硫酸过氧化氢水混合液（2+3+1） 在100mL水中缓慢加入浓硫酸200mL冷却后再加入3%过氧化氢300mL，混合备用。此液存放阴凉处可保存一个月。(2) 混合指示剂贮备液 取50mL 1g/L溴甲酚绿无水乙醇溶液与200mL 1g/L甲基红无水乙醇溶液混合，贮于棕色瓶中备用。(3) 硼酸指示剂混合液 取100mL 20g/L硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈紫红色即可（约加1mL指示剂0）。(4) 混合催化剂 硫酸铜（CuSO45H2O）10g，硫酸钾100g，硒粉0.2g,在研钵中研细，使通过40目筛，混匀后备用。(5) 0.01mol/L HCI标准溶液。(6) 400g/L NaOH溶液。2.1.3.测定步骤消化：准确称取试样0.20.3g(含有1030mg粗蛋白质)置入100mL凯氏烧杯中，加混合催化剂1g，同时加硫酸过氧化氢水混合液35mL，稍加振摇，斜置于电炉上，在通风橱内加热进行消化。开始时用低温加热，勿使瓶中泡沫超过瓶肚的三分之二，待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度保持微沸。消化到溶液呈浅蓝绿色的透明状时，再继续加热沸腾10min，取出，冷却至室温后，将消化液转入100mL容量瓶中，用7080mL水洗涤凯氏烧杯，冷却至室温后加水稀释至刻度，摇匀。同时作一空白，出不加试样外，其他操作相同。蒸馏：在半微量凯氏定氮仪的蒸馏瓶中，加入5mL稀释消化液10mL水，再加入10Ml400g/LNaOH溶液，立即用水蒸气蒸馏，接收三角瓶中加20mL硼酸指示剂混合液。待蒸馏瓶沸腾后蒸馏5min。滴定：用0.01mol/LHCI标准溶液滴定三角瓶中的吸收液，滴定至溶液由绿色变成浅紫红色为止。吸取5mL空白消化液，按照上述操作步骤进行操作。2.1.4. 计算 粗蛋白质含量(干基，%)=(V-V0)c0.0140K1/m1001/(1-X)式中 V滴定试样时消耗HCl标准溶液的体积(mL)； V0滴定空白时消耗HCl标准溶液的体积(mL)； cHCl标准溶液的浓度(mol/L)； K氮换算成粗蛋白质的系数，一般取6.25； M称取试样的质量(g)； X试样水分含量(%)； 0.0140消耗1mL1mol/LHCl标准溶液相当于氮的质量(g)；2.1.5.讨论 (1) 凯氏定氮法分常量、半微量和微量法三种，其原理和操作步骤基本相同。所不同的是常量法适于测定范围为1540mg氮，半微量法25mg氮，微量法0.051mg氮。另外，碱化后蒸馏，常量法采用直接蒸馏法，半微量法和微量法采用水蒸气蒸馏法。 (2) 消化过程中，若硫酸过氧化氢水混合液损失过多时，可酌量补加，勿使瓶内干涸。消化液加水稀释后，应及时进行蒸馏，否则应保存消化液，临用时加水稀释。 (3) 蒸馏过程中切忌火力不稳，否则将发生倒吸现象。 (4) 混合指示剂在pH5.2时为紫红色；PH5.4时为暗灰色；pH5.6时亮绿色，变色点pH5.4指示剂变色范围很窄，灵敏度高。2.2双缩脲比色法2.2.1原理蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，在540mm处有最大吸收。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的相对分子质量及氨基酸成分无关。该法测定范围为110mg蛋白质，适用于测定精度要求不高的样品。2.2.2试剂(1) 双缩脲试剂 在500mL容量瓶中，依次加入40g/L硫酸铜溶液30mL和25g/L酒石酸钾钠溶液100mL，再慢慢加入5mol/LKOH溶液30mL，最后用水稀释至刻度。(2) 酪蛋白标准溶液 用0.05mol/LNaOH溶液配制成20mg/mL的酪蛋白标准溶液。2.2.3操作步骤绘制标准曲线：取6支试管，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL酪蛋白标准溶液，并分别补水至1mL。各加入10mL双缩脲试剂，摇匀，在60恒温水浴中显色5min，于550nm波长下，以0号管为空白，测定吸光度。以蛋白质质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。样品处理与测定：准确称取固体样品0.1000g（样品经粉碎后通过40目筛），放入干燥的试管中，内放几粒玻璃珠，加入1mL水和10mL双缩脲试剂，在60恒温水浴振荡器上震荡5min，随后以4000r/min离心10min。取上清液于550nm波长处以试剂空白为对照测定吸光度。从标准曲线上查出相应的蛋白质质量（mg）。液体试样：取1mL试液，加10mL双缩脲试剂，直接显色测定。2.2.4计算蛋白质质量（%）=m1/10001/m100式中 m由标准曲线查得酪氨酸的质量（mg） 1000 mg换算成g m 试验称取质量（g）2.2.5讨论(1) 对含脂肪高的样品溶液与双缩脲试剂混合后，若有雾状沉淀，需让其静置2h以上再离心，取其清液比色。（2） 显色反应受温度影响颇大，在常温（2025）下需1h，40需15min，60需5min。显色后若出现浑浊，则离心后取清液比色测定。（3）双缩脲法常用于蛋白质的快速测定，低浓度的铵盐不干扰结果，Tris及含氨基酸、多肽的缓冲液，以及蔗糖、甘油等干扰本实验。（4）酪蛋白预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制溶液。2.3 紫外吸收法 2.3.1原理蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在波长280nm处具有最大吸收峰。由于各种蛋白质都含有酪氨酸，因此280nm处的光吸收是蛋白质的一种普通性质。在一定程度上，蛋白质溶液在280nm处的吸光度与其浓度成正比，故可用作蛋白质定量测定。核酸在紫外线区也有强吸收，可通过校正加以消除。2.3.2试剂（1）60%碱性乙醇溶液 称取NaOH2g，溶于少量60%乙醇溶液中，然后用60%乙醇溶液稀释至1000mL。（2）300g/LNaOH溶液。2.3.3测定步骤准确称取粉碎并过40目筛的样品0.5g，置研钵中，加少量石英砂和300g/LNaOH溶液2.0mL，研磨2min。再加60%碱性乙醇溶液3mL，研磨5min。然后用60%碱性乙醇溶液将研磨好的样品洗入25mL容量瓶中，定容。摇匀后静置片刻，取部分浸提液离心10min（3500r/min）。吸取上清液1mL于25mL容量瓶中，用60%碱性乙醇溶液稀释并定容，摇匀。同样，按以上操作做试剂空白试验。于280nm和260nm波长，用1cm比色皿，以试剂空白为对照分别测定样品的吸光度。2.3.4计算蛋白质含量（%）=（1.45A280nm-0.74A260nm）n1/m100/1000式中 1.45A280nm试样与空白在280nm处测得的吸光度差； 0.74A260nm试样与空白在260nm处测得的吸光度差； n 待测试样稀释倍数； m 称取试样质量（g）； 1000 由mg换算成g。2.3.5讨论不同蛋白质酪氨酸的含量有所差异，蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性，尽管利用上述公式进行校正，但由于不同样品中干扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法的准确性稍差。2.4考马斯亮蓝染色法2.4.1原理 考马斯亮蓝G250存在着红色和蓝色两种不同的着色形式。它和蛋白质通过分子间范德化键结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变为蓝色形式，最大吸收波长由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，其结合物在室温下保持稳定1h。该反应非常灵敏，最低检出量为1ug蛋白质。在1100ug蛋白质范围内呈现良好的线性关系。2.4.2试剂（1）考马斯亮蓝试剂 称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇中,加入100mL85%磷酸，用水稀释至1000mL。最终试剂中含0.1g/L考马斯亮蓝G250，47g/L乙醇，85g/L磷酸。（2）标准蛋白质溶液 结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/mL标准溶液。2.4.3测定步骤绘制标准曲线：取9支试管，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6mL1mg/mL标准蛋白质溶液，补水至2mL。另取9支试管，分别加入0.1mL以上溶液，然后各加入5mL考马斯亮蓝试剂，充分振荡混合，2min后于波长595nm，以0号管为空白，测定各管的吸光度。以标准蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。样品制备：准确称取试样2g放入研钵中，加2mL水研成匀浆，转移到刻度离心管中，再用6mL水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，加水至10mL刻度。放置3060min后，以3500r/min离心20min，将提取液稀释至含蛋白质0.10.8mg/mL。样品测定：吸取提取液0.1mL于试。管中，加入5mL考马斯亮蓝试剂，充分混合，放置2min，以试剂空白为对照，波长595nm下比色，测定吸光度。从标准曲线上查处相应的蛋白质质量（ug）。2.4.4计算蛋白质含量(ug/g)=m0/0.1V1/m 式中 m试样吸光度从标准曲线上查得的蛋白质质量（ug）；0.1吸取提取液体积（mL）； V提取液总体积（mL）； m 称取试样质量（g）。2.4.5讨论（1）比色测定应在试剂加入后510min内测定吸光度，因为在此时间内颜色稳定。（2）测定中，蛋白与染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量时可以忽略的2.5蛋白氮与非蛋白氮含量的测定2.5.1原理样品经粉碎后加水研磨均匀，转入离心管中，以氢氧化铜沉淀蛋白质，离心分离。将含非蛋白氮的上清液转入消化瓶中，用凯氏定氮法测定氮的含量，极为非蛋白氮。然后将蛋白质的沉淀转入消化瓶中，也按凯氏定氮法测定氮的含量，即为蛋白质氮。2.5.2 试剂（1）30g/L硫酸铜溶液。（2）0.2mol/LNaOH溶液。其余试剂铜凯氏定氮法。2.5.3.测定步骤（1）蛋白氮和非蛋白氮的分离 准确称取0.20.3g样品（总含氮量在100mg左右），放入玻璃研钵中，加2mL水研磨至匀浆后，再加2mL30g/L硫酸铜溶液。搅匀，转移到离心管内，同时用8mL水洗净残渣。将离心管放入沸水中，用玻璃棒搅拌，保持3min，然后取出离心管，加3mL0.2mol/LNaOH溶液，搅匀，放置10min后离心。将离心液转入消化瓶中，用热水冲洗沉淀两次，每次约10mL（两次热水中均加一滴3%硫酸铜溶液），再离心，合并到消化瓶中（非蛋白蛋溶液）。将离心管中沉淀物加水全部移入另一消化瓶中（蛋白蛋溶液）。（2）非蛋白氮和蛋白氮的测定 操作方法按本微量凯氏定氮法步骤进行。2.5.4计算同半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量。2.6Folin酚试剂法2.6.1.原理蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络合使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼酸磷钨酸反应，生成钼蓝、钨蓝。其蓝色的深浅与蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量成正比，故可作为比色法测定。该测定法比双缩尿法灵敏，并适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定，对那些含这两个残基与标准蛋白差异较大的蛋白质来说定量有误差。Folin酚试剂法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的方法之一。本法适宜测定范围25250ug蛋白质。2.6.2.试剂(1)Folin酚试剂甲40g/L碳酸钠溶液，0.2mol/LNaOH溶液，10g/L硫酸铜溶液，20g/L酒石酸钾钠溶液。临用前将与等体积混合成碳酸钠氢氧化钠溶液。与等体积混合成硫酸铜酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按(50+1)的比例混合即成。临用前混合配制，1d内有效。(2)Folin酚试剂乙称取钨酸钠(Na2WO42H2O)100g,钼酸钠（Na2MoO42H2O）25g，置入2000mL磨口回流装置内，加水700mL，85%磷酸50mL和浓盐酸100mL。充分混匀，小火回流10h。回流结束后加入硫酸锂（Li2SO4）150g,水50mL及数滴液体溴至溶液呈金黄色，开口继续煮沸15min，以出去多余的溴。冷却后溶液呈金黄色（如仍呈绿色，需再重复滴加液体溴的步骤）。将溶液稀释至1000mL，过滤，置棕色瓶中保存。使用时用水（1+2）稀释。(3)标准蛋白质溶液牛血清蛋白或酪蛋白预先经凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成250ug/mL溶液。(4)0.05mol/LpH7.0磷酸缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）1.09g，磷酸二氢钠（Na2HPO42H2O）0.31g，溶于80mL水中，用pH计调至pH7.0，然后用水稀释至100mL。2.6.3.测定步骤绘制标准曲线：取6支干燥洁净的试管编号，按表2-1-1加入试剂。表2-1-1绘制标准曲线所用试剂管号012345标准蛋白质溶液00.20.40.60.81.0水1.00.80.60.40.20Folin-酚试剂甲5.05.05.05.05.05.0充分摇匀，室温放置10min。各管加入Folin酚试剂乙0.5mL，立即摇匀，30min后以0号管作为空白对照，在650nm波长处测定各管吸光度。以吸光度为纵坐标，标准蛋白质质量（ug）为横坐标绘制标准曲线。样品制备：称取待测样品2g（准确至1mg）置入研钵中，加入10mLpH7.0磷酸缓冲液，充分匀浆，将匀浆液全部转入离心管中，以5000r/minde转速离心10min，重复上述操作，再提取2次。将上清液并入25mL容量瓶中，用pH7.0磷酸缓冲液定容至刻度。样品测定：准确吸取蛋白质提取液0.2mL置干燥试管中，加0.8mL水以下按标准的绘制方法操作。30min后于650nm波长处测定吸光度，在标准曲上查出相应的蛋白质的质量（ug）。2.6.4.计算蛋白质含量（mg/g）=m1/0.2V1/m1/1000式中m由标准曲线查得蛋白质的质量（ug）；0.2吸取试液体积（mL）；V试液总体积（mL）；m称取试样质量（mg）；1000ug换算成mg。2.6.5.讨论(1)Folin酚试剂乙在酸性条件下较稳定，而试剂甲是在碱性条件下于蛋白质作用生成碱性的铜蛋白质溶液。当试剂乙加入后，应迅速摇匀，使还原反应产生在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前。(2)Tris缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、基化合物均可干扰Folin酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素、胍、硫酸钠、硝酸钠、TCA、乙醇、乙醚、丙酮，对显色无影响，但浓度较高时则要校正。如果所测样品中含硫酸铵，需增加碳酸钠氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠氢氧化钠量12倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。3蛋白质降解产物的测定蛋白质在一定条件下，完全水解可得到氨基酸混合液，适度水解即不完全水解可得到各种水解中间产物及氨基酸混合物。蛋白质水解的方法有酸法、碱法和酶法，最常用的的是酸法水解。氨基酸的定量测定多数用化学法和比色法，而多种氨基酸含量的测定则选用高效液相色谱法。3.1游离氨基氮的测定3.1.1甲醛滴定法 3.1.1.1原理氨基酸中的NH2基的PK值常在9.0以上，不能用NaOH标准溶液直接滴定。但可以用甲醛法测量。在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸中氨基相互作用，使滴定终点移至pH9.0左右，可以用酚酞作指示剂，以NaOH标准溶液来滴定NH+3基撒花那个的H+，每释放一个氢离子，酒相当于有一个氨基氮。反应如下：R- NH+3H+R- NH2；R- NH2+2HCHOR-N（CH2OH）2滴定的结果表示游离氨基的含量，其精确度可达理论量的90%。如果样品中只含有某一种已知的氨基酸，从甲醛法测定结果可求的该氨基酸的含量。如样品是多种氨基酸的混合物（如蛋白水解液），则测定结果不能作为氨基酸的定量依据。一般常用此法测定蛋白质水解程度，随着水解程度的增加滴定值增加，当水解完全后，滴定值即保持恒定。甲醛滴定法采用的甲醛浓度为2.03.0mol/L，即滴定后最终浓度为6%9%。3.1.1.2试剂中性甲醛溶液 在50mL36%37%甲醛中加入5滴5g/L酚酞乙醇溶液，然后用0.2mol/LNaOH溶液滴定到微红（使用前需重新中和）。酚酞指示剂 5g/L酚酞的50%乙醇溶液。0.01mol/LNaOH标准溶液 用邻苯二甲酸氢钾标定。10%(体积分数)乙酸溶液。3.1.1.3.测定步骤 （1）样品处理 称取试样0.2g（准确至1mg），置入研钵中，加5mL10%乙酸溶液研磨至均匀，用水转移到50mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀、过滤（弃去最初部分滤液）。 （2）样品测定 在三角瓶中加入2mL样品滤液，加水4mL，3滴酚酞指示剂，摇匀后用0.01mol/LNaOH标准溶液滴定到微红色。然后加入2mL中性甲醛溶液，摇匀，放置片刻，再用0.01mol/LNaOH标准溶液滴定回到微红色终点，记下甲醛加入后样品消耗NaOH标准溶液的体积。同样，取6mL水按以上操作作空白实验。3.1.1.4.计算-氨基氮含量（%）=（V-V0）c0.0141/2501/m100式中 V加甲醛后样品消耗NaOH标准溶液体积（mL）； V0加甲醛后空白消耗NaOH标准溶液体积（mL）； cNaOH标准溶液的浓度（mol/L）； 0.014消耗1mL1mol/LNaOH标准溶液相当于氮的质量（g）； 2吸取样品滤液的体积（mL）； 50样品稀释液的总体积（mL）； m 称取试样质量（g）。3.1.1.5.讨论 （1）甲醛法中除氨态氮外别的氮也能起反应（如铵盐、酰胺等），故误差较大。另外由于各种氨基酸的等电点不同，故确定一个合适的滴定终点较为困难。 （2）脯氨酸与甲醛作用后，生成不稳定化合物，致使滴定结果偏低，酪氨酸含有酚基，滴定时要消耗一些碱，可使滴定结果偏高。溶液中若有氨存在也可与甲醛反应，使结果偏高。3.1.2茚三酮比色法3.1.2.1.原理茚三酮与氨基酸作用形成蓝色化合物。反应的灵敏性在很大程度上依赖于氢离子浓度。强酸、强碱均可阻碍反应的进行。最适酸碱度为pH4.5.除氨基酸可与茚三酮发生反应显色外，蛋白质，肽及多肽也能与茚三酮起颜色反应。反应酚两阶段进行。最初发生氨基酸的氧化脱羧基反应并形成还原型的水合茚满三酮茚满酮。空气中的氧如同氧化剂一样，有阻止茚满酮形成的作用。因此在一般条件下，甚至加热的情况下反应进行缓慢，并且灵敏性差。当茚三酮与氨基酸反应时，加入还原剂抗坏血酸酒可以在反应的混合液中获得足够的茚满酮。但丙醇存在时，显著加快反应速度和提高此方法灵敏度。抗坏血酸作为还原剂，在加热情况下能促进较快的显色和保持颜色的稳定。 改良的茚三酮试剂乙二醇并补加正丁醇和丙醇的茚三酮溶液。这种试剂灵敏性高，稳定。在pH4.54的条件下氨基酸与该试剂反应的显色值（除半胱氨酸和丙氨酸外）基本一致（见表212）。因此可以定量测定试样中游离氨基氮量。表2-1-2在pH4.54下，氨基酸与改良茚三酮试剂显色值（占亮氨酸显色值）氨基酸显色值%氨基酸显色值%氨基酸显色值%缬氨酸105丙氨酸100谷氨酰胺96缬氨酸105精氨酸酸100色氨酸95谷氨酸104酪氨100苏氨酸92甘氨酸102亮氨酸100酪氨酸91异亮氨酸102组氨酸99天冬酰胺84正亮氨酸102苯丙氨酸99半胱氨酸33赖氨酸102胱氨酸99丙氨酸27蛋氨酸102酪氨酸99氨98丝氨酸101天冬氨酸993.1.2.2.试剂(1)茚三酮试剂称取1.2g茚三酮，加15mL正丙醇，摇动使其溶解。然后加入30mL正丁醇、60mL乙二醇，混匀。再加入9mLpH4.5的乙酸缓冲液，仔细混匀。保存于棕色瓶中，置于冷凉处。试剂试用期限为10d。(2)4mol/LpH4.5乙酸缓冲液称取27.2g乙酸钠（NaAc3H2O）于烧杯中，加80mL水溶解。在电炉上加热至沸，冷至室温后，用冰乙酸调至pH4.5，然后用煮沸冷却水稀释至100mL。（3）氨基酸标准液准确称取在8090下烘至恒重的亮氨酸46.8mg或丙氨酸31.8mg，加10%异丙醇溶解，并定容至100mL，混匀。使用时，取此溶液5mL，用水稀释至50mL。即成5ug氮/mL标准溶液。（4）10g/L抗坏血酸溶液（制备液仅用1d）。3.1.2.3测定步骤绘制标准曲线：取7支具塞试管，分别加入氨基酸标准液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL，各管均加水至2mL，再加3mL茚三酮试剂，0.1mL10g/L抗坏血酸溶液，混匀。置沸水浴中加热15min。取出后在间歇摇动下冷却15min。加热时形成红色的茚满酮在冷却和摇动时被空气中的氧氧化而褪色，而茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色化合物变得更加鲜明。以60%乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀。于580nm波长下测定吸光度。以氨基氮质量（ug）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。 （1）样品处理准确称取新鲜样品0.5g（或干样品0.1g）置研钵中，加5mL10%乙酸溶液研磨至匀浆，然后用水转移到容量瓶中，并定容至100mL。摇匀后过滤。 （2）样品测定吸取2mL滤液于具塞试管中，加3mL茚三酮试剂，0.1mL10g/L抗坏血酸溶液，混匀。置沸水浴中加热15min，取出后在间歇摇动下冷却15min。以60%乙醇补充溶液体积至5mL，摇匀，以试剂空白为对照，于580nm波长下测定吸光度。从标准曲线上查出相应的氨基氮质量（ug）.3.1.2.4.计算氨基氮含量（mg/100g）=m1/21001/10001/m100式中m由标准曲线查得氨基氮质量（ug）；2吸取试液体积（mL）；100试液总体积（mL）；1000ug换算成mg；m称取试样质量（g）。3.2赖氨酸含量的测定3.2.1.原理 测定蛋白质中赖氨酸，是基于TNBS只与蛋白质中N末端的氨基及赖氨酸残基的氨基起反应，反应后生成的TNP蛋白质，经盐酸水解后分别产生含有TNP氨基的小肽碎片。在酸性溶液中前者可用有机溶剂抽提除去，而酸性溶液中留下的TNP氨基含量即可在340nm处定量测定，此含量即相当于蛋白质中赖氨酸的含量。3.2.2.试剂（1）1g/L三硝基苯磺酸（TNBS）溶液 称取0.1g三硝基苯磺酸溶于水并稀释至100mL。（2）4g/LNaHCO3（用稀酸或稀碱溶液调至pH8.5）。（3）2.5g/LNaOH溶液。（4）0.01mol/L亚硫酸钠溶液 称取0.252gNa2SO37H2O，加水至100mL。（5）丙氨酸标准溶液 准确称取丙氨酸44.5mg，加水溶解后定容至100mL，即成5mmol/L标准溶液。3.2.3.操作步骤绘制标准曲线：吸取丙氨酸标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，分别补充至1mL。再加40g/LNaHCO3溶液1mL，1g/LTNBS溶液1mL，于40下保温2h，取出，加1mol/LHCl溶液1mL，以水稀释至10mL,混匀。于340nm波长处测定吸光度。以丙氨酸浓度（umol）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。样品中蛋白质的提取：称取粉碎脱脂样品0.2g（准确至1mg），至刻度离心管中，加几滴无水乙醇，混匀，再加2.5g/LNaOH溶液至10mL。于40下震荡30min（或室温下放置过夜）。取出，离心（20002500r/min）5min。上清液为样品提取液。TNP蛋白质生成与水解：吸取提取液0.2mL，置具塞试管，加40g/LNaHCO3溶液1mL及1g/LTNBS溶液1mL，在40下保温2h，此后加入浓盐酸2mL，塞上玻璃塞，于110下水解2h，加水4mL。乙醚萃取与比色测定：将水解液通过滤纸过滤（或离心）到装有10mL乙醚的分液漏斗中，以少量水（约2mL）洗涤沉淀，震荡摇匀1min。等分层后，弃乙醚层，再用乙醚重复萃取23次，将水层定容至10mL。以试剂空白为对照，在340nm波长下测定样品溶液吸光度。从标准曲线上查出相应的丙氨酸浓度即赖氨酸浓度。3.2.4.计算赖氨酸含量（%）= m146.21/V1V21/1061/m100式中 m样品液中赖氨酸的浓度（umol/L）； 146.2赖氨酸微摩尔质量（ug/umol）； V1吸取提取液体积（mL）； V2提取液总体积（mL）； m称取试样质量（g）。3.2.5讨论（1）若蛋白质中N末端也是赖氨酸，在用有机溶剂抽提时也将被除去，因而实际测得赖氨酸含量将偏低，但由于蛋白质分子较大，总的氨基远多于此氨基，因此影响不大。（2）TMP蛋白质在6mol/L盐酸溶液中水解不宜过长，一般2h即可，因为TNP小肽在340nm处光吸收值与游离TNP赖氨酸的值大致相同，酸水解可不必彻底。（3）为了使大分子蛋白质中的氨基充分暴露，需尽可能将蛋白质变性（在碱性条件下保温数小时）；同时，在此条件下，&基也将氧化成二硫键，可以避免&基的干扰。3.3色酸氨含量的测定3.3.1酸水解法3.3.1.1.原理在对二甲氨基苯甲醛（DAB）试剂存在下，蛋白质于9.5mol/LH2SO4中温和水解成游离色氨酸后立即与DAB缩合，经亚硝酸钠氧化而加速蓝色化合物的形成。在一定范围内，蓝色深浅与色氨酸含量成正比。3.3.1.2.试剂 （1）60g/L对二甲氨基苯甲醛溶液 称取6gDAB溶于100mL10%（体积分数）硫酸溶液中。（2）9.5mol/LH2SO4溶液。（3）0.45g/L亚硝酸钠溶液（新鲜配制）。（4）色氨酸标准溶液 准确称取25mg色氨酸于烧杯中，加约100mL水及0.1mol/LNaOH溶液10 mL，溶解后定容至250mL。即为100ug/mL色氨酸标准溶液。3.3.1.3.测定步骤（1）绘制标准曲线 吸取色氨酸标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于6支25mL比色试管中，分别加入60g/LDAB溶液0.5mL，摇匀，再加入3mL9.5mol/L的H2SO4溶液，摇匀，置于25的恒温水浴中水解缩合12h左右。取出后加入0.45g/L亚硝酸钠溶液0.1mL，摇匀，待氧化30min后，用水定容至10mL，于590nm波长处，0号管为空白测定吸光度。以色氨酸质量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（2）样品处理与测定 准确称取20mg脱脂样品（样品经磨碎并通过40目筛，脱脂烘干）于25mL具塞试管中，加入60g/L的DAB溶液0.5mL，摇匀，再加入3mL9.5mol/LH2SO4溶液，摇匀，置于25恒温水浴中水解缩合12h左右。取出后加入0.45g/L亚硝酸钠溶液0.1mL。摇匀，待氧化30min后，用水定容至10mL，过滤。于590nm波长处以试剂空白为对照，测定吸光度。从标准曲线上查出相应的色氨酸质量（ug）。3.3.1.4.计算色氨酸含量（%）= m1/10001/m100式中 m由标准曲线查得样品液色氨酸质量（ug）； 1000ug换算成mg； m称取试样质量（mg）。3.3.1.5.讨论（1）本法用酸量少，若样品质量过大可能水解不完全，使结果偏低，一般取样20mg左右为宜。（2）用9.5mol/LH2SO4溶液水解样品中蛋白质，DAB对色氨酸有保护作用，其水解缩合时间（25下）需12h以上。（3）与DAB的缩合产物通常需要用NaNO2氧化加速显色，本实验中加入NaNO2溶液浓度在0.451.0g/L之间对测定结果无影响。采用0.1mL0.45g/L新配制的NaNO2氧化30min达到显色高峰，此后稍有下降。3.3.2不水解蛋白质直接测定法3.3.2.1.原理蛋白质分子中色氨酸在浓硫酸溶液中能与对二甲氨基苯甲醛（DAB）试剂反应生成蓝色产物，其蓝色的深浅与色氨酸的量成线性关系，因此可以利用这一特性，蛋白质不必水解而直接测定色氨酸含量。3.3.2.2.试剂（1）10.7mol/LH2SO4溶液 148mL浓硫酸加水稀释至250mL。（2）2.5g/LNaOH溶液。（3）对二甲氨基苯甲醛（DAB）溶液 600mgDAB溶于180mL10.7mol/L硫酸溶液中。（4）0.4g/LNaNO2溶液。（5）色氨酸标准溶液 准确称取10mg色氨酸，加少量水，再加12滴浓硫酸，使其完全溶解，用水稀释定容至100mL。即为100ug/mL标准溶液。3.3.2.3.测定步骤（1）绘制标准曲线 取6 支刻度试管，分别加入0 0.5mL标准色氨酸溶液，然后均补水至0.5mL。加入DAB溶液4.5mL，混匀。在室温下避光放置1.5h，再各加入0.05mL0.4g/LNaNO2溶液，摇匀，放置30min。以0管作为空白，于600nm波长处测定吸光度。以色氨酸质量（ug）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（2）样品配制 准确称取0.5g脱脂谷物样品（豆类为0.25g），加入0.25g/LNaOH溶液溶解并稀释至10mL，在40水浴中震荡30min（或在室温下放置615h），静置，上清液为测试样液。（3）样品测定 取0.25mL样品上清液，加水0.25mL，DAB溶液4.5mL，以下按标准曲线绘制操作。以试剂空白为对照，测定吸光度。在标准曲线上查出相应的色氨酸质量（ug）。3.3.2.4.计算色氨酸含量（%）= m1/0.251010-61/m100 式中 m由标准曲线查得样品液中色氨酸质量（ug）； 0.25吸取样品液体积（mL）； 10样品液总体积（mL）； 10-6ug换算成g； m称取试样质量（g）。3.4蛋氨酸含量的测定3.4.1分光光度法3.4.1.1原理将蛋氨酸加入到一定的乳酸中，在浓硫酸和羟基联苯（PHD）存在下，蛋氨酸抑制乳酸与PHD的颜色反应，随蛋氨酸量增加，有色化合物吸光度成比例下降。在乳酸量为20ug，蛋氨酸在545ug范围内符合比尔定律，可在560nm下进行比色测定。3.4.1.2.试剂（1）40g/L硫酸铜溶液。（2）PHD试剂 用0.2mol/LKOH溶液配制成1.5g/L羟基联苯溶液。（3）0.1mg/mL乳酸溶液。（4）蛋氨酸标准溶液 用0.1mol/LHCl溶液配制成0.1mg/mL蛋氨酸的标准溶液。（5）6mol/LHCl溶液。3.4.1.3.测定步骤（1）绘制标准曲线 吸取蛋氨酸标准溶液0，0.05，0.15，0.20，0.25，0.35，0.45mL放入试管中，除0 号管，均加0.2mL乳酸（20ug）溶液，各管加水稀释至1mL，加入0.05mL40g/L硫酸铜溶液及6mL浓硫酸，置沸水浴中加热5min，然后冷却至室温，再加人0.1mLPHD试剂，混匀。于30下保温30min（如果PHD不能完全溶解，需在沸水浴中再加热1.5min），冷却后，以试剂空白为对照（不加乳酸），于560nm波长处测定各管吸光度。以蛋氨酸质量（ug）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。（2）样品处理 准确称取脱脂谷物样品100mg于玻璃管中，加6mol/LHCl溶液2mL，抽真空，封口，在105水解24h，加水稀释后，用50mg活性炭脱色，过滤。以1mol/LHCl溶液洗涤炭粉（先用5mL热的，然后用2mL冷的），滤液与洗液合并，用1mL1mol/LNaOH溶液调pH至3左右，然后用0.1mol/LHCl溶液稀释成50mL。（3）样品测定 取0.8mL样品液，加入0.2mL乳酸（20ug）溶液，0.05mL40/L硫酸铜溶液及6mL浓硫酸，置沸水浴中加热5min，然后冷却至室温，再加0.1mLPHD试剂，混匀，于30下保温30min（若PHD不能完全溶解，需在沸水浴中再加热1.5min），冷却后以试剂空白为对照（不加乳酸），于560nm波长下测定吸光度。从标准曲线上查出的蛋氨酸质量（ug）。3.4.1.4计算蛋氨酸含量（%）= m1/0.8501/10001/m100式中 m由标准曲线查得样品液中蛋氨酸质量（ug）； 0.8吸取样品液体积（mL）； 50样品液总体积（mL）； 1000ug换算成mg； m称取试样质量（mg）。3.4.1.5讨论（1）在用盐酸水解蛋白质样品时，蛋氨酸会有不同程度的破坏。对含淀粉多的样品预先采用100倍5g/L三氯乙酸煮沸，溶解淀粉，在水解过程中，加一些保护剂，如&基乙酸、&基乙醇、苯酚、草酸等，可提高蛋氨酸回收率。（2）硫酸浓度和Cu2+含量对显色强度有明显影响，溶液中硫酸浓度在14mol/L以下不显色，而且浑浊，15mol/L以上才能形成紫红色透明溶液。Cu2+起催化作用，随含量增加，显色强度增大。（3）显色时随着温度升高，颜色强度减弱。一般在30显色30min较为适宜，显色后的溶液在室温下放置2h内色泽基本上稳定（每10min增加吸光度0.0040.006）。3.4.2硝普盐法3.4.2.1.原理蛋氨酸与硝普盐亚硝基五氰络铁酸盐，Fe2（NO2）（CN）5反应呈有色化合物，并且此显色试剂对胱氨酸、半胱氨酸、高胱氨酸及除色氨酸以外的其他氨基酸 均不呈色，而色氨酸在本实验的水解过程中已被破坏。蛋氨酸测定范围为25200ug。3.4.2.2.试剂（1）蛋氨酸标准溶液 准确称取50mg（准确至1mg）蛋氨酸，用0.1mol/LHCl溶解，并稀释至50mL为储备液。吸取5mL贮备液，用0.1mol/LHCl稀释定容至50mL，即为100ug/mL标准溶液。（2）14.3mol/LNaOH溶液 溶解57.2gNaOH于水中并稀释至100mL。（3）盐酸磷酸混合溶液 9mL浓盐酸与1mL85%磷酸混合而成。（4）10g/L甘氨酸溶液。（5）100g/L硝普盐溶液。（6）1mol/LHCl溶液。（7）20%（体积分数）HCl溶液。3.4.2.3测定步骤（1）绘制标准曲线 吸取蛋氨酸标准液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8mL。置25mL比色管中，均以0.1mol/LHCl稀释至5mL，按顺序加入下列试剂并混匀：1mL14.3mol/LNaOH溶液，1mL10g/L的甘氨酸溶液及0.3mL100g/L的新配制的硝普盐溶液，在3040水浴中加热510min，然后用冰水冷却2min，加入5mL盐酸磷酸混合液，摇匀，再置室温水浴中510min，于540nm波长下比色测定，以吸光度为纵坐标，蛋氨酸质量为横坐标绘制标准曲线。（2）样品处理 准确称取50mg样品于玻璃管中，加入2mL20%（体积分数）HCl溶液，抽真空，封口。放置105干燥箱中水解24h。水解后开管，用水稀释后加50mg活性炭脱色，过滤，用1mol/LHCl洗涤炭粉（先用5mL人的，然后用2mL冷的）。滤液与洗液合并，并用5mol/LNaOH溶液调至pH3.5，然后用0.1mol/LHCl稀释至100mL。（3）样品测定 吸取稀释液5mL,以下按标准曲线绘制操作测定吸光度。从标准曲线上查出相应的蛋氨酸质量（ug）。3.4.2.4计算蛋氨酸含量（%）= m1/51001/10001/m100式中 m由标准曲线查得样品液中蛋