β-葡萄糖苷酶的分离纯化.doc

本章以裂褶菌DS1液体发酵粗酶液为研究对象，对粗酶液中-葡萄糖苷酶先后进行硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Sephacry1S-200分子筛层析等方法对其进行分离纯化，并在此基础上对该酶的一般性质进行研究。4.1 材料与方法4.1.1 材料4.1.1.1菌种: 裂褶菌（S. commune）DS1，由华中科技大学生命科学与技术学院资源与环境微生物所提供4.1.1.2培养基: 斜面培养基(PDA培养基)：马铃薯(200g)，蔗糖(20g)，琼脂(30g)，水（1000mL）种子培养基(PDY培养基)：马铃薯(200g)，蔗糖(20g)，水（1000mL）发酵培养基：纤维素(3.2 g),蛋白胨(3.0 g), KH2PO4(0.2 g), Ca(NO3)2.4H2O(1.5 g), MgSO4.7H2O(0.5 g) ,水(100mL)4.1.1.3 缓冲溶液0.2mol/L pH=8.10Tris-HCL缓冲溶液：称取6.055g Tris溶于500mL双蒸水中；量取4.2mL盐酸溶液溶于500mL双蒸水中；将262mL盐酸溶液和500mL双蒸水（含Tris）混合即成0.2mol pH=8.10Tris-HCl缓冲溶液。4.1.1.4试剂:对硝基酚-葡萄糖苷（pNPG）Sigma公司对硝基酚（NPG）Sigma公司DEAE-Sepharose Fast FlowAmersham公司Sephacry1 S-200Amersham公司蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司硫酸铵上海实验试剂有限公司过硫酸按Fluka公司考马斯亮蓝R-250，G-250北京鼎国生物技术发展中心丙烯酞胺、甲叉双丙烯酞胺中国医药(集团)上海化学试剂公司TEMEDSigma公司PMSFSigma公司SDSSigma公司Tris上海伯奥生物科技有限公司甘氨酸Sigma公司甲硫氨酸上海伯奥生物科技有限公司低分子量标准蛋白天根生化科技（北京）有限公司PEG-20000天津市科密欧实验化学试剂开发中心快速银染试剂盒碧云天生物技术研究所芦丁（95）国药集团化学试剂有限公司槐角苷（90）实验室自制槐角提取物（10：1）西安天园生物技术有限公司4.1.1.4 仪器TG-332A 微量分析天平上海天平仪器厂低速大容量离心机上海精密仪器仪表有限公司电泳仪(DYY-型)北京六一仪器厂UV2000紫外-可见光分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司4.1.2 方法4.1.2.1粗酶液的获得方法将菌种DS1接种到PDA斜面活化3d后，挑取一定大小的菌块接入PDY培养基中，培养3d制备一级液体种，再以10的接种量接入PDY培养基中培养3 d制备二级液体种。按10%的接种量将二级种加入含有100mL发酵培养基中，于27，150 r/min摇床上培养。每天取一瓶发酵液在4000 r/min条件下离心10min后，取上清液在标准条件下用pNPG测定-葡萄糖苷酶的活性。如此持续取三角瓶内的培养液直至培养的第10d为止，取-葡萄糖苷酶的活性最高的培养液为粗酶液。4.1.2.3对硝基酚标准曲线的绘制见方法2.1.2.2。4.1.2.4 -葡萄糖苷酶酶活测定对硝基酚-葡萄糖苷（pNPG）法54测定-葡萄糖苷酶酶活。4.1.2.5 蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G250法。将测试酶液稀释到一定浓度，取0.5mL于试管中再加入2.5mL考马斯亮蓝G250试剂，摇匀，静置10min后，在595nm条件下进行蛋白质含量测定。以牛血清蛋白做标准曲线为Y=4.905X-0.0131，R2=0.9928(Y为吸光值，X蛋白质含量)。4.1.2.6 硫酸铵分级沉淀、脱盐和浓缩1. 确定盐析时饱和度范围 （1）取粗酶液7份，每份15mL;（2）分别用饱和度为20-80%相对饱和度的(NH4)2SO4于4盐析12h;（3）以不加硫酸铵的酶液为对照，于冰箱中于4盐析12h；（4）8500 r/min于4离心20min;（5）分别收集各离心管中的上清液和沉淀，并用pH5.0的乙酸-乙酸钠恢复至原体积，在A595与A410条件下分别测定其蛋白质含量和-葡萄糖苷酶活力。2. 最佳pH条件下盐析 （1）在100ml粗酶液中缓慢加入硫酸铵至X1%饱和度；（2）4静置12h;（3）4，8500r/min条件下离心20min，取上清液，测量上清液体积；（4）在上清液中继续缓慢加硫酸铵至X2%饱和度；（5）4静置12h;（6）4, 8500r/min条件下离心20min，取上清液，沉淀溶于最佳pH值的乙酸-乙酸钠中。并在相同的缓冲溶液中透析过夜，直至检测不出SO42+为止, 4500r/min离心15min，取上清。4.1.2.7 DEAE-Sepharose F.F. 阴离子交换柱层析将收集的上清液施于经Tris-HCL缓冲液(pH=8.10,50mmol Tris-HCL缓冲溶液)预平衡的DEAE-Sepharose F.F. 层析柱上(1.0cm x 20cm)，酶蛋白先用约5倍柱体积的缓冲液洗脱至A595不变后，再用300mL pH=8.10,50mmol和300mL含1mol/LNaCl的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1.2mL/min，5min收集1管。将每管在标准条件下进行活性测定，收集-葡萄糖苷酶酶活性较高的洗脱液。4.1.2.8 Sephacry1 S-200凝胶过滤层析将上步所收集的酶液用聚乙二醇(PEG)包埋法将酶液浓缩至2mL，进行Sephacry1 S-200凝胶过滤层析(1.6cm x 76cm)，用pH=8.10,50mmol Tris-HCI缓冲液洗脱，流速为0.4mL/min，5min收集1管。进行活性测定后收集具有酶活性的洗脱液部分，对其进行SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳)确认纯度。4.1.2.9 SDS-PAGE电泳溶液及胶的配制表4.1 SDS-PAGE电泳溶液及胶的配制 名称配制方法保存条件A液丙烯酰胺 3.00g凝胶浓度30%,交联度2.67%双丙烯酰胺 0.08g4加双蒸水定容至5.0mLB液1.5M pH=8.8 Tris-HCl缓冲溶液4(分离胶缓冲溶液)Tris 18.2g1M HCl调节pH至8.8双蒸水定容至100mLC液0.5M pH=6.8 Tris-HCl缓冲溶液4(浓缩胶缓冲溶液)Tris 1.8g1M HCl调节pH至6.8双蒸水定容至30mL聚合起始剂10%过硫酸铵室温,现配现用0.5g过硫酸铵,加5mL双蒸水溶解聚合促进剂TEMED4电泳缓冲液Tris 9.0g4甘氨酸 43.2gSDS 3g加双蒸水至600mL样品溶解液0.5M pH=6.8 Tris-HCl 3.0mL4甘油 2.4mLSDS 0.48g-巯基乙醇 1.2mL0.5%(W/V)溴酚蓝 1.2ml共计 8.0mL染色液考马四亮蓝R-250 0.125g室温甲醇 113.5mL冰乙酸 23mL加去离子水至250ml脱色液甲醇 25mL室温冰乙酸 37.5mL加去离子水至 500mL 表4.2 分离胶和浓缩胶的配制胶溶液分离胶(8%)浓缩胶(5%)A液5.3mL1.7mLB液7.6mL/C液/1.25mL10(W/V)SDS0.2mL0.1mL聚合起始液0.2mL0.1mL聚合促进剂12L10mL双蒸水6.7mL6.8mL共计20mL10mL4.1.2.10电泳具体操作步骤(l)将配制好的8%的分离胶溶液混合均匀，然后将凝胶溶液迅速倾入制胶玻璃板中，至胶液面距玻璃板凹槽3cm左右，然后在胶面上轻轻铺注1cm高的水层，垂直放置胶板，待胶凝聚后，用滤纸轻轻吸出胶面上的水，注意不要破坏胶面。(2)将配制好的5%浓缩胶迅速注入到分离胶的上层，至液面与玻璃板的凹槽平齐，插入梳子后，在室温下放置20-30min，待其完全凝聚后，小心拔出梳子并倒入电极缓冲液。(3)将蛋白样品加入等体积的样品缓冲液，混匀后在沸水中煮3-5min，冷却后用微量进样器将其加入上样孔中。(4)将电泳槽与电泳仪相连，保持150V的恒定电压进行电泳，直至样品中染料迁移接近至下端时关闭电压，停止电泳。4.1.2.11蛋白质的染色及脱色1. 固定：电泳结束后，取凝胶放入约100mL固定液中，在摇床上室温摇动20min，摇动速度为60-70r/min。固定40 min以上甚至过夜可以进一步降低背景。固定液的配制：依次加入50mL乙醇、10mL乙酸和40mL MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100mL固定液。2. 30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100mL30%乙醇，在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60-70r/min。30%乙醇的配制：70mL MilliQ级纯水或双蒸水中加入30mL乙醇，混匀后即成100mL30%乙醇。3. 水洗涤：弃30%乙醇，加入200mL MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60-70r/min。4. 增敏：弃水，加入100mL银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2min，摇动速度为60-70r/min。银染增敏液(1X)的配制：99mL MilliQ级纯水或双蒸水中加入1mL银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1X)。银染增敏液(1X)配制后需在2h内使用。5. 水洗涤(共2次)：弃原有溶液，加入200mL MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1min，摇动速度为60-70r/min。弃水，再加入200mL MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1min，摇动速度为60-70r/min。6. 银染：弃水，加入100mL银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60-70r/min。银溶液(1X)的配制：99mLMilliQ级纯水或双蒸水中加入1mL银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1X)。银溶液(1X)配制后需在2h内使用。7. 水洗涤：弃原有溶液，加入100mLMilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5min，摇动速度为60-70r/min。注意：水洗涤的时间不能超过1.5min。8. 显色：弃水，加入100mL银染显色液，在摇床上室温摇动3-10min，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70r/min。银染显色液的配制：90mL MilliQ级纯水或双蒸水中加入10mL银染基本显色液(10X),再加入0.05mL银染显色加速液(2000X)，混匀后即为银染显色液。银染显色液配制后需在20min内使用。9. 终止：弃银染显色液，加入100mL银染终止液(1X)，在摇床上室温摇动10min，摇动速度为60-70r/min。终止时有气体产生属正常现象，产生的气体为二氧化碳。银染终止液(1X)的配制：95mLMilliQ级纯水或双蒸水中加入5mL银染终止液(20X),混匀后即为银染终止液(1X)。银染终止液(1X)配制后宜当d使用。10. 水洗涤：弃银染终止液，加入100mL MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5min，摇动速度为60-70r/min。11. 保存：可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。4.1.2.12 SDS-PAGE 测定蛋白质含量（1）按4.1.4进行凝胶电泳（2）迁移率的计算和标准曲线的制作用直尺分别测量各蛋白质区带中心与凝胶顶端的距离。各蛋白质样品区带的迁移率(以相对迁移率Rf表示)按下列公式进行计算：以各标准蛋白质样品迁移率作横坐标，蛋白质分子量的自然对数值为纵坐标作图，即可得到一条标准曲线。（3）分子量测定测得待测蛋白质的迁移率后，由标准曲线上即可查得其分子量的自然对数值，再换算成分子量即可。4.1.2.12葡萄糖苷酶性质的研究（一）-葡萄糖苷酶最佳反应温度将酶液分别在不同的温度下(30，40， 50， 60， 70， 80)，测定-葡萄糖苷酶的活性，将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下-葡萄糖苷酶的剩余酶活性(采用相对酶活性来表示，即在不同温度条件下的剩余的酶活性占其中酶活性的最高值的百分比)。（二）-葡萄糖苷酶最佳反应pH将酶液分别置于不同pH值(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0)的NaH2PO4-柠檬酸缓冲液中进行反应，并测定剩余的酶活性。将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同pH值条件下-葡萄糖苷酶的剩余酶活性(方法同上)。（三）-葡萄糖苷酶的热稳定性将酶液分别置于不同的温度条件下(40，50，60，70，80)保温不同的时间(10min，20min，30min，40min，50min，60min)后，将其迅速放置于冰水浴中，然后测定剩余的酶活性。将最高的酶活力定义为100%，分别计算不同温度条件下-葡萄糖苷酶的剩余酶活性与最高酶活性的比值。（四）不同金属离子对-葡萄糖苷酶活性的影响在-葡萄糖苷酶与其底物进行反应时，分别加入不同的金属离子(Cu2+，Mg2+，Co2+，Na+，Zn2+，Ba2+，Mn2+，K+，Al3+，Fe3+，Fe2+，Hg2+并使金属离子的最终浓度为0.05mol/L，以不加金属离子的反应体系中的酶活性定义为100%，分别测定加入金属离子后各反应体系中-葡萄糖苷酶的剩余相对酶活性。（五）-葡萄糖苷酶对不同物质的作用能力在标准反应条件下，用浓度为10mg/mL的不同物质，如槐角苷、染料木苷和芦丁与-葡萄糖苷酶进行反应，并用HPLC对变化前后的成分进行检测。观测-葡萄糖苷酶对不同物质的作用能力。槐角苷转化体系的洗脱条件：见方法3.1.2.1。芦丁转化体系的洗脱条件59：色谱柱：Hypersil C-18反相柱（100mm4.6 mm i.d.;5m）；流动相甲醇(A)-0.1磷酸水溶液(B)：020min(B:6767)；2025min(B:6762)；2560min(B:6262)；6065min(B:6267)；进样量：10L；流速：1.0 mLmin-1；柱温：25；检测波长355nm.4.2结果与分析4.2.1不同培养时间对产生-葡萄糖苷酶的影响图4.1不同培养时间对产-葡萄糖苷酶的影响从图4.1可知，不同培养天数里，裂褶菌DS1分泌-葡萄糖苷酶有很大差异。随着培养时间的增加，-葡萄糖苷酶的分泌量成上升趋势，从第1d的0.01 U/mL升高到第8 d时的酶活最高值，为0.207U/mL; 此后-葡萄糖苷酶分泌量减少，酶活逐渐降低，在第12d时酶活为0.06 U/mL。从上可知，摇瓶条件下，裂褶菌S. commune DS1产-葡萄糖苷酶的最佳时间是第8d。在培养的早期，裂褶菌通过利用培养基中的速效碳源得到生长，此时由于速效碳源浓度较高，-葡萄糖苷酶的分泌收到抑制; 随着培养的进行，裂褶菌逐渐将速效碳源耗尽，此时不得不通过分泌纤维素酶将培养基中的纤维素降解。纤维素酶分泌量的提高，使得-葡萄糖苷酶酶量也得到提高，在第8d时达到最高值。随后，随着可利用碳源的枯竭，裂褶菌的生长受到抑制，并且出现自溶现象，此时-葡萄糖苷酶酶活逐渐降低。4.2.2 硫酸铵分级沉淀图4.2 -葡萄糖苷酶硫酸铵盐析曲线从图4.2 可知，随着硫酸铵饱和浓度的增加，-葡萄糖苷酶逐渐盐析出来。在饱和浓度为60%80%范围内盐析所得沉淀的-葡萄糖苷酶酶活和总蛋白质得率明显增加，前者从0.031U/mL升高到0.078U/mL，后者从41%升高到100%。因此，可确定-葡萄糖苷酶在粗酶液中的硫酸铵盐析范围是60%到80%饱和度。4.2.3 DEAE-Sepharose F.F. 阴离子交换柱层析将收集的上清液施于经pH=8.10,50mmol/L Tris-HCl缓冲溶液预平衡的DEAE-Sepharose F.F. 层析柱上(1.0cm x 20cm)，酶蛋白先用约100mL柱体积的缓冲液洗脱至A595不变后，再用300mL pH=8.10,50mmol/LTris-HCl缓冲溶液和300mL含1mol/LNaCl的相同缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1.2mL/min，5min收集1管。将每管在标准条件下进行活性测定，收集-葡萄糖苷酶酶活性较高的洗脱液。图4.3 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析图谱从图4.3可知，酶液经在DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析后，共洗脱出3个蛋白峰(I-1,I-2,I-3)。用4.1.2.4所述方法对各蛋白峰进行-葡萄糖苷酶酶活的测定，结果表明峰I-3处有很强的-葡萄糖苷酶，而峰I-1和I-2处则酶活较低。收集第36管到44管的洗脱液进行下一步的分离纯化。4.2.4 Sephacry1 S-200凝胶过滤层析图4.4 Sephacry1 S-200分子筛层析图谱将经DEAE-Sepharose F.F. 阴离子交换柱层析后的酶液用PEG-20000浓缩后，吸取2mL酶液施于经pH=8.10,50mmol/L Tris-HCI缓冲液平衡的Sephacry1 S-200凝胶过滤进行层析，流速为0.4mL/min，5min收集一管（前20mL未收集）。从图4.4可知，在Sephacry1 S-200凝胶过滤层析过程中，共洗脱出4个蛋白峰，其中峰II-1和II-4比较明显，但是没有-葡萄糖苷酶酶活存在。只有峰II-3具有较高的-葡萄糖苷酶活性。收集峰II-3处的洗脱液(35-41管)，用PEG-20000浓缩后进行SDS-PAGE检测，确认其纯度。4.2.5 -葡萄糖苷酶纯化过程总表整个纯化过程的结果如图4.5所示。从该图可知，-葡萄糖苷酶相对于粗酶液（100mL）已被纯化了17.8倍，从酶的酶活力由最初的0.17 U/mg提高到了3.1 U/mg。表4.5 -葡萄糖苷酶纯化过程总表分离步骤step总蛋白Total protein(mg)总酶活Totalactivity(U10-3)比酶活Specificactivity(U/mg-110-3)纯化倍数Purificationfactor得率Recovery(%)发酵液270.0471001701100盐析30.4256008404.854.0DEAE-Sepharose F. F.10.31560015008.733.1Sephacry1 S-2001.324100310017.88.74.2.6 -葡萄糖苷酶性质研究4.2.6.1蛋白质纯度鉴定用SDS-PAGE电泳对经过Sephacry1 S-200凝胶层析的蛋白质进行纯度鉴定，见图4.5所示。由图可知，经过Sephacry1 S-200凝胶层析后出现一条带，说明所分离的-葡萄糖苷酶达到了较高的纯度。1. 标准蛋白质及分子量 2.经Sephacry1 S-200凝胶层析的-葡萄糖苷酶图4.5 -葡萄糖苷酶的SDS-PAGE电泳图4.2.6.2 分子量测定根据实验绘制的标准蛋白质分子量对数值和相对迁移率做图4.6，线性回归后得到的LgMr- Rf标准曲线方程为y = -1.1073x + 5.3246，R2 = 0.9845（y=蛋白质分子量的对数值，x=蛋白质的相对迁移率）。-葡萄糖苷酶经SDS-PAGE分析后Rf值0.62，由此可推出其分子质量是43.2kDa。表4.3 标准蛋白的迁移率标准蛋白standard protein分子量（kDa）Molecular weightRf-半乳糖苷酶-galactosidase1170.278兔磷酸化酶BRabbit phosphorylase b90 0.322鸡卵白蛋白Ovalbumin49 0.533碳酸酐酶Caibonic anhydrase34 0.678-乳球蛋白-lactoglobulin250.867溶菌酶Lysozyme190.956图4.6 SDS-PAGE 电泳测定-葡萄糖苷酶分子量4.2.6.3 -葡萄糖苷酶最佳反应温度将-葡萄糖苷酶置于不同温度下进行酶活测定，结果如图4.5所示。从该图可知，-葡萄糖苷酶的最适反应温度为50。图4.5温度对-葡萄糖苷酶活性的影响4.2.6.4 -葡萄糖苷酶最佳反应pH将-葡萄糖苷酶置于不同pH的磷酸缓冲液中进行酶活测定，结果如图4.6所示。从图4.6可知，-葡萄糖苷酶的最适反应pH为5.0-6.0。图4.6 pH对-葡萄糖苷酶活性的影响4.2.6.5 -葡萄糖苷酶的热稳定性将酶液分别置于不同的温度条件下(40，50，60，70，80)保温不同的时间(10min，20min，30min，40min，50min，60min)后，将其迅速调至酶的最适温度，然后测定剩余的酶活性。结果如图4.7所示，在pH值为5.0的条件下，该酶在40和50时活性是稳定的，酶活没有损失；在60时，酶的半衰期是5min；在70和80保温10min时，相对酶活性变成3.5。图4.7 -葡萄糖苷酶的热稳定性4.2.6.6 金属离子对-葡萄糖苷酶酶活的影响 实验结果见表4.1，从表中可以看出Fe2+对酶有强烈的抑制作用，当反应体系中浓度为50mmol/L时，酶活儿乎被全部抑制; Zn2+、K+、Cu2+和Al3+对酶的抑制性仅次于Fe2+，在浓度为50mmol/L时，酶活分别被抑制成16%、12.8%、10.1%和13.5%；Fe3+对-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，而其它金属离子，如Mg2+、Co2+、Na+、Ba2+、Mn2+和Hg2+对酶活无明显的影响。表4.1金属离子对-葡萄糖苷酶活性的影响化学试剂Chemical浓度Concentration（mmol/L）相对酶活力Relative activity（%）对照/100Cu2+5010.1Mg2+5097.0Co2+5084.8Na+50100Zn2+5016.0Ba2+5095.3Mn2+50100K+5012.8Al3+5013.5Fe3+5060.7Fe2+507.6Hg2+501004.2.6.7 酶水解pNPG动力学常数由米氏方程推出1/V=Km/(Vmax*1/S)+1/Vmax,按Lineweaver-Burk法作图（4.8）。线性回归后得到方程：y = 2.7974x + 0.3075（R2 = 0.999，x为底物