疫荧光细胞化学技术.ppt

第四章 免疫荧光细胞化学技术 免疫荧光细胞化学技术 (immunofluorescence cytochemistry) 采用荧光素标记的已知抗体或抗原作为探针， 检测待测细胞或组织内的靶抗原或抗体，形成带有荧 光素的抗原抗体复合物。利用荧光显微镜观察标本， 根据组织细胞中荧光物质的存在，确定抗原或抗体的 性质并定位，以及利用定量技术测定含量。 荧光抗体法： 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法。 较常用 荧光抗原法： 用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法。 荧光抗体法+荧光抗原法=免疫荧光细胞（组织）技术 免疫荧光细胞化学技术 包括荧光抗体法和荧光抗原法 v免疫荧光细胞化学方法： 直接法、间接法 v免疫荧光染色标本制备： 涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片 经适当固定后染色，或不固定直接染色。 主要内容 一、荧光的特征 二、荧光素 三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光抗体的质量鉴定 五、免疫荧光组化染色方法 六、荧光显微镜 七、非特异性荧光的消除方法 八、免疫荧光细胞化学的对照染色 一、荧光的特征 分子都含有电子，电子在不停地运动着。根据量子理论，运 动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态中，电子遵守一定的规则 ，要以从一个能级向另一能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能 量的吸收或释放。 激发: 当电子吸收能量跃迁到较高能 级，这个过程叫激发。 发射: 以辐射方式跃迁时，能量转化 成相应波长的光，这个过程叫发射 。 v荧光 (fluorescence) 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重 激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短 ，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。 即指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供 给，发光也瞬时停止(一般持续lO-7lO-8s)。 二 荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光素； 必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。 1 具备用于标记抗体的荧光素条件 (1) 应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未 结合的色素及其降解产物易排除。 (2) 荧光效率高，与蛋白质结合后荧光素质量下降不多。 (3) 标记后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。 (4) 结合方法简便而快速，并且较稳定。 (5) 荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。 (6) 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。 (1)异硫氰酸荧光素(FITC) 呈黄色、橙黄或褐黄色粉末或结晶，性质稳定，在室温下能保存2年以 上，在低温中可保存多年。易溶于水和酒精。呈现黄绿色荧光。 在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨 基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。 一个IgG分子最多能标记15-20个FITC分子 2 荧光素的种类： 最大吸收光谱：490495nm， 最大发射光谱：520530nm。 分子量：389.4KD v(2)四乙基罗达明(RB200) 褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。呈 明亮橙红色荧光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下转变成磺酰氯，在碱性条 件下易与蛋白质的赖氨酸一氨基反应结合而标记在蛋白分子上。 最大吸收光谱:570nm 最大发射光谱:596600nm 分子量：580KD (3)四甲基异硫氰酸罗达明(TMRITC) 紫红色粉末，罗达明的衍生物，易溶于水，性质较稳定。呈橙红色荧 光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。它可 用于双标记示踪研究。 最大吸收光谱:550nm 最大发射光谱:620nm (4) 4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）-蓝色荧光 (5) 得克萨斯红（Texas red） (6) 藻红素R (7) 花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5） v四、荧光抗体的质量控制 主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。 1 特异性染色效价测定-与相应抗原标本染色 2 非特异性染色测定-与相类似抗原标本染色 3 吸收试验-在荧光抗体中加入过量抗原，吸收后再用相应抗原 标本染色，结果无明显阳性荧光。 4 F/P比值的测定方法 F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异 性染色质量， F/P=1-2， 过高-非特异染色增强； 过低-荧光很弱，降低敏感性。 荧光抗体的保存 v0-4或-20低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性； v小量分装； v真空干燥后更易长期保存。 五、荧光抗体染色方法 适用标本：涂片、印片、细胞单层培养物或组织切片 ，经适当固定或不固定； 方法：直接法、间接法 阴性对照：采用正常血清染色，结果为阴性。 1 直接法 （1）基本原理 用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧 光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微 镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。 特点：适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗 原如肾、皮肤的检查和研究。但一种荧光抗体只能检查一种抗原 ，敏感性较低 2 间接法 （1）基本原理 先用未标记特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此 抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞 抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。 优点：只需制备一种荧光抗体可检出多种抗原，敏感性较高，能解决一些 不易制备动物免疫血清的病原体（麻疹）等的研究和检查，广泛应用于自身 抗体和感染病人血清的检验。 缺点：非特异性着色机会较多，染色时间长。 阴性对照：用正常血清代替一抗，其余步骤同上。 结果 荧光处即阳性细胞分布部位。 4 双重免疫荧光染色法 适用：在同一细胞组织标本上需要同时显示两种抗原。 方法：如A抗原的抗体- FITC 标记， B抗原的抗体- RB200标记。 (1)一步双染法 将两种标记抗体按适当比例混合（A+B)； 直接法进行染色反应。 (2)二步双染法 先用RB200标记的B抗体,不必洗去； 再用FITC标记的A抗体染色； 按间接法进行。 结果： A抗原呈黄绿色荧光； B抗原呈桔红色荧光。 5 膜抗原荧光抗体染色方法 v原理和步骤：直接法或间接法； v适用：可对活细胞在试管内进行染色，常用于T和B细胞、细 胞培养物、瘤细胞抗原、受体等。 v结果：阳性荧光主要在细胞膜上。 v六、荧光显微镜检查方法 1 荧光显微镜 超高压光源、滤板系统(包括激发和压制滤板)、光学系统和 摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发 射荧光。 （1）光源 光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激励 一般荧光染料的要求。 （2）滤板系统：包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜 和其他中性滤片。是荧光显微镜的重要组成部分，是获得特定 波长光，清晰的荧光影像和发挥显微镜最佳性能之关键。了解 滤片性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的前提和必要条件 。 荧光显微镜的滤片系统 激励法分光镜激发滤光片截止滤光片 用途 UDM400BP330-385 BP360-370 BA420自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色体 VDM455BP400-410BA455儿茶酚胺观察 BVDM455BP400-440BA475芥子喹吖因；染色体 BP420-440硫磺素S：淋巴细胞 吖淀黄素：核酸 BDM500BP450-480BA515异硫氰酸荧光素：荧光抗体观察 BP470-490吖啶橙：DNA，RNA BP420-480金胺结核杆菌 IBDM505PB460-490BA515IF BP470-490 GDM570BP510-550BA590罗丹明 BP530-550四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 BP480-550碘化丙啶：DNA IGDM565BP520-550BA580IF DM600BP545-580BA610IF德克萨斯红：荧光抗体观察 v3 使用荧光显微镜注意事项 v(1)应在暗室中进行检查。汞灯点燃5-15min，光源稳定后观察； (2)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜； (3)检查时间每次以12h为宜，超过90min，超高压汞灯强度逐 渐下降，荧光减弱；标本在紫外线照射3-5min后，荧光减弱；最 多不超2-3h; v(4)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间， 保护光源。光源关闭后必须在30min后才能再启动光源，一天中 应避免数次点燃光源； (5)标本染色后应立即观察。 4 荧光图像的记录方法 v荧光图像：具有形态学特征、荧光的颜色和亮度 v荧光显微镜摄影： 基本同普通显微镜摄影技术 高速感光胶片如ASA200以上或24 以上 半自动或全自动显微摄影系统装置，或CCD与计 算机联接， 将图像存在软盘上 v缺点：紫外光对荧光猝灭作用大（如FITC标记物，紫外光照 射30s，荧光亮度降低50%），曝光速度要求高。 v七、非特异性染色的产生 产生的原因： （1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物. （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与 组织成分结合。 （3）组织中还可能存在类属抗原与相应抗体结合。 （4）制备的免疫血清中混杂抗其他组织成分的抗体。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，过量标记的抗体分子带 过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯，标本固定不当等。 八、 免疫荧光细胞化学的对照染色 为了排除某些非特异性染色，保证免疫荧光细胞化学染 色的准确性，必须在初次试验时进行以上对照