基因诊断常用技术

单击此处编辑母版标题样式 单击此处编辑母版副标题样式 * * 1 1 基因检测常用技术 医学遗传学课程医学遗传学课程 检测技术的发展 l1950s-Rosalind Franklin (1920-1957) discover chemical structure of DNA, starting a new branch of science-molecular biology. lWatson and Crick made a model of the DNA molecule and proved that genes determine heredity. l1957-Arthur Kornberg (1918- ) of the U.S. produced DNA in a test tube. l1966-The Genetic code was discovered; scientists are now able to predict characteristics by studying DNA. This leads to genetic engineering, genetic counseling. l1972-Paul Berg (1926- ) of the U.S. produced the first recombinant DNA molecule. 基因组DNA的基本结构与化学组成 1 1核苷酸核苷酸=1=1磷酸磷酸+1+1五碳糖五碳糖+1+1碱基碱基 核酸分两类核酸分两类 DNA:DNA:碱基碱基A,G,C,TA,G,C,T RNA:RNA:碱基碱基A,G,C,UA,G,C,U 双螺旋结构双螺旋结构： 是由是由2 2条平行的多核苷酸围绕同一中心轴条平行的多核苷酸围绕同一中心轴 构成的。多核苷酸的方向是由核苷酸的磷酸构成的。多核苷酸的方向是由核苷酸的磷酸 二酯键的走向决定，一条从二酯键的走向决定，一条从5 35 3，另一，另一 条从条从3 53 5，两条链呈反向平行排列，彼，两条链呈反向平行排列，彼 此由氢键相连，此由氢键相连，G G与与C C配对，配对，A A与与T T配对。配对。 En promoter 5 E1 GTAG 1 5UT 3 3UT 人类结构基因包括4个区域：编码区：包括外显子、内含子 前导区：编码区上游 尾部区：编码区下游 调控区：包括启动子、增强子等 基因的结构基因的结构 E2 I2 转录起始点 终止密码 AATAAA 转录终止点 1 ggggacagcc agggacaggc agacatgcag ccagggctcc agggcctgga caggggctgc 61 caggccctgt gacaggagga ccccgagccc ccggcccggg gaggggccat ggtgctgcct 121 gtccaacatg tcagccgagg tgcggctgag gcggctccag cagctggtgt tggacccggg 181 cttcctgggg ctggagcccc tgctcgacct tctcctgggc gtccaccagg agctgggcgc 241 ctccgaactg gcccaggaca agtacgtggc cgacttcttg cagtgggcgg agcccatcgt 第一代诊断技术- 限制性片段长度多态性检测（RFLP） 限制性核酸内切酶:识别和切割特异DNA序列； 限制性位点 镰性细胞贫血 第一代诊断技术- Southern杂交 DNA-DNA杂交： Southern杂交基本步骤 Deletion 第一代诊断技术- DNA体外扩增技术 聚合酶链反应（PCR） PCR的特点 检材要求低 操作简便 灵敏度高 特异性较好 PCR的问题 易污染 定量困难 人为因素影响 PCR技术出现的背景 1955年发现 DNA polymerase I； 70年代的初期发现具有实验价值及可得性Klenow fragment 1971年Dr. Kjell Kleppe 提出类似基因修复复制 的PCR原始 雏形概念； 1976年从热泉的细菌(Thermus Aquaticus) 中分离出能耐高 温 Taq polymerase； 1983年Dr. Kary B. Mullis发展出PCR技术，1985年正式发表 了第一篇相关的论文。 1989 年，PCR被列为年度的重要科学发明产物。 PCR 反应参数 预变性：94下预变性5-10min，使模板DNA 完全解链。减少非特 异性配对的引物与模板复合物形成。 循环中的变性：一般变性温度与时间为94 1min。在变性温度下 ,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体 系完全达到适当的温度。扩增片段GC含量的差异是变性温度选定 的主要依据， GC含量高则应相应提高变性温度，反之亦然，但一 般不应低于90。应注意变性温度过高或时间过长都会导致酶活 性的损失。 循环中的复性（退火）：PCR 的一个关键参数，在理想状态下，退火 温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以 减少非特异性结合。如何解决这个矛盾？合理的退火温度从55到 70。退火温度一般设定比引物的Tm4X（C+G）+2X（A+T）或软件计 算 低5,当产物中出现影响实验的非可异性扩增带时,以2为增量 ，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性 产物的形成。退火温度越高,所得产物的特异性越高。 当多重PCR扩增各引物对Tm值出现差异时，如何初步确定退火温 度？一是将退火温度设定为比最低的Tm 低5；二是根据较高Tm 设计的退火温度先进行5 个循环，然后在根据较低Tm 设计的退 火温度进行剩余的循环。 当退火温度较高以致接近延伸温度时，如何设定PCR参数？将退 火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60和94)完成整个 扩增循环, 既省时间又提高了特异性。 退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个 反应体系达到合适的温度，因此 循环中的延伸：延伸反应通常为72,接近于Taq DNA 聚合酶的最 适反应温度75.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20-85.延伸反应时间的长短 取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶 每分钟约可合成1kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性 增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。 一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反 应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为 重要。 循环次数 ：循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30轮循 环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增 加。 如经25-30 轮循环扩增后,产物量仍不够 怎么办？一是增加 模板量重新扩增；二是将扩增的DNA 样品稀释103-105倍作为 模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60 轮循环后 , 扩增水平可达109-1010。 扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式 表示:CCo(1+P)n 。其中：C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。 在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平 坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。 平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续 大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在 平台期前结束反应？，减少非特异性产物。 PCR反应体系的组成与作用 引用分子克隆3提供的PCR 标准反应条件： 模板 1pg-1g 引物 1mol/L DNA 聚合酶15 单位 Mg2 1.5mmol/L dNTPs 200mol/L each KCl 50 mmol/L 模 板 模板的质量是PCR 成功的先决条件，PCR失败首先要考虑模板问题。 所需的最佳模板量取决于基因组的大小 ： 100ng 到1g 的人类基 因组DNA，相当于3104 到3105 个分子，要保证模板中含有一个 单拷贝，对于单拷贝基因,这需要0.1g 的人基因组DNA。 E.Coli 10ng-100ng； LamadaDNA 0.5ng-5ng； Plasmid DNA 0.1ng-10ng。 DNA 样品中有多种污染物会抑制PCR，如SDS，在浓度低至0.01时 就会抑制扩增反应。可以加入一些试剂,如Tween, Nonid, Trition之 类的反过来抑制SDS。 模板量过多则可能增加非特异性产物。 模板DNA提取的方法较多，如酚-氯仿、盐析及固相吸附洗脱等。 引 物 引物合成后通常以干粉形式运输，使用前需用TE或去离子水溶解 ，使其最终浓度为25-100M，以前者为佳，因为水的pH 经常偏 酸，会引起寡核苷的水解。 为保证引物的稳定性，应将干粉和溶解的引物储存在-20。以 大于10M 浓度溶于TE 的引物在-20可以稳定保存6 个月，但 在室温（15到30）仅能保存不到1 周。干粉引物可以在- 20保存至少1 年，在室温（15到30）最多可以保存2 个月 。 引物的浓度会影响特异性 ，最佳的引物浓度一般在0.1 到0.5M 。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。 引物合成量一般以OD值为单位，如PCR工作量较小，如仅仅需要50 -150个反应，只需订购1OD的引物，如超过200个反应，引物量应 不少于2 OD。 DNA聚合酶 考虑两个主要问题：成本与忠实性。 最常用的是Taq DNA聚合酶，但因为其缺少3到5外切核酸酶（ 校正）活性，被看做是低忠实性的聚合酶。 带有3到5外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高忠实度， 但价格昂贵，且大多无 3端加A尾能力，不利于 TA克隆。另外 ，一些高保真酶的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要 的酶的量也要大一些. 反应体系中酶浓度过高会引起大量的非特异扩增，在常规PCR中一 般控制在1-2U。 Mg2 镁离子浓度与酶活性密切相关。Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核 酸骨架相互作用 并能影响Polymerase的活性，因此要记住的是在 调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度。 一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，200M dNTP的典型 PCR起始浓度是1.5mM ，在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可 以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。镁离子浓度 过低则会明显降低PCR扩增效率。 为了确定最佳浓度, 可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预 实验,选出最适的Mg2+浓度。 在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例 如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适 Mg2+ 浓度。 dNTPs 常规PCR扩增中dNTPs浓度是比较稳定的，变化较小，如每种 dNTP的浓度为200M，高浓度的会对扩增反应起抑制作用。 如何提高PCR扩增特异性？ TouchDown PCR ：在PCR 的前几个循环使用严紧的退火条件提高 特异性。循环设在比估算的Tm 高大约5的退火温度下开始，然 后每个循环降低1到2（当然，也可以每几个循环降12） ，直到退火温度低于Tm 5。特异性最高的目的模板会被优先扩 增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 94 5min/ 2cycles（94 30s，60 30s，72 1min）/ 2cycles（94 30s，59 30s，72 1min）/ 20cycles（94 30s，55 30s，72 1min）/ 72 5-10min/4 保温 热启动：聚合酶在室温仍然有活性，在进行PCR 反应配制过程中， 以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的 产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。方法一是在 冰上配制PCR 反应液，并将其置于预热的PCR 仪。这种方法简单便 宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产 物的扩增。二是使用蜡防护层将将反应成分物理地隔离开，在热循 环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。还有一种方 法是使用抗体抑制失活的inactive DNA Polymerase. 当变性温度超 过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。 ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer) Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega) Magnesium wax beads (Stratagene). PCR增强剂：某些模板，尤其是高GC含量的模板，添加影响DNA 熔 解温度的增强剂可以提高产物特异性和产量。包括甲酰胺，DMSO ，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution 可以增强扩增。它 们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA 聚合酶延伸通过二级结构区。但为获得最佳结果，应优化添加剂 的浓度，尤其是会抑制Taq DNA 聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。 dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10% formamide at 5% trimethylammonium chloride 10-100uM detergents such as Tween 20 0.1-2.5% polyethylene glycol (PEG)6000 5-15% glycerol 10-15% single stranded DNA binding proteins Gene 32 protein 1nM E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM 7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP Taq Extender (stratagene) Perfect Match PCR Enhancer(stratagene) Q-solution(Qiagen) 巢式PCR：使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性 和灵敏度。第一轮是15 到20 个循环的标准扩增。将一小部 分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行 15 到20个循环。 PCR反应可能出现的问题及解决办法 不出现预想的扩增条带 ： 模板：模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化 除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失 过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质 量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板 核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理 液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否 因为酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时PCR 时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称， 是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批 号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度 低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引 物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原 液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物 带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带 ，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一 条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 引物使用过程中应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或 长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计 不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高 可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至 使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20l、 30l、50l或100l，应用多大体积进行PCR扩增，是根据 科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20l后，再 做大体积时，一定要重新摸索条件，否则容易失败。 物理原因：温度对PCR扩增来说相当重要。如果变性温度低， 变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可导致 非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高，影响 引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准 的温度计，检测一下PCR仪内的变性、退火和延伸温度，这也 是PCR失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特 异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列 ，其PCR扩增是不会成功的。 出现假阳性扩增： 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源 性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的 序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设 计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是 整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性 可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸 入加样器内或溅出离心管外。除了酶及其他不耐高温的物 质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪 头均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂 用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核 酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互 相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的 产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带： PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者 同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的 出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合 形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR 循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的 酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多 有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时，重新设 计引物。减低酶的量或调换另一来源的酶。降低引物量 ，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或 采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸，也叫两步 法)。 出现片状拖带或涂抹带： PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往 由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过 高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少 酶的量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当 降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 PCR污染及解决对策 污染的预防： 划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全 闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作 在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的 隔离区内进行：1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备；PCR扩 增区，包括反应液的配制和PCR扩增；3. 产物分析区，凝胶电 泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的 隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备 PCR扩增产物分析产物处理。切记：产物分析区的产物 及器材不要拿到其他两个工作区。 分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工 作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定 放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA，1 PCR用水应为高压的双蒸水；2 引物和dNTP用高压的双蒸水 在无PCR扩增产物区配制；3 引物和dNTP应分装储存，分装 时应标明时间，以备发生污染时查找原因。 实验操作注意事项 ：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳 性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不 仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩 增的所有环节都应该注意。 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套； 使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用， 吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染； 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前 稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应 立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面； 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、 引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免 污染，又可以增加反应的精确度； 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管； 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的 可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性； 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容 易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高 压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操 作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产 物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 重复实验，验证结果，慎下结论。 追踪污染源 设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选 择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性 对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染 源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序 列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏 感性极高，可以从其它方法（Sourthern 印迹或点杂交等）检 测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应 包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部 成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非 常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种 或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩 增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂， 在检出污染试剂后，应马上处理。 环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久 又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为 环境污染。1. 模板提取时真空抽干装置；2. 凝胶电泳加样器； 3. 电泳装置；4. 紫外分析仪；5. 切胶用刀或手术刀片；6. 离 心机；7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；此时可 用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签 擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验 ；4）电泳检测结果。8. 气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不 能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶 造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设 计新的引物（与原引物无相关性）。 污染处理 环境污染：1. 稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或 浸泡，使残余DNA脱嘌呤；2. 紫外照射（UV）法：紫外波长（ nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是， 选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度 与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效 ，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成 二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧 啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚 体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点 相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷 的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁 烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和 DNA断裂等）均可终止Taq DNA聚合酶的延伸。这些位点的数量 与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子 上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位 点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤 。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷 贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定 的片段长度限制的原因。 反应液污染：1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合 酶）加入0.5U DNase I，室温反应30 min后加热灭活，然后加 入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需 要知道污染DNA的序列；2. 内切酶法：选择识别4个碱基的内 切酶（如Msp I和Taq I等），可同时选择几种，以克服用一种 酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h 后加热灭活进行PCR ； 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外 照射，注意事项与方法同上述UV照射法；g射线辐射法： 1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0 kGy可破坏104 拷贝的质粒分子，4.0 kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使 PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是通过 水的离子化产生自由基来破坏DNA的。 尿嘧啶糖苷酶（UNG）法： 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。这种dU化的PCR产 物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架 间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从 而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响 。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧 啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。 dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次 进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的 残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活， 因此不会影响含dU的新的PCR产物。 dU引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR产物中仅5端 带dU。UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对 长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低， 而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3端 或近端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。 优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增 在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在， 可彻底消除污染源。 固相捕获法 用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一 生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是 非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有 生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物 和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交 区域。第2）步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩 增产物或重组质粒污染。 RS-PCR法（RNA-specific PCR） 也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法 ，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键 在于设计引物，逆转录引物的3端（A区）有2 0个核苷酸 左右为模板的特异性互不序列，5端2 0个核苷酸（C区） 为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使 cDNA与 多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模 板合成第二链cDNA，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区 和引物C进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA或质粒DNA才不 会被扩增。 抗污染引物法 该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一 区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分 成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也 不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预 期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出 现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用 于环状靶分子系列。 PCR 引物设计的原则和要点 基本原则 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) 具体原则 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大 于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性 较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的 连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加 引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响 。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱 基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在 引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构（包 括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等）也可能导 致PCR 反应失败。5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来 引进修饰位点或标记物。避免3末端富含GC。设计引物时保 证在最后5 个核苷中含有3 个A 或T 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发 反应。上下游引物GC含量不能相差太大 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72左右可使复性条件最 佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T) ，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构 内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低（绝对 值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物，因此设 计5端和中间区为G 或C 的引物。这会增加引物的稳定性和 引物同目的序列杂交的稳定性。引物的3端的G 值过高， 容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产 生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常 进行。引物的3末端形成的二聚体，应控制其G大于- 5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，当在引物5端添加 酶切位点时要考虑：a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点 ，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看 到这样的粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。b)如果 打算PCR 后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱 基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。如果不设计保护碱 基，则多半要用TA 克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq 酶 的选择，这一点在后面再聊。若想在目的序列上附加上并不存在 的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影 响特异性。当计算引物Tm 值时并不包括这些序列，但是应该对其 进行互补性和内部二级结构的检测。 一般说来，引物5端添加无关序列不会影响引物特异序列的 退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可 以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假 定引物5端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下 进行其余的循环。 若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力 将引物和产物保持在mRNA的编码区域内，因为这是生成蛋白 质的独特序列，不像3末端非编码区域与许多其他mRNA