第四章 病毒抗原与抗体检测技术ppt课件

第四章第四章 病毒抗原与抗体病毒抗原与抗体 检测检测检测检测 技技术术术术 预防医学实验中心 柏桦 一、抗原抗体反应 特异性高 可逆 氢键氢键 、范德华华力、静电电吸引力 可见见 抗原-抗体比例适宜，复合物相成团团 二、影响反应的因素 电电解质质 pH7时时，适当电电解质质使其结结合可见见凝集团团或沉淀 温度 37 温度升高，反应应加快 56 酸碱度 pH68 接近等电电点时时易出现现假阳性 第一节 免疫荧光技术 Immunofluorescence assay IFA 能解决：是什么 在哪里 有多少 荧荧光 激发发光谱谱 发发射光谱谱 荧荧光效率 荧荧光寿命 荧荧光猝灭灭 荧荧光偏振 第一节 免疫荧光技术 荧荧光物质质 荧光物质最大吸收光谱最大发射光谱应用 异硫氰酸荧光素 (FITC) 490495nm520530nm （黄绿色 ） FAT、荧光偏振免疫测定 四乙基罗丹明 (RB200) 570575nm595600nm（橙红色 ） FITC的衬比染色或双标 记FAT 四甲基异硫氰酸罗丹 明 (TRITC) 550nm620nm（橙红色）FITC的衬比染色或双标 记FAT 藻红蛋白（PE）490-560nm595nm（红色）双标记FAT、流式细胞术 7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（蓝色）双标记或多标记FAT Eu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定 二、免疫荧光试验 （一）原理 用荧荧光标记标记 物标记标记 病毒抗原或抗体，作为为分 子探针针，检查检查 细细胞或组织组织 内相应应的病毒抗体 或抗原。荧荧光标记标记 物受激发发光照射后发发光， 用荧荧光显显微镜观镜观 察，可确定病毒种类类、定位 、定量。 二、免疫荧光试验 1.制作病毒染色标标本 培养敏感细细胞（细细胞爬片） 种毒 固定、干燥 丙酮酮 二、免疫荧光试验 1.制作病毒染色标标本 临临床样样本（非固型组织组织 ） 涂片 固定、干燥 二、免疫荧光试验 1.制作病毒染色标标本 尸检样检样 品（35mm） 脱水脱色 冰冻冻切片 印片 石蜡固定、脱蜡 丙酮酮固定、干燥 二、免疫荧光试验 2.荧荧光抗体制备备 制备备抗体 用高纯纯度病毒免疫动动物获获取血清，分离IgG ，提纯纯 家兔、绵绵羊、山羊 高特异性 高亲和力 二、免疫荧光试验 2.荧荧光抗体制备备 标记荧标记荧 光素 共价键结键结 合 抗体+荧荧光素 4持续搅续搅 拌数小时时 纯纯化（离心、透析、过滤过滤 ） 二、免疫荧光试验 3.鉴鉴定制成的荧荧光抗体 以FITC为为例 荧荧光（F）蛋白（P）结结合率 调调整制备备液至A280mm=1 2.87A495mm A280mm-0.35A495mm 比值值越大，抗体结结合荧荧光素越多 F/P= 二、免疫荧光试验 3.鉴鉴定制成的荧荧光抗体 测测定抗体效价：双向免疫扩扩散试验试验 抗体特异性：吸收试验试验 、抑制试验试验 抗体特异性染色滴度：倍比稀释释 二、免疫荧光试验 4.荧荧光抗体染色 直接法 二、免疫荧光试验 4.荧荧光抗体染色 间间接法 二、免疫荧光试验 4.荧荧光抗体染色 补补体法 荧荧光标记标记 抗补补体抗体 双标记标记 法 两种荧荧光素抗体检测检测 两种抗原 二、免疫荧光试验 5.设设立对对照 区分特异性和非特异性染色 标标本自发荧发荧 光对对照 荧荧光抗体对对照 阳性抗原对对照 阻断试验试验 三、免疫荧光显微镜技术 荧荧光显显微镜镜 利用一定波长的激 发光对样品进行激 发，产生一定波长 的荧光，对样品结 构或其组分进行定 性、定位、定量观 察检测。 三、免疫荧光显微镜技术 l光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 l滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 l光路：透射光、落射光 l聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 l镜头：消色差镜头 三、免疫荧光显微镜技术 透射光：照明光线从标本下经聚光器透 过标本进入物镜。 落射光：照明光线从标本上经垂直照明 器落射到标本，经标本反射进入物镜。 四、时间 分辩免疫荧光技术 Time-resolved fluoroimmunoassay TR-FIA （一）原理 自发荧光寿命短:1ns10ns 镧系元素寿命长:10s1000s 短寿命荧光完全衰变后再 测定镧系元素特异荧光 铕Ed3+ 锝Tb3+ 钐Sm3+ 镝Dy3+ 四、时间 分辩免疫荧光技术 （二）方法类类型 双抗体夹夹心法 固相抗体和Eu3+标 记抗体与待检抗原 结合，形成固相抗 体-待检抗原-Eu3+ 标记抗体复合物， 酸性增强液下， Eu3+解离，340nm 激发光下发射 613nm荧光。 四、时间 分辩免疫荧光技术 （二）方法类类型 固相抗体竞竞争法 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗 涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与 待检抗原含量成反比。 固相抗原竞竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体， 温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光 强度与待检抗原含量成反比。 第二节 酶免疫技术 Enzyme immunoassay 抗原抗体反应应特异性 酶高效催化反应专应专 一性 第二节 酶免疫技术 酶 底 物显色反应 测定波长 辣根过氧化物酶 HRP 邻苯二胺OPD 四甲替联苯胺TMB 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色 492 460 449 425 642 碱性磷酸酯酶 AP4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 黄色 红色 400 500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色 深蓝色 405 420 -半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧光 黄色 360,450 420 第二节 酶免疫技术 酶标记标记 戊二醛醛交联联法 过过碘酸氧化法 醛醛基 酶蛋白质质 HRP 过过碘酸盐盐 HRP 醛醛基 第二节 酶免疫技术 固相载载体 塑料制品 微粒 膜载载体 NC膜、尼龙龙膜 第二节 酶免疫技术 包被与封闭闭 包被 适宜浓浓度蛋白质质 封闭闭 二次包被填补补空隙 小牛血清 二、酶联免疫吸附试验 Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA 酶标记标记 抗体（抗原）与待测测抗原（抗体）发发 生特异性反应应，加入酶底物，通过过酶对对底物 的显显色反应应，对对待测测抗原（抗体）进进行定位 、定性或定量分析。 间接法 检测检测 抗体 + + + 固相抗原 标标本 酶标标抗体 底物 显显色 双抗体夹心法 检测检测 抗原 + + + 固相抗体 标标本 酶标标抗体 底物 显显色 竞争法 可检测检测 抗原、抗体 YYY + YYY + YYY 参 考 管 酶标抗原 YYY + YYY + YYY 待 测测 管 酶标抗原 抗原 捕获法 检测检测 IgM抗体 + 抗IgM 标标本 抗原 酶标标抗体 显显 色 （含IgM） + 三、免疫酶染色试验 Immunoenzymatic staining test IEST 酶标标抗体（抗原）抗原（抗体）复合物 底物 有色底物 三、免疫酶染色试验 细细胞免疫酶染色 均相酶免疫测测定无需分离游离与结结合 的酶标记标记 物 酶标记标记 物结结合后改变变酶活性 非均相酶免疫测测定需分离游离与结结合的 酶标记标记 物 液相：用二抗或沉淀去除游离酶标记标记 物 固相：ELISA 第三节 放射免疫技术 Radioimmunoassay RIA 利用放射性核素灵敏精确性与抗原抗体反应应 特异性相结结合进进行定量分析 放射免疫 核素标记标记 抗原与未标记标记 抗原竞竞争性结结合特异 性抗体 免疫放射 核素标记标记 抗体结结合待测测抗原 R.S. Yalow 第三节 放射免疫技术 125I、131I、3H、14C 标记标记 纯纯化 鉴鉴定 放射性 免疫活性 第三节 放射免疫技术 第三节 放射免疫技术 放射免疫 竞竞争法 + + + + + + + + BoundFreeAg Ab 6/8=0.75 4/8=0.5 2/8=0.25 1/8=0.125 B/B+F 第三节 放射免疫技术 放射免疫 以未结合的Ag*为F ，Ag*Ab复合物为B ，则B/F或B/(BF) 与Ag的量变存在着 函数关系剂量反 应 曲线 第四节 血清学试验 中和试验试验 血凝/血凝抑制试验试验 补补体结结合试验试验 一、中和试验 neutralization test 体外将病毒与特异性抗体混合并发发生反 应应，再将混合物接种至敏感的宿主体内，然 后测测定残存病毒感染力的方法。 中和抗体 一、中和试验 （一）原理 中和抗体存在使病毒不能吸附和穿入宿主细细 胞，使病毒失去感染力。 当病毒与抗体混合后，接种敏感宿主细细胞再 观观察敏感宿主的情况，即观观察残存的病毒 对对宿主的感染力。 一、中和试验 （二）方法步骤骤 病毒-已知滴度，并有感染力 l测测滴度：细细胞培养，将病毒10倍稀释释接种敏 感细细胞或动动物，观观察CPE或动动物感染情况，确 定滴定终终点以CCID50或LD50表示 l标标准病毒试验浓试验浓 度：100 CCID50/单单位体积积或 100 LD50/单单位体积积 一、中和试验 抗体 l用细细胞培养法测测病毒抗体的滴度：将倍比稀 释释的病毒抗血清液与等量的标标准病毒液混合 ，接种敏感细细胞，观观察CPE。 l病毒抗体滴度的确定：抗血清保护细护细 胞免受 病毒感染的最高稀释释倍数的倒数。 l抗体滴度的含义义：抑制CPE的最高稀释释倍数的 抗血清中，每单单位体积积含一个抗体单单位。 一、中和试验 举举例 如观观察结结果是1：10至1：320抗血清均能抑制 病毒的CPE，也就是当抗血清稀释释到320倍 时时，0.1ml抗血清含有1个抗体单单位。 请问请问 ： 1：160及1：40含有几个抗体单单位？ 标准抗体浓度为20个抗体单位/0.1ml 一、中和试验 宿主 l细细胞培养:观观察CPE和空斑（最理想和常用） l鸡鸡胚：观观察鸡鸡胚的死亡（流感）、绒绒毛尿囊 腔上痘疮疮及血凝现现象（天花、牛痘、HSV） l动动物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙脑脑病 毒、森林脑脑炎病毒 一、中和试验 （二）方法步骤骤 固定血清稀释释抗病毒法 检测检测 病毒及其滴度 固定病毒稀释释抗血清法 检测检测 血清效价 一、中和试验 （二）方法步骤骤 固定血清稀释释病毒法 用中和试验试验 方法鉴鉴定病毒时时，将不同稀释释倍数 的病毒与标标准的抗血清(20个抗体单单位/单单位体积积) 混合、孵育，使二者充分反应应，然后将混合液接种 到敏感宿主体内，观观察试验结试验结 果。 固定血清稀释病毒法 试验试验 材料 l宿主:敏感细细胞和动动物、鸡鸡胚 l标标准抗病毒血清(20个抗体单单位/0.1ml) l病毒分离物 试验试验 步骤骤 l不同浓浓度病毒液与等量的抗病毒血清混合细细胞培养液倍比稀 释释病毒 l不同浓浓度病毒液与等量阴性血清混合 l接种细细胞, 设设正常细细胞对对照，CO2孵箱观观察CPE 中和试验试验 病毒CCID50：当抗血清组组的CCID50与阴性组组之 差的对对数大于2,才说说明中和试验试验 阳性。 固定血清稀释病毒法 阴性血清病毒CCID50的计计算 病毒 稀释度 CPE孔数/ 接种孔数 累计数 CPE数 存活数 CPE阳性比 例 CPE阳性率 （） 10-45/510 010/10100.0 10-54/5 5 1 5/683.0 10-61/5 1 5 1/617.0 10-70/5 0 100/10 0 固定血清稀释病毒法 距离比例（大于50%的CPE阳性率50%）/（大于 50%的CPE阳性率小于50%的CPE阳性率）（8350 ）/（8317）0.5 lgCCID50=大于50%的CPE阳性率血清稀释释度的对对数+距 离比例稀释释系数的对对数=lg10-5+0.5 lg0.1=-5.5, 其反对对数是10-5.5. 阴性血清组组的病毒CCID50为为10-5.5/0.1ml。 固定血清稀释病毒法 阳性血清病毒CCID50的计计算 病毒 稀释度 CPE孔数/ 接种孔数 累计数 CPE数 存活数 CPE阳性 比例 CPE阳性率 （） 10-25/510 010/10100.0 10-33/55 25/771.0 10-42/52 52/729.0 10-50/5 0 100/10 0 固定血清稀释病毒法 距离比例（大于50%的CPE阳性率50%）/（大于50%的CPE 阳性率小于50%的CPE阳性率） （7150）/（7129）0.5 大于50%的CPE阳性率血清稀释释度的对对数+距离比例稀释释系 数的对对数=lg10-3+0.5 lg0.1=-3.5,其反对对数是10-3.5。 阳性血清组组的病毒CCID50为为10-3.5/0.1ml。 因抗血清组组的CCID50为为10-3.5，阴性血清组组的病毒 CCID50为为10-5.5,所以10-3.5-10-5.5=2,表明分离的病毒是与 中和抗体相对应对应 的病毒。 一、中和试验 （二）方法步骤骤 固定病毒稀释释血清法 用于血清抗体滴度的测测量。用已知病毒检测检测 位置 抗体滴度。 100 CCID50/单单位体积积的病毒+连续连续 倍比稀释释血清 孵育1h 接种敏感宿主 观观察不同稀释释度的血清保护护宿主感染病毒的情况 固定病毒稀释血清法 试验试验 材料: l敏感宿主 l标标准滴定的病毒100CCID50/0.1ml l急性期或恢复期血清 试验试验 步骤骤 l细细胞培养液倍比稀释释急性或恢复期血清 l取不同稀释浓释浓 度血清与标标准病毒混合并37孵育1h l取混合液0.2ml接种细细胞,CO2孵箱观观察CPE 50血清中和终终点：50%细细胞不产产生细细胞病变变的血清稀 释释度 固定病毒稀释血清法 恢复期血清中和病毒的结结果 血清 稀释度 CPE孔数/ 接种孔数 累计数 CPE数 无CPE数 CPE阳性 比例 CPE阳性率 （） 1：16(10-1.2)0/40 80/80.0 1：32(10-1.5)1/41 41/520.0 1：64(10-1.8)3/44 14/580.0 1：128(10-2.1)4/48 08/8100.0 固定病毒稀释血清法 l距离比例（50%小于50%的CPE阳性率）/ （大于50%的CPE阳性率小于50%的CPE阳性率） （5020）/（8020）0.5 l50%血清中和终终点的范围围:1:32与1:64之间间。 l中和终终点浓浓度=小于50%的CPE阳性率血清稀释释度的对对数+距离 比例稀释释系数的对对数=lg10-1.5+0.5 lg0.5=-1.65,其反对对 数是1/45 l即50%血清中和终终点为为1:45 含义义：1:45稀释释度的恢复期血清可保护护50%细细胞不产产生细细胞 病变变效应应。 二、血凝/血抑 血凝 HA 血凝抑制 HI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 血凝试验 HA 试验方法 选择96孔板（V型） 病毒液倍比稀释 稀释好后加鸡红细胞 混匀后20室温静置30min +50l PBS 吸出一半 1:2 1:221:231:24 +100l 病毒液 +50l 鸡红细鸡红细 胞 吸弃一半 血凝试验 HA 血凝滴度：以出现现+的稀释释度的倒数为为判定终终 点,为为1个血凝单单位。 凝集效价：能使血球产产生+凝集的病毒最高稀 释释度为为病毒的凝集效价，即0.5ml病毒液含1个血 凝单单位。 三、补体结合试验 补补体：正常人和动动物血清与组织组织 液中的一组经组经 活 化后具有酶活性的蛋白质质，辅辅助抗体介导导免疫溶 菌和溶血作用。对热对热 不稳稳定。 绵绵羊红细红细 胞与抗绵绵羊红细红细 胞抗体（溶血素）作用 形成溶血素致敏的绵绵羊红细红细 胞。补补体可使这这种致 敏红细红细 胞溶解。 补补体可结结合任何病毒抗原抗体复合物 三、补体结合试验 如果反应应系统统中存在待测测的抗体（或抗原），则则 抗原抗体发发生反应应后可结结合补补体；再加入指示系 统时统时 ，而不出现现溶血，是为为补补体结结合试验试验 阳性 。 如果反应应系统统中不存在的待检检的抗体（或抗原） ，则则在液体中仍有游离的补补体存在，当加入指示 系统时统时 会出现现溶血，是为为补补体结结合试验试验 阴性。 三、补体结合试验 有3个系统统： 反应应系统统，即已知的抗原（或抗体）与待测测 的抗体（或抗原）； 补补体系统统； 指示系统统，即SRBC与相应应溶血素，形成致敏 红细红细 胞。 三、补体结合试验 病毒抗原 l从组织培养、鸡胚和动物试验中获得病毒抗原 l应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强 l如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织 作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、 对正常组织成分的非特异性反应 三、补体结合试验 抗体 l免疫用的病毒抗原最好不是同一细胞或动 物，以免发生交叉反应 l血清样品应加热灭活处理，消除补体活性 和非特异性抗补体活性 l人和豚鼠灭活温度为56；家兔和马灭活 温度为65 三、补体结合试验 补体 l检测人和哺乳动物血清应用豚鼠新鲜血清补体 l临用前使用 1SRBC制备 l绵羊颈静脉采血，生理盐水洗涤 溶血素 l用绵羊红细胞免疫家兔获得 l效价达到1:4000可获得 l5630分钟灭活，加甘油后长期保存 稀释液 l含钙镁离子的生理盐水，可维持补体的稳定 三、补体结合试验 溶血素的滴定 l先将溶血素稀释成1:1001:1000,再依次加入溶血素0.1ml，钙 镁盐水0.2ml，1:60补体0.2ml、1绵羊红细胞0.1ml，混匀 后再水浴 l结果判定：完全溶血的试管液体红色透明，离心后见少许细 胞;不溶血的试管液体混浊，放置后见红细胞沉淀，上清无色 透明 l溶血素效价的测定;以完全溶血的最高稀释倍数确定为1个单 位 l本例1个单位的溶血素的效价为1：4000；正式使用2个单位 三、补体结合试验 补体的滴定 补体不稳定，每次试验前需滴定 管号1：60补体钙镁盐水（ml)2U抗原 (ml) 1致敏 SRBC(ml) 结果 10.040.260.10.2不溶 20.060.240.10.2不溶 30.080.220.10.2微溶 40.100.200.10.2微溶 50.120.180.10.2全溶 60.140.160.10.2全溶 70.140.