禽流感h7n9血凝和血凝抑制试验培训课件

禽流感H7 血凝与血凝抑制试验 检测的目的（与H7N9的关系） H7抗体检测为阴性（） 无H7抗体（也就无H7N9抗体) H7抗体检测为阳性（） 分子生物学方法进行病原检测 H7-Ab-HI试验方法 同H5检测方法，附后。 （GB/T 18936-2003） H7-Ab-HI阴阳性判定标准 HI效价4，判定为阳性（ ） HI效价4，判定为阴性（ ） 质量控制 （抗原及标准阴阳性对照） 4U抗原 试剂相关信息 抗原-20冷冻保存 血球4冷藏保存 生理盐水需要调整PH值到7.2-7.4 配制好的4U抗原若当天不能用完，需 冷冻保存，若量大可分装冷冻保存， 再次使用融化即可（冻融可能会影响 效价，每次使用需测4U抗原HA价） 效价判定 非特异凝集ND-HIH7-HI 血凝板竖起后观察 非特异凝集H7-HI 阿氏（Alsevers）液的配制： 试剂用量（g） 葡萄糖2.05 柠檬酸钠0.8 柠檬酸0.055 氯化钠0.42 加蒸馏水至100mL，散热溶解后，调PH=6.1 69kPa 15min高压灭菌，4保存备用。 附录：血凝与血凝抑制试验 1、试验准备 1%鸡红细胞悬液的配制： 采集至少3只SPF公鸡（非免疫的公鸡）或 无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血 液与等体积阿氏液混合（4可保存7天左 右）。配制前用PH 7.2的生理盐水洗涤3 次每次均以离心机上1500-2000r/min (不 得超过2000r/min，否则会导致红细胞破 裂，引起溶血)，离心10分钟左右。洗涤 后，吸取沉积于管底的红细胞泥1mL，混 合于99mL生理盐水中混匀。即得1%RBC 。4可保存3天左右，若出现溶血应重新 采血，重新配制。 4单位抗原的配制 根据血凝试验测新城疫病毒抗原的血 凝效价。如测得病毒原液HA=27 ，即 27 =128，则配制4单位抗原需将病毒 原液稀释1284=32倍 那么如果需要32mL 4单位抗原，需 要（3232=1）mL病毒原液和（32- 1=31）mL生理盐水。 血清中非特异性凝集素的去除： 鸡和火鸡血清极少出现非特异性抑制或凝 集反应，可不进行处理直接进行试验，其 他禽类及哺乳动物血清需进行预处理。 处理方法：56水浴30分钟灭活、RDE（ 受体破坏酶）处理、红细胞吸附、胰酶处 理等。 血凝试验 试验过程 PBS也可用PH 7.0-7.2的生理盐水代替（下同） 附录：血凝与血凝抑制试验 2、血凝试验 血凝试验 结果判定 血凝抑制试验 试验过程 附录：血凝与血凝抑制试验 3、血凝抑制试验 HI注意事项 每次试验需做1份标准阴阳性血清的对照，对照成 立方可判定试验结果。 阴性血清滴度不应超过2log2 阳性血清滴度应与标定的滴度相差不超过1个稀 释度。 每次进行HI试验必须做4U抗原的反滴定，即测一下 4U抗原的HA价是否准确。 如果HA价高1滴度（实际为8U），则HI价1 如果HA价低1滴度（实际为2U），则HI价1 血凝抑制试验 结果判定 Hemagglutinin, HA H1H15 Neuraminidase, NA N1N9 附录：血凝与血凝抑制试验 4、试验原理 HA试验原理 病毒表面血凝素与鸡红细胞表面糖蛋 白受体发生结合而发生凝集 检测病毒的存在，滴定病毒的血凝效 价，大致估计病毒颗粒的数量 （1个 血凝单位106病毒颗粒） 凝 集 红细胞红细胞抗原抗原 凝集反应凝集反应 HA试验原理 红细胞红细胞 不凝集不凝集 不凝集