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生物技术通讯 letters in biotechnology vol22 no1 jan, 2011 综述doi: 103969jissn10090002201101030 蛋白质检测的方法学研究概述 张爱梅 1,2，王荣1，谢华1，谢希晖1，施有琴1，贾正平1，孙坤2 1兰州军区总医院 全军临床药理基地，甘肃 兰州730050；2西北师范大学 生命科学学院，甘肃 兰州730070 摘要蛋白质作为生命活动中起重要作用的生物大分子，与一切揭开生命奥秘的重大研究课题都有密切的关系。 蛋白质的分离与检测是蛋白质研究的主要技术之一。 我们就蛋白质检测的常规方法、电化学检测方法、分子生物学 检测方法、电泳法和质谱法等进行了简要综述。 关键词蛋白质；检测；方法学 中图分类号q52文献标识码a文章编号10090002(2011)01013005 summarization on the methodology study of protein detection zhang aimei1,2, wang rong1, xie hua1, xie xihui1, shi youqin1, jia zhengping1, sun kun2 1 clinical pharmacology base, lanzhou general hospital, lanzhou command, lanzhou 730050; 2 school of life science, northwest normal university, lanzhou 730070; china abstractproteins play a key role in life movement as the big biomolecule to separate and detect the protein are the main technique in protein study it can help to disclose the life mystery in the paper we summarized the different methods for protein detection including routine method, electrochemistry method, molecule biology method, electrophoresis method and mass spectrum method key wordsprotein; detection; methodology 蛋白质是生命的重要物质基础，是与各种形式 的生命活动紧密联系在一起的物质，机体中的每一 个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。 蛋白 质是生理功能的执行者， 是生命现象的直接体现 者，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用、蛋白质构象 等问题， 仍依赖于通过对蛋白质的研究来解决，而 对蛋白质检测方法学的研究，将直接推动蛋白质组 研究。 随着人类蛋白质组计划（hpp）的展开，众多功 能未知的蛋白质相继被发现，开发高通量蛋白质检 测技术显得愈发迫切。 蛋白质组学作为新兴生命科 学正迅速发展，在基础医学、临床医学中已得到广 泛应用，尤其在肿瘤的诊断及药物筛查方面已取得 重大进展。 然而，准确地分离鉴定低丰度蛋白质，也 为蛋白质的检测提出了新的课题。 在此，我们系统 地简要综述蛋白质检测的方法学。 1蛋白质的常规检测方法 蛋白质含量测定是生物化学研究中最常用、最 基本的分析方法之一， 常用的4种古老的经典方法 包括定氮法、双缩尿法（biuret法）、folin酚试剂法 （lowry法）和紫外吸收法1。 近10年，考马斯亮蓝法 （bradford法）也被普遍使用2。 其中，bradford法和 lowry法的灵敏度最高， 比紫外吸收法灵敏1020 倍，比biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复 杂，但较准确，以定氮法测定的蛋白质常被作为其他 方法的标准蛋白质。 11凯氏（kjeldahl）定氮法 kjeldahl在1883年发明了凯氏定氮法，该法是 测定蛋白质最常用的方法， 通过测定样品中的总氮 含量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量。 牛巍等利用此方法测定合格液态奶的蛋白氮， 获得 比较理想的结果3。 该方法的缺点是耗时长，灵敏度 低，样品中的含氮化合物会影响蛋白含量的测定。 12双缩脲法 双缩脲 （nh3conhconh3） 是2分子的脲经 收稿日期20100629 基金项目 国家自然科学基金（20775089） 作者简介 张爱梅（1973），女，博士研究生，讲师 通信作者 王荣，（email）wangrong69163com 130 180左右加热，放出一分子氨后得到的产物。 在强 碱性溶液中， 双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物，称 为双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓 度成正比，可用来测定蛋白质含量，测定范围为1 10 mg蛋白质。 此法的优点是较快速，干扰物质少， 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，主要的缺点是 灵敏度差。 因此，双缩脲法常用于需要快速，但并不 需要十分精确的蛋白质测定。 13folin酚试剂法 lowry在双缩脲试剂的基础上又增加了一种增 强显色的试剂磷钼酸和磷钨酸的混合液，它们 被蛋白质中酪氨酸残基的酚羟基还原，产生深蓝色 （钼蓝和钨蓝的混合物），以增加显色量，从而提高 了检测蛋白质的灵敏度。 该测定法的优点是灵敏度 高，比双缩脲法灵敏得多，可检测的最低蛋白质量 达5 g，通常测定范围是20250 g。 缺点是费时， 要精确控制操作时间。 14考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝法是由bradford于1976年建立的。 该法根据染料考马斯亮蓝g250在酸性溶液中与 蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）及芳香族 氨基酸残基相结合，使染料最大吸收峰的位置（max） 由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变 为蓝色的原理设计的4。 在595 nm下测定的吸光度 值与蛋白质浓度成正比。 此方法的优点是灵敏度 高，测定快速、简便，干扰物质少，主要缺点是用于 不同蛋白质测定时有较大的偏差。 15紫外吸收法 蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残 基使其在280 nm处具有紫外吸收， 其吸光度与蛋 白质含量成正比。 此外，蛋白质溶液在238 nm的吸 光度值与肽键含量成正比。 利用一定波长下蛋白质 溶液的吸光度值与蛋白质浓度的正比关系可以测 定蛋白质含量。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消 耗样品，测定后能回收。 此法的特点是测定蛋白质 含量的准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品 中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质， 会出现较大的干扰。 2蛋白质的电化学检测方法 21蛋白芯片技术 蛋白芯片技术是根据蛋白质蛋白质相互作用 规律而设计的高通量蛋白检测技术平台。 其基本原 理是将各种蛋白质有序地固定于载玻片等各种介 质载体上成为检测的芯片，然后用标记特定荧光物 质的抗体与芯片上的蛋白质相匹配结合，抗体上的 荧光将指示对应的蛋白质及其表达数量。 徐良基等 利用微流控芯片分离检测了几种蛋白， 结果较好， 证实它是一种快速低成本的检测蛋白的方法5。 22电化学免疫传感器 电化学免疫传感器是基于抗原抗体反应，可进 行特异性的定量分析的自给式的集成器件， 抗原、 抗体是分子识别元件，且与电化学传感元件直接接 触，并通过传感元件把某种化学物质浓度信号转变 为相应的电信号6。 谭芸利用金电极构建了检测血 小板源生长因子（pdgf）的电化学免疫传感器7，通 过线性扫描伏安法（lsv）进行电化学信号的检测， 实现了对pdgf的检测。 国内外还有很多学者利用 不同类型的电化学传感器，实现了对不同蛋白质的 检测813。 3蛋白质的分子生物学检测方法 31邻位连接技术 landegren等提出了邻位连接技术（proximity ligation assay，pla）14，这是一种新的蛋白质体外分 析方法。 首先将不同的dna单链分别与蛋白质识 别分子相结合，形成所谓的pla探针。 经过类似酶 联免疫吸附法（elisa）中的温育过程，2条含有不同 dna序列的pla探针会同时结合到同一个待测蛋 白质分子上。 此时，2条探针的dna尾部便在空间 上紧密靠近。 在过量的互补连接序列和dna连接 酶的作用下，2条探针dna尾部的游离5端和3端 与互补序列杂交并发生连接反应，形成一个环状的 蛋白质蛋白识别分子单链dna复合物。 该复合 物量的多少，完全取决于样品中待测蛋白质分子的 量。 采用定量实时荧光pcr对复合物中的单链 dna部分扩增，对连接复合物进行定量，使对蛋白 质的检测转变为对dna的检测， 实现了对痕量蛋 白质的分析15。pla技术的提出，将对复杂蛋白质的 检测转变为对dna的检测， 并凭借其检测灵敏度 高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设 备常见等优势，在蛋白质含量检测、蛋白质间的相 互作用、dna与蛋白质间的相互作用等诸多蛋白质 组学相关领域已取得了很好的研究成果16。 32核酸适体 核酸适体 （aptamer） 是经体外人工进化程序 （selex）1718筛选得到的寡聚核苷酸片段。它是一种 新型的分子识别元件，在蛋白质研究中显示出了良 张爱梅等：蛋白质检测的方法学研究概述 131 生物技术通讯 letters in biotechnology vol22 no1 jan, 2011 好的应用潜力1921。 然而，核酸适体本身不具有显示 信号的功能，须通过其他手段如荧光标记等产生信 号。 目前基于核酸适体对蛋白质的检测方法通常是 直接在核酸适体上共价修饰荧光基团，利用它与靶 分子结合时荧光信号的变化实现对靶分子的检测。 修饰有荧光熄灭基团的核酸适体探针通过静电作 用与阳离子荧光共轭聚合物结合，导致后者荧光熄 灭。 当加入靶蛋白后，核酸适体探针与其特异性结 合， 荧光熄灭基团与阳离子荧光共轭聚合物远离， 聚合物荧光信号得以恢复。 羊小海以核酸适体为识 别分子、阳离子荧光共轭聚合物为报告分子，建立 了一种蛋白质检测新方法2223，采用该方法检测蛋 白质时检测限低，检测线性范围广。 郭秋平等设计 合成了一种发夹型核酸适体，结合聚合酶反应建立 了蛋白质荧光分析新方法21，该法在未直接标记核 酸适体的情况下，通过监测聚合反应进程来检测蛋 白质的浓度。 4电泳法检测蛋白质 电泳法是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸 等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝 胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，在电场的作用下，向其 对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分 离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区 带图谱或计算其百分含量的方法。 41凝胶电泳在蛋白质检测中的应用 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝 胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳，其 中聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）被普遍用于分离蛋 白质。shapiro于1976年首次报道了sdspage系 统，目前，sdspage已成为测定蛋白质亚基组成的 最常用的生物学手段。sdspage中， 各种蛋白的 sds蛋白胶束的电荷量都是近似的，因而蛋白本身 的电荷对蛋白胶束迁移率的影响可以忽视，各种蛋 白的迁移率只和其亚基大大小有关24。 1975年，ofarrall等25根据蛋白不同组分之间 的等电点差异和分子量差异， 建立了iefsds page双向电泳。 双向凝胶电泳是目前蛋白质组学 中比较成熟的方法26。 双向电泳是指第一向为等电 聚焦（等电点信息），第二向为sdspage（分子量信 息）。 一次双向电泳可以分离几千甚至上万个蛋白， 这是目前所有电泳技术中分辨率最高、信息量最多 的技术。 到目前为止，已有多位研究者采用双向电 泳分离蛋白质， 对蛋白质染色法进行比较和分析， 以求获得满足蛋白质组研究所需的适宜的蛋白质 检测法27。 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（nativepage）是 在不加入sds和疏基乙醇等变性剂的条件下，对保 持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。 未加 sds的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子 在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，尤其是在 电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的 生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义。 42毛细管电泳在蛋白质分析中的应用 高效毛细管电泳（hpce）是近年迅速发展起来 的一种新型生物大分子分折及分离技术2930，主要 有毛细管区带电泳（cze）、毛细管等速电泳（cie）、 毛细管等电聚焦（cif）、毛细管凝胶电泳（cge）及无 胶筛分毛细管电泳（ngsce）等多种模式。 对于蛋白 质分子量的测定， 通常可采用毛细管凝胶电泳法， 但该法中凝胶毛细管的制备比较困难，需要专门的 灌胶技术。 相比之下，ngsce法具有向毛细管内注 入筛分介质方便、易于冲洗、毛细管可反复使用，以 及便于实现自动化等优点3133。 本课题组建立了肿 瘤组织中正常组织和肿瘤组织蛋白混合物的毛细 管电泳激光诱导荧光检测（celif）方法，celif 可用于蛋白质差异检测，时间短，效果较好，对活性 蛋白质进行分析体现了其优点： 可提供较强的动 力电压，及强动力下良好的温度稳定性3435。 朱京 妃综述了毛细管电泳的基本原理、分离模式及检测 技术，着重探讨毛细管电泳在蛋白质和多肽检测中 的应用，分析了毛细管电泳在检测蛋白质时存在的 一些问题以及未来的发展，为毛细管电泳在蛋白质 检测中的推广提供了思路36。 一维毛细管电泳由于其应用电压和分离柱长 等限制，不能满足研究人员对复杂蛋白质样品分离 分析的需要。 刘和春等制备了一种新型的中空纤维 接口， 构建了毛细管等电聚焦毛细管无胶筛分电 泳二维蛋白质分离技术平台37，从而实现了将二维 电泳从平板转移到毛细管中38。 5质谱法检测蛋白质 质谱法是目前被普遍使用的蛋白质鉴定手段， 具有灵敏度高及可以提供样品分子的相对分子质 量和丰富的结构信息的优点，可用于大规模高通量 分离分析和检测，因而己成为蛋白质组学鉴定的最 核心技术平台。 cems成功地将毛细管电泳的分析时间短及 132 分离效率高的特点与质量选择检测器（ms）能够提 供分子量和结构信息的特点结合在了一起39，为蛋 白质组研究的发展提供了新的途径。 由于当前蛋白 质组研究中双向凝胶电泳仍然是分离蛋白质的主 导技术，对双向胶上蛋白质点的鉴定，目前普遍认 为采用辅助激光解吸电离飞行时间（malditof） 质谱仪进行肽质谱指纹图 （pmf） 分析是合适的方 法。 itraq技术在蛋白质差异表达定量分析时，可 以同时标记8个样品，一次实验实现对8个蛋白质 的鉴定和定量4041。 用malditof或esimsms 对胶内酶解蛋白质的鉴定也已经被广泛证明是行 之有效的，而现今几乎所有的质谱鉴定都是针对蛋 白质酶解后的肽段。 高通量、高效的分离技术和大 规模、高效率、高准确性地鉴定一个组织或细胞乃 至亚细胞中的全部蛋白质，以及利用稳定同位素标 记方式与多维分离串联质谱实现大规模的蛋白质 定量分析，也已经使得生物质谱成为实现这一目标 的核心分析技术。 目前， 可直接利用基质辅助激光解吸电离飞 行时间质谱（malditofms）、电喷雾四极杆飞 行时间质谱（esiqtofms）、电喷雾离子阱质谱 （esiitms）、傅立叶变换离子回旋共振质谱（fti- crms）等对蛋白和肽类物质进行序列分析4243。 6结语 随着新技术及联用技术的不断发展，检测灵敏 度不断提高，在检测低丰度值蛋白质方面将会有重 大突破。 韩晓霞44将表面增强拉曼散射（sers）技术 与传统的生物学方法结合， 建立了几种基于sers 的蛋白质检测方法， 包括非标记多蛋白质检测、 sers标记的免疫吸附试验、 蛋白质及其配体相互 作用检测等，促进了蛋白质组研究的发展。 纳米技 术在蛋白质检测中的应用得到了飞速发展，其突出 的优点是灵敏度高、特异性强、小型化、生物兼容性 好、小的标记尺寸、生物偶联化学，以及无机纳米粒 子的非乎寻常的光学和电学特性，使得此项技术已 经成为蛋白质检测的独特工具。 周龙45利用核酸和 蛋白质的关系，以纳米粒子为介质，通过检测核酸 的量实现了对蛋白质的超灵敏度检测。 梁文婷以多 酸纳米粒子为分析探针，用于蛋白质及药物小分子 的分析检测46。 当前很多公司正在开发纳米粒子标 记的蛋白质微阵列平台，其中许多已经被消费者使 用。 纳米粒子标签的使用不但能提高蛋白质检测的 灵敏度，而且能降低样品的检出限47。 蛋白质组学研究的进一步深入，将对了解疾病 的发生和药物的筛选起到决定性的作用。 蛋白质组 学研究成功与否，在很大程度上取决于其技术方法 水平的高低。 因此，发展高通量、高灵敏度、高准确 性的研究技术，是现在乃至今后相当一段时间内蛋 白质组学研究中的主要任务。 参考文献 1许家喜蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定j大学 化学, 2009,24（1）:6669 2candiano g, bruschi m, musante l, et al blue silver a very sensitive colloidal coomassie g250 staining for proteome anal- ysisj electrophoresis, 2004,25:13271333 3牛巍,侯彩云,祝晓芳,等三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀法 在液态奶蛋白质检测中适用性研究j中国乳品工业, 2008,36 (9):5961 4bradford m a rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye bindingj anal biochem, 1976,72:248254 5徐良基,贾春平,金庆辉,等基于微流控芯片的一种蛋白检 测方法j功能材料与器件学报, 2005,11(1):117121 6daniel r t, klam t electroche, mical biosensors:recommend- ed definitions and classification jbiosensors bioelectronics, 2001,16(12):121131 7谭芸电化学免疫传感器用于黄曲霉毒素和蛋白质检测的研究 d湖南大学硕士学位论文, 2009 8wei cheng, feng yan, lin ding, et al cascade signal ampli- fication strategy for subattomolar protein detection by rolling circle amplification and quantum dots tagging janal chem, 2010,82(8):33373342 9唐点平,袁若,柴雅琴,等纳米金修饰玻碳电极固载抗体电 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