动物的克隆ppt课件

离体的植物细胞和组织可以通过组织培养技术克隆 成完整的植株，那么动物细胞和组织能否也进行同 样的克隆？ 不能，动物细胞的全能性受到限制，到现在为止 将离体的动物细胞直接克隆成个体还很困难，所以 动物细胞和组织不能进行与植物一样的个体克隆。 2.3 动物的克隆 动物细胞培养：体外培养分散后的单个细胞， 使其得以生存，并保持生命活动现象。像体内一 样呈现一定的组织特性。 动物组织培养：体外培养动物组织，使其维持 生活状态或生长特性。可以伴随组织分化，但最 终成为细胞培养。 动物器官培养：体外培养动物器官原基、部分 或整个器官，使之得以保存、生长。保持器官的 结构、功能及分化能力。 组织培养 一、技术基础 ：动物细胞和组织培养 机械消化或者胰酶消化 动物细胞、组织培养 1、什么方法取得离体的单个动物细胞？ 2、离体的动物细胞能否正常的生活、表现出正 常的生命活动？ 能，在人工控制的培养条件下，生长、分裂乃至 接触抑制和衰老、死亡等，并呈现一定的组织特性。 3、是不是所有的动物细胞都能在离体的情况下表 现出生命活动？ 1、幼嫩细胞（如：动物胚胎或幼龄动物组织、器官） 2、含全部营养物质的液体培养基和适宜的环境条件。 （胰蛋白酶） 7.1951年，海拉细胞系的建成。 6.1950年，人工培养液“199”研制成功 1.1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。 2.1903年，皮肤及白细胞在腹水及血清中存活一个月， 且观察到细胞分裂。 3.1907年，蛙胚神经管在蛙淋巴液中悬浮培养，成功 看到神经末端的阿米巴运动。 4.1912年，鸡胚浸出液对鸡胚心脏组织块进行原代培养 和传代培养。 5.1943年，获得长期培养细胞系（可连续传代）和细胞 克隆。 “组织培养”一词产生 真正的组织培养开始； 创立了悬浮培养法 成功进行了传代培养； 发明了卡氏瓶； 标志着组织培养工作进入 全新阶段 二、动物组织培养技术的发展 2、适宜的环境条件 无菌、无毒环境：加抗生素，定期更换培养液 适宜的温度和pH值：温度：36.50.5 pH值：7.2-7.4 适宜的气体环境：O2（95%空气，用于需氧呼吸） CO2（5%CO2，维持pH） 适宜的渗透压等 （一）培养条件 三、动物细胞培养过程 成分：无机盐、葡萄糖、氨基酸、维生素和动物血清等 1、含全部营养物质的培养液 （二）培养过程 从动物胚胎或幼龄动物组织 切片中取小片样品 转入特殊培养液 原代培养 分装到多个卡氏瓶中 传代培养 单个细胞悬浮液 CO2培养箱中 保温培养 传代培养物 机械消化或胰酶消化 （胰蛋白酶） （二）培养过程 原代培养物 选择或纯化 选择或纯化 细胞系 细胞株 二氧化碳培养箱 通过在培养箱内模拟 形成一个类似细胞或组 织在生物体内的生长环 境，如恒定的pH值（7.2 -7.4）、稳定的温度（ 37C）、较高的相对湿 度（95%）、稳定的CO2水 平（5%），来对细胞或 组织进行体外培养的一 种装置。 细胞株 传代培养物中可连续传代的细胞 如何界定原代培养和传代培养？为什么要传代培养？ 细胞悬 浮液 转入特殊培养液 首次培养 换瓶后培养 原代培养 传代培养 为什么？ 1、离体动物细胞的生长特性： （1）贴壁生长： 悬浮液中分散的细胞紧贴培养瓶内壁才能生长。 （2）接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就 会停止分裂。 （3）正常的生命活动： 生长、分裂、有规律的衰老、死亡等现象，但不 分化。 2、传代培养的原因： 如果不进行传代培养，就会因细胞密度过 大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。 原代培养 传 代 培 养 原代培养物 细胞系：可连续传代的细胞 原代培养物在首次传代 时就成为细胞系。 能连续 培养的 连续细胞系 不能连续 培养的 有限细胞系 四、细胞系、细胞株 （二倍体细胞） （异倍体核型细胞） （1 1）恶性细胞系，异体致瘤）恶性细胞系，异体致瘤 性性 （2 2）保留接触抑制，不致癌）保留接触抑制，不致癌（遗传物质改变（发生在传代培养过程），不死性 ） 2、细胞株： 通过一定的通过一定的选择或纯化选择或纯化方法，从方法，从原代培养物或原代培养物或 细胞系细胞系中获得的中获得的具有特殊性质具有特殊性质的细胞系。的细胞系。 如：单抗细胞株如：单抗细胞株 细胞株一般具有恒定的染色体组型、同工酶类 型、病毒敏感性和生化特性等。遗传物质未改变。 连续细胞株：可连续多次传代的细胞株。 有限细胞株：传代次数有限的细胞株 细胞系：泛指可传代的细胞。 细胞株: 具有特殊性质的细胞系。 细胞的全能性 细胞株、细胞系植物体 培养结果 获得细胞或 细胞产物 快速繁殖、培育 无病毒植株等 培养目的 动物血清 植物激素 培养基特有成分 液体培养基半固体培养基培养基性质 细胞增殖 原理 动物细胞培养植物组织培养比较项目 植物细胞和动物细胞培养的比较 五、克隆培养法（细胞克隆） 1、概念： 把一个单细胞从群体中分离出来单独培 养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术。 2、特点： 遗传性状均一、表现的性状相似，便于研究 异质性细胞系 克隆培养 纯系（克隆） 3、最基本要求: 保证所建成的克隆来源于单个细胞 4、适合于克隆的细胞： 对环境有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞 5、提高细胞克隆形成率的措施： 选择适宜的培养基 添加血清 （胎牛血清） (能促进细胞的生长、增殖和贴附) 以滋养细胞支持生长（经射线照射的小鼠成纤维细胞） 激素刺激（胰岛素等） 使用CO2培养箱，模拟动物细胞的生活环境 连续细胞系、转化或肿瘤细胞 原代细胞、有限细胞系 6、细胞克隆的主要用途： 从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞 系。 用于研究细胞的遗传规律和生理特性。 群体细胞单细胞 六、动物的细胞融合技术及其应用 细胞融合与细胞杂交 细胞A 细胞B 杂交细胞 灭活的病毒 物理法 化学法 仙台病毒 疱疹病毒 新城鸡瘟病毒 细胞融合方法： 化学：PEG（聚乙二醇） 物理：电融合 生物：灭活的病毒（仙台病毒） 仙台病毒 紫外线 丧失感染性 （不感染细胞） 保留融合活性 （诱导细胞融合） 动物细胞融合动物细胞融合 主要用于制备 单克隆抗体 获得杂种植株 用 途 物理、化学方法 （同左） 灭活的病毒 物理（电刺激） 化学（聚乙二醇） 诱导方法 使细胞分散后 诱导细胞融合 去除细胞壁后诱 导原生质体融合 细胞融合的方法 细胞膜的流动性细胞膜的流动性 细胞融合的原理 动物细胞融合植物体细胞杂交 比较项目比较项目 植物、动物细胞融合的比较 单克隆抗体制备过程 注射抗原 B淋巴细胞骨髓瘤细胞 细胞融合、筛选 杂交瘤细胞 细胞培养 再次筛选，继续培养 足够数量的、能产生 特定抗体的细胞群 体外培养 注射到小鼠腹腔 单克隆抗体 两次筛选分别有 什么目的？ 本过程利用了哪些原理？ 第一次筛选得到杂交瘤细胞 第二次筛选出特异抗体的细胞群。 免疫原理、细胞融合原理、动物细胞培养原理 骨髓瘤细胞 选出能产生特定抗体的细胞群、继续培养 体外培养 从培养液 中获取 抗原 淋巴细胞 体内培养 从腹水中提取 单克隆抗体 细胞融合、筛选 杂交瘤细胞 细胞培养 单克隆抗体的优点 特异性强、灵敏度高，可大量制备 单克隆抗体的作用 课本33页 一、动物细胞全能性的表现程度 桑椹胚 八分 裂球 受精卵 二分 裂球 四分 裂球 囊胚 原肠胚 幼体 组织、器官 1、动物的受精卵，卵裂球含有2-8个细胞时，每个 细胞具有全能性。 2、随着胚胎发育的继续，有的细胞只具有分化出各 种组织细胞的潜能，这样的细胞叫多能干细胞。 3、有的细胞只能分化为一种细胞，叫单能干细胞。 受精卵 胚胎干细胞 多能干细胞 单能干细胞 体细胞 2、低等动物细胞：全能性一般容易体现。 1、高等动物细胞 3、癌细胞：仍能逆转为正常细胞。 无论分化还是癌变，变化的都是表现型， 基因组成的完整性可以保留。 一、动物细胞全能性的表现程度 为什么动物细胞很难表现出全能性？ 二、动物难以克隆的根本原因 基因的选择性表达（差异表达），使得细 胞中合成了专一的蛋白质，即动物细胞已经发 生了分化。 分化的细胞，其基因组中的基因不同时进 行活动。 动物基因组 一类基因：维持生存，各种细胞 中都处于活动状态 一类基因：随着组织器官和发育 阶段不同而选择性表达。 细胞的分化使细胞发生了基因的差异表达，有的基因开 放，有的基因关闭，即基因组中基因的活动很不完全， 不能发挥细胞的全能性。 动物细胞难以实现克隆，那么如何实 现动物的克隆？ 多莉的培育用到了哪些技术? 核移植、动物细胞培养、胚胎移植 三、核移植和动物的克隆繁殖 去去 核核注注 核核 重组细胞重组细胞 1、核移植： 利用一个细胞的细胞核（供体核）,来 取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“ 合子”（重组细胞），使发育成一个新的个 体。 胚胎细胞克隆：使用的供体核来自胚胎 体细胞克隆：使用的供体核来自体细胞 1952年，罗伯特.布里格斯： 豹蛙 囊胚细胞核+去核的卵母细胞 发育成个体 1978年，童第周： 黑斑蛙成体红细胞核去核的卵细胞中发育成蝌蚪 2、动物克隆繁殖： 胚胎细胞核移植成功率远高于成体细胞核移植。 体细胞克隆羊成功的分子细胞生物学机理： 1、核移植前对乳腺细胞的营养限制性培养（调节 牛血清浓度）和电脉冲细胞融合技术，有利于核 的变化和细胞融合后基因表达分子开关启动。 2、重组卵细胞最初分裂时，转录并未开始。 3、重组卵细胞的供体核DNA丢失了来源于乳腺细 胞的阻止核基因表达的调节蛋白。 4、开始第三次分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白全 部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，核DNA被重新 编排，胚细胞开始表达自己的基因。 体细胞克隆羊的培育成功，证明了什么？ 高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到 类似受精卵时期的功能。 在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞 核（包括异源的细胞核）发育的作用。 （核质互作） 胚胎细胞核移植成功率远高于成体细胞核移植。 体细胞克隆羊成功的分子细胞生物学机理： 1、核移植前对乳腺细胞的营养限制性培养（调节 牛血清浓度）和电脉冲细胞融合技术，有利于核 的变化和细胞融合后基因表达分子开关启动。 2、重组卵细胞最初分裂时，转录并未开始。 3、重组卵细胞的供体核DNA丢失了来源于乳腺细 胞的阻止核基因表达的调节蛋白。 4、开始第三次分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白全 部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，核DNA被重新 编排，胚细胞开始表达自己的基因。 体细胞克隆羊的培育成功，证明了什么？ 高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到 类似受精卵时期的功能。 在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞 核（包括异源的细胞核）发育的作用。 （核质互作） 体细胞核移植技术存在的问题： 许多克隆动物表现出遗传和生理缺 陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难 ，脏器缺陷，免疫失调等。 3、动物克隆成功的条件： （1）具有包含本物种完整基因组的细胞核的活细胞 如：乳腺上皮细胞； （2）能有效调控细胞核发育