hla测序技术在非亲缘性脐血移植应用价值探讨(1)

HLAHLA 测序技术在非亲缘性脐血移植应用测序技术在非亲缘性脐血移植应用 价值探讨价值探讨(1)(1) 作者：廖灿，杨昕，李焱，黄以宁，许遵鹏，吴洁莹， 汤雪薇，陈劲松，吴韶清 【摘要】1998 年 6 月至 XX 年 7 月，广州脐血库向国内 21 家移植中心 54 例患者提供了非亲缘性异基因脐血。为了 探讨非亲缘性脐血移植供/受者 HLA 等位基因及其亚型与脐 血移植 GVHD 发生率的关系，对 54 例非亲缘性脐血移植病 例中，半年后有反馈随访资料的 48 例，利用盐析或柱提法 提取移植的非亲缘性脐血的 DNA 及移植病例的全血 DNA，采 用 HLA-SBT 方法分别对 HLA-A、B、DRB1 位点进行了高分辨 分型，并与我库脐血收集常规采用的 HLA-SSP（HLA- Sequencingspecificprimers）低分辨结果进行了比较分析。 结果发现，HLA 不合位点不多于 2 个和 HLA 不合位点不少于 3 个的病例 GVHD 的发生率具有统计学显著性差异（P 【关键词】非亲缘性脐血移植；HLA 配型;HLA 测序技术； HLA-SBT；脐血 ClinicalApplicationofHLASequencinginUnrelatedUmbili calCordBloodTransplantation AbstractFromJune1998toJulyXX,Guangzhouumbilicalcord bloodbankprovidedunrelatedumbilicalcordbloodfor54pa tientstomorethan21transplantationcenters.HLAsequenc ing-basedtypingwasusedtore- analyzetheresultsofHLAantigensandallelessoastoinves tigatetherelationshipbetweenHLAallelesandGVHD.Thein formationabout48outof54patientswasobtainedafter6mon thsoffollowup.SBTwasusedtoidentifyHLA- A,B,DRB1allelesin48patientsreceivedtheunrelatedumbi licalcordbloodunits,andtheobtainedresultswerecompar edwiththeresultsofHLA- SSPLowResolutionTyping.Theresultsshowedthatthediffe renceofGVHDincidencebetweenlessthan2mismatchedHLAsi tesandlessthan3siteswasstatisticallysignificant.Int heresultsfromsinglefactoranalysisandhigh- resolutiontypingofHLA- A,BandDRB1alleles,themismatchbetweenHLA-BandHLA- DRB1alleleswasfoundtobeasignificantfactorfortheoccu renceofGVHD.ItisconcludedthatSBTplaysanimportantrol einumbilicalcordbloodtransplantation,andtheincidenc eofGVHDishigherinthetransplantationwithHLA- DRB1allelesmismatching. Keywordsunrelatedumbilicalcordbloodtransplantation; HLAmismatch;HLAsequencing;HLAsequencingbasedtyping; umbilicalcordblood HLA 高分辨分型技术不仅可以对 HLA 血清学配型起到积 极的校正作用，对研究哪些 HLA 等位基因相合可以明显减 弱 GVHD，哪些等位基因不相合可以耐受等方面以及制定相 对个体化的 HLA 配型策略都具有重要的临床应用价值。在 骨髓造血干细胞移植中，HLA 测序分型技术得到了广泛的应 用和发展，在预防 GVHD 方面具有十分重要的意义。本研究 采用以测序为基础的 HLA 分型技术（HLA- sequencingbasedtypingHLA-SBT）对可随访的 48 例非亲缘 性脐血移植病例 HLA 配型结果进行回顾性分析，以探讨 HLA-A/B/DRB1 等位基因匹配程度对非亲缘性脐血移植 GVHD 的影响。 材料和方法 脐血来源 脐血样本全部来自广州脐血库，脐血分离、冷冻、保 存以及相关检测参考相关文献2 。 移植供受体选择 54 例非亲缘性脐血移植供受者样本及随访资料由国内 21 家移植中心提供，其中 6 例待随访，选择 48 例非亲缘性 脐血移植病例进行回顾性分析，移植受者一般情况见表 1。Table1.Generalcharacteristicsof48UCBTrecipients （略） 急性移植抗宿主病（aGVHD）的预防 48 例移植病人均采用环孢霉素甲基强的松龙方案预防 aGVHD。 移植供/受体的 DNA 提取 移植供/受体 DNA 提取均采用 G&TDNA 提取试剂盒。 HLA-SSP 分型 采用 OneLambda 公司的 HLA-SSP 分型试剂盒、 PE9700PCR 仪进行分型，采用 OneLambda 公司提供的 HLA 分 型格局表判读结果。 HLA-SBT 分型 应用 ABIPRISM3100 型测序仪进行分型。DNA4l 与 PCRMix（Forensic 公司提供）16l 混合，再加入金牌酶 l 进行扩增反应。PCR 条件如下：9510 分钟；9620 秒，6030 秒，723 分钟，36 个循环；4forever。取 PCR 产物 5l 在 2%琼脂糖凝胶中电泳，确定是否扩增。向 PCR 产物中加入 3lExoSAP-IT,进行消化反应：3720 分 钟，8015 分钟。消化后产物与 SequencingMix 混合后， 进行测序反应：9620 秒，602 分钟，共 25 个循环。测 序反应产物用 NaOAc/EDTA 去除多余的 SequencingMix，并 用 100%及 80%EtOH 沉淀和纯化 DNA。加入 15l 甲酰胺， 置于 ABTPrism3100 测序仪中进行电泳。利用 MatchTools 及 MTNavigator 软件对电泳结果进行分析，得出 HLA 高分 辨配型结果。 统计学分析 数据用 SPSS 统计软件包处理，行 chi-squaretest 分 析。结果 PCR-SBT 技术分型 48 例非亲缘性脐血移植供受者 HLA-A/B/DR 采用 PCR- SBT 技术分型全部成功，SBT 分型结果在低分辨水平（HLA 基因型星号后 2 位数）与 SSP 分型结果完全一致。48 例非 亲缘性脐血移植供受者中，HLA 等位基因 6/6 相合 4 例（%） ， 5/6 相合 37 例（%） ，4/6 相合 7 例（%） ；HLA 等位基因亚型 匹配 5/6 相合 5 例（%） ，4/6 相合 16 例（%） ，3/6 相合 19 例（%） ，2/6 相合 8 例（%） ，未发现 HLA 等位基因亚型配型 全相合病例。 SBT 分型结果与 GVHD 发生率 48 例非亲缘性脐血移植供/受者 HLA 等位基因分型结果 中，HLA 等位基因匹配 6/6、5/6 和 4/6 位点相合的移植受 者 GVHD 分别发生 4/4 例、18/37 例（%）和 5/7 例（%） ，统 计分析（chi-squaretest） ，HLA 匹配程度与 GVHD 发生率之 间无统计学差异（P） 。48 例非亲缘性脐血移植受者中，植 入 33 例，HLA 等位基因亚型匹配 5/6 相合的 2 例移植病例 均未发生 GVHD，而 4/6、3/6、2/6 位点相合的移植病例 GVHD 发生率分别为%（6/11） 、%（11/12）和%（6/8） ，统计 分析（chi-squaretest） ，HLA 等位基因亚型不合位点不多 于 2 个和 HLA 不合位点不少于 3 个的病例 GVHD 发生率具有 统计学显著性差异（P） 。在 HLA-A 等位基因亚型分型结果 中，HLA-A 等位基因亚型匹配 0/2、1/2 和 2/2 相合病例分 别为 11、28 和 9 例，GVHD 发生率分别为%（3/11） 、 %（16/28）和%（5/9）