常见的生化与分子生物学技术 ppt课件

常见的生化与分子生物学技术常见的生化与分子生物学技术 生物大分子的提取和纯化 电泳技术 PCR技术核酸序列的测定蛋白质相互作用 Agrose PAGE 双向电泳 杂交技术 酶联免疫技术 层析技术、超滤技术、膜技术 检测和纯化 分离 生命现象 生化组分 分析 1、结构与性质 2、功能 3、代谢及其细胞调控 改造利用 生物化学研究技术方法 v经典的研究步骤： 分离生化组分（细胞器和生物 分子）； 分析生化组分的结构； 分析生化组分的功能和代谢（ 合成与分解）及其相互作用。 *3 生物化学研究技术方法 l生物化学研究技术： 分离技术：沉淀、吸附、膜分离（过滤、透析等）、离心 、层析、电泳等； 分析检测技术：电泳、层析、光谱、质谱、电化学技术、 分子标记等。 分子生物学研究技术：基因重组、分子杂交、PCR与反 转录、核酸测序、免疫技术、生物芯片等等。 *4 生物大分子分离纯化的一般步骤和原则 层析法 电泳法 超离心法 透析和超滤 盐析（硫酸铵盐析） 等点电沉淀 有机溶剂沉淀 离心 前处理 粗分级 细分级 材料选择与处理 细胞破碎（机械破 碎、溶账和自溶、 酶解、化学处理） 生物组织 提取液 粗产品结晶 分子大小 溶解度 电荷性质 吸附性质 生物亲和力 依据原理 要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有： p 在水和各种有机溶剂中的溶解性。 p 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子 的稳定性。 p固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 p各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带 电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、 在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。 p其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定 性和对各种化学试剂的稳定性。 p对其他生物分子的特殊亲和力。 分离纯化的一般程序 1、材料的选择和预处理 2、破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器 的分离） 3、分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离 其中前两个阶段为生物大分子分离纯化的前 处理。 生物大分子的浓缩 p沉淀法:在提取液中加入适量的中性盐或有机溶剂 ，使有效的成分变为沉淀，经过离心或过滤收集的 沉淀物，加少量缓冲液溶解后，在经离心出去不溶 物，获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐。 p盐析法：有机溶剂沉淀法；等电点沉淀法；非离子 多聚体沉淀法；生成盐复合物沉淀法；热变性沉淀 法；酸碱变性沉淀法等 。 p 吸附法：将干葡聚糖凝胶加入提取液中，由于凝胶 吸水，提取液的体积可缩小三倍左右。 p 超过滤法：把提取液装入过滤装置， 在空气或氮气的压力下，使小分子物 质通过半透膜，大分子物质留在膜内 。 p 透析浓缩法 p 减压蒸馏浓缩法：将提取液装入减压 蒸馏装置中，在减压真空状态下进行 蒸馏。 p 冰冻干燥法 纯度鉴定 l生物大分子经过分离提纯，最后还要鉴定制品的纯 度。 l蛋白质和酶制品纯度鉴定通常采用的方法有：SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超速离 心沉降分析法等。 l纯的蛋白质在一定条件下进行电泳，将以单一的速 度移动，它的电泳图谱只出现一条带。同样纯的蛋 白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动。 l选用任何单独一种鉴定方法都不能最后确定蛋白质 的纯度，必须同时采用2-3种不同的方法才能确定 。 蛋白质、核酸的定性定量检测 1、蛋白质的测定 凯氏定氮法（含N量 6. 25） 双缩脲法、Folin-酚法 紫外光度法（max=280nm） 离心法、电泳法、层析法 2、酶活力的测定 终点法、动力学法 3、氨基酸的测定 茚三酮法 Sangerf法、Edmam法、DNS法 4、核酸的测定 紫外光度法（max=260nm） 分子杂交法 离心法、电泳法 l核酸的纯度鉴定一般采用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰 胺凝胶电泳，沉降分析和紫外吸收法（A260/A280 ）等方法。 v同蛋白质一样，核酸纯度鉴定也必须采用2-3种方 法才能确定。 电泳基本原理 l电泳是不同的物质颗粒在一定的电场强度下，由于 所带电荷及颗粒大小形状等不同，因此向相反电极 泳动速度不同进而达到分离目的一种方法。 l在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（ 种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在 相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置 上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电 泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 电泳 带电粒子或分子的大小、形状、所带的净电荷多 少等都会影响它们的电泳速度。待分离样品中各 种分子带电性质以及分子本身大小、形状等存在 的差异，使得带电分子的“泳动”速度不同，因 而可以利用电泳技术对生物分子进行分离、鉴定 或纯化。 电泳技术有多种方式，但一般根据有无支持物将 其分为无支持物的自由电泳和有支持物的区带电 泳两大类。区带电泳包括以滤纸作为支持物的纸 电泳、以醋酸纤维素等薄膜为支持物的薄层电泳 ，以及与凝胶（例如琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶） 为支持物的凝胶电泳。 等电聚焦凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、 二维电泳、脉冲场凝胶电泳。 l影响泳动度的因素： 1. 电场强度： l电场强度是指每厘米的电位降，也称电位梯度(电势梯度)。 电场强度越高，则带电颗粒泳动越快。 2. 溶液pH l为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液，溶液 的pH值决定带电颗粒的解离程度，亦即决定其所带电荷的 多少。 3.离子强度（I） 溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清 晰。 4. 电渗 l电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。如纸电 泳时，滤纸吸附OH-离子带负电荷，与纸接触的缓冲液 带正电荷向负极移动，会对颗粒的移动造成不良影响 ，故电泳时，电渗小些为好 5. 温度 电泳时会产生焦耳热，使介质粘度下降，分子运动加快，迁移率 增加，同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，因此电 泳时，要控制电压或电流，也可安装冷却散热装置。 6.支持物 |现代电泳多在固体支持物上进行，使样品中的不同组分形成不同 的区带，称区带电泳。电泳结束后，支持物可以方便地进行染色 等后续处理。 电泳技术分类 |按电泳的原理来分，可分为四种： 区带电泳：电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液体系 中分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。 移界电泳：是Tiselius最早建立的电泳，它是在U 形管中进行的 ，由于分离效果较差，已为其他电泳技术所取代。 等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各组分的区带 相随并形成清晰的界面，并以等速移动。 等电聚焦：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形 成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点pH处聚集成很窄的区 带，且分辨率较高。（表面看与区带电泳相似，但原理不同） DNA的琼脂糖凝胶电泳： l琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子 质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 l核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 lDNA分子的大小： l在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反 比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的 移动距离进行比较，便可测出未知片段的大小。 l但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难 将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因 此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过 此值。 l琼脂糖的浓度：不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖 凝胶进行电泳分离。 2. 琼脂糖凝胶电泳 l核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 F不同构型DNA的移动速度次序为： 共价闭环DNA（cccDNA）直线DNA开环的双 链环状DNA F当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不 能进入胶中，相对迁移率为0（Rf = 0），而同等大 小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进 （Rf0）， 由此可见，这3种构型的相对迁移率主要取决于凝 胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强 度等的影响。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 l聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简 称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺 （简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下 聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此 凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝 胶电泳（简称PAGE）。 l聚丙烯酰胺凝胶有下列优点： 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。 化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。 对pH和温度变化较稳定。 几乎无电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样 品分离重复性好。 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。 凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和 电荷效应为一体，因而较醋酸 纤维薄膜电泳、琼脂糖电 泳等有更高的分辨率。 l聚丙烯酰胺凝胶于琼脂糖凝胶的不同之处： p 分离范围不同 琼脂糖凝胶电泳分离分子量比较大的物质，尤其是核酸；聚丙烯酰 胺凝胶分离分子量较小的物质，如蛋白质，氨基酸等。 p 凝胶配置程序不同 l琼脂糖凝胶在缓冲液中加热融化，在凝固前到入槽中即可；聚 丙烯酰胺凝胶在配置时还要加多种成分，并且对聚合温度也有 一定的要求，否则会影响凝胶孔径的大小。 p 凝胶的厚度不同 l琼脂糖凝胶最薄只能达到；聚丙烯酰胺凝胶可以制成. ，分辨率高。 p 成本不同。 琼脂糖价格便宜；聚丙烯酰胺凝胶价格较高 p 安全性不同。 琼脂糖没有毒性；聚丙烯酰胺凝胶有毒性 l凝胶聚合的原理及有关特性 催化系统常用有两种： l过硫酸氨TEMED化学催化聚合系统 此系统中，四甲基乙二胺（TEMED）称为加速剂，它能 以自由基的形式存在。微量的TEMED的加入，可使过硫 酸氨（APS，引发剂）形成自由基。这些自由基的产生 可以引发丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联反应，形成具 有一定孔径的聚丙烯酰胺凝胶。 l核黄素TEMED光聚合催化系统 此系统中，核黄素经紫外线光解形成无色基，再被痕量氧 氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以 加速聚合，本催化系统主要用用于大孔浓缩胶的配置。 凝胶聚合的原理及有关特性 影响凝胶聚合的因素 AP、核黄素、TEMED：是凝胶聚合不可缺少的试剂，AP应在干燥 、避光的条件下保存，其水溶液应置棕色瓶中，4冰箱贮存，一般 仅能存放一周。TEMED（液状）应密闭贮于4冰箱中。增加AP 和TEMED可加快聚合速率，但过量的AP和TEMED会引起电泳时 烧胶和谱带变形。应选择合适的配方使聚合在40-60min内完成。 pH：碱性条件下聚合快，但碱性过强时胶硬而脆，需高pH时应减 少AP和TEMED用量，制酸性胶可加AgNO3等促进聚合。 温度：温度高聚合快，但高浓度凝胶聚合时易产生小气泡，低温 (5)聚合凝胶会变得脆 而混浊，一般25-35聚合较好。 氧分子：氧分子阻碍凝胶聚合，故不含SDS的凝胶最好先抽真空脱 气，再加引发剂。 PAGE原理 lPAGE据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统两大 类。 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗 粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应； 不连续系统电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓 度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有 电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更 好。 l不连续的聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，利用凝胶层的 不连续性、缓冲液离子的不连续性、PH的不连续性及电 位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相间积聚浓缩 成很薄的起始区带，然后进行分离。 聚丙烯酰胺凝胶分为非变性凝胶和变性凝胶两种。 所谓变性凝胶，即在凝胶中加入变性剂，如尿素、SDS(十二烷基磺酸 钠)、巯基乙醇、DTT等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构， 把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包 围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的 任何电荷。 l 由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超 过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间 原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr 差异将各种蛋白质分开。在蛋白质溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巯 基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。 膜分离基本技术 膜分离与常规的分离技术相比 具有无相变化、能耗低、过程简单、不污染环境等优 点 特别适用于生物物质、酶制剂及同分异构体等的分离 。 *27 膜纵切面模式图 以分离应用领域过程分类 微滤(micro-filtration, MF) 超滤(untra-filtration, UF) 反渗透(reverse osmosis, RO) 透析(Dialysis, DS) 电透析(electro-dialysis, ED) 纳米膜分离(NF) 亲和过滤(affinity filtration, AF) 渗透气化(pervaporation, PV 膜分离基本技术 膜分离过程的推动力是静压差、浓度差或者电位差 ，有的分离过程可能是几种推动力都兼而有之。 膜在分离过程中有三种功能： 物质的识别与透过，这是使混合物各组分之间实现分离 的内在因素 界面作用，以膜为界面将透过液和保留液分为互不混合 的两相 反应场作用，膜表面及孔内表面含有与特性溶质有相互 作用能力的官能团，通过物理作用、化学反应或生化反 应提高膜分离的选择性和分离速度。 *生命科学学院29*29生命科学学院 分离膜 分离膜应具备的基本条件为：好的选择透过性； 良好的分离性能（即截留率高，透过率大）；理 化性能良好；污染小，使用寿命长；价廉易得。 各种分离膜按所使用的材质不同可分为无机材料 膜和有机材料膜。 无机材料膜有陶瓷膜和不锈钢膜， 有机膜多为合成高分子材料膜，主要有纤维素类、 聚矾类、聚烯烃类、聚酞胺类和芳香杂环类等。 *生命科学学院30*30生命科学学院 膜分离基本技术 分离膜 分离膜的性能参数主要有：孔道特征、渗透通量 、截留率和截留相对分子质量等。 孔道特征包括 孔径大小，孔径大小用最大孔径和平均孔径来描述 孔径分布，孔径分布指各种孔径的孔占全部孔的体积 分数。 孔隙率，孔隙率是指孔体积占膜总体积的百分数。 *生命科学学院31*31生命科学学院 透析和超滤 J透析是利用蛋白质等生物大分子不能透过半透 膜，但小分子物质和离子能够通过而进行纯化 的一种方法。这种方法经常被用于去除大分子 溶液中的小分子物质。 J超滤 对透析原理进行了改进，它利用具有一 定大小孔径的微孔滤膜，在常压、加压或减压 条件下对生物大分子溶液进行过滤，使大分子 保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水 过滤出去，从而达到脱盐、浓缩或更换缓冲液 的目的。 透析方法示意图 沉淀与离心 J 沉淀是根据不同蛋白质在特定条件下溶解性不同而对它 们进行选择性沉淀从而达到分离目的的一种粗纯化方法 。它通常用于将目的蛋白从大体积的粗抽取物中沉淀出 来。这种方法既能除去许多杂质，又有浓缩之效。 J 实现选择性沉淀的方法有改变pH 或改变离子强度或者 加入特殊的化合物。无论是哪一种沉淀方法，产生的沉 淀物都需要借助于离心的手段与上清分开。 J 离心方法是根据分子的特征密度来分离大分子。如果一 种颗粒的密度大于其介质溶液的密度，那么这种颗粒有 可能通过溶液发生沉降。颗粒沉降的速度与颗粒与介质 溶液之间的密度之差成正比。任何一种颗粒在离心力作 用下通过溶液发生沉降。 J 差速离心和密度梯度离心 离心机的使用 高速与超速离心机因其转速高，产生的离心力大，使用 不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故， 因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程： 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心 管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各离心机说明书所规 定的范围。 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行， 根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，严禁使用显 著变形、损伤或老化的离心管。 每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转 头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞， 避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护。 *南京农业大学 生命科学学院37 层析技术是利用混合物中各组分的物理化学 性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不 同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过 固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分 离的技术。 层析技术操作简便，样品可多可少，既可用 于实验室的研究工作，又可用于工业生产， 还可 与其他分析仪器配合，组成各种自动分析仪器。 层析 层析法又被称为色谱。所有的层析系统都由两相组成 ：一个是固定相，它可以是固体物质，也可以是固定 在固体物质上的成分；另一个是由可以流动的物质组 成的流动相，如水和各种溶剂。 当待分离样品随着流动相通过固定相时，各组份在理 化性质上的差别使得各自与两相发生相互作用（如吸 附、溶解或结合等）的能力不同，最终导致它们在两 相中的分配不同，而且随着流动相向前移动，各组份 会不断地在两相中进行再分配。 与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受 到的阻力就越小，向前移动的速度越快；反之，与固 定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。经过 分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份， 从而达到分离各组份的目的。 表1 主要的层析方法及其原理 名称分离原理 吸附层析各组份在作为固定相的固体吸附剂表面的吸附能力不同 分配层析各组份在流动相和静止液相（固定相）中的分配系数不同 离子交换层析固定相是离子交换树脂，各组份因所带电荷状况不同与离子交换树脂的 亲和力不同 凝胶层析固定相为多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在通过凝胶时受阻滞 的程度不同 疏水层析固定相为带有强疏水基团的树脂，各组分的疏水性不同，导致其与树脂 的结合能力不同 亲和层析固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此达到和无亲和力的其它组 份分离的目的 层析基本操作过程 装置选择上样和洗脱结果检测 上样均一性 洗脱装置 目的不同 检测方法不同 活性检测 基质均匀性 柱层析的L/d比值 洗脱装置 v 不改变溶剂体系 依靠液面的水位差产生的静压力致使洗 脱液不断流经层析柱 缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小 ，流速也在变小。 改善：蠕动泵或恒流泵 改变溶剂系统 分级洗脱 在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。 缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大 ，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分 中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离 纯化的目的。 递减递增 pH阴离子交换树脂阳离子交换树脂 离子强度疏水层析离子交换层析 改变溶剂系统 梯度洗脱 一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的 盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度 沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一 种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。 注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质 接近的蛋白质。 性能未知样品的蛋白质分离： 改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱 离子交换层析 原 理 l离子交换层析技术是以离子交换纤维 素或以离子交换葡聚糖凝胶为固定相 ，以蛋白质等样品为移动相，分离和 提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖 等的一项技术。 l原理：利用物质的电荷和层析载体的 电荷间的相互作用，进而达到分离纯 化的目的。 选择离子交换剂的一般原则： 根据所带的电荷性质。如带正电荷，应选 择阳离子交换剂；如带负电荷，应选择阴 离子交换剂；如为两性离子，根据其在稳 定pH范围内所带电荷的性质选择。 在分离生命大分子物质时，选用亲水性基 质的交换剂较为合适，它们对被分离物质 的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏 。 离子交换树脂的处理，再生等概念 离子交换层析技术的应用 离子交换树脂分离氨基酸 分子筛示意图 亲和层析示意图 亲和层析 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲 和力而使生物分子分离纯化的层析技术。 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。 主要的有：酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原 与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 在成对互配的生物分子中，可把任何一方作为固定相， 而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析，达到分离纯化 目的。例如，酶与其辅酶是成对互配的，既可把辅酶作为固 定相，使样品中的酶分离纯化，也可把酶作为固定相，使样 品中的辅酶分离纯化。 配基与偶联凝胶的选择与处理 在亲和层析中，作为固定相的一方称为配基(ligand)。 配基必须偶联于不溶性母体(matrix) (又称载体或担体)上 ，常用的载体主要有：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰 胺凝胶、纤维素等。 当用小分子作为配基时，由于空间位阻不易与载体偶联 ，或不易与配对分子载体结合。为此通常在载体和配基之间 接入不同长度的连接臂(space arm)。 偶联时，必须首先使载体活化。即通过某种方法(如溴 化氰法、叠氮法等)为载体引入某一活泼的基团。 亲和层析的操作条件 亲和柱层析装柱方法与凝胶层析相同，层析操作与离 子交换层析相似。但由于亲和层析的对象都是生物分子， 为防止生物大分子变性，常在低温(4)下进行。亲和层析 柱所用的平衡缓冲液应与样品缓冲液一致，pH一般在近乎 中性的范围内。上柱时流速应尽可能缓慢。上柱后，用大 量平衡缓冲液洗去杂质，然后用洗脱液洗脱亲和物。洗脱 结束后，继续用洗脱液洗涤，直至无亲和物为止。最后用 平衡缓冲液使亲和层析柱平衡，即可重复使用。暂时不用 时，亲和层析柱应置于4低温保存。 蛋白质研究方法 假定你发现一种新的蛋白质：蛋白质X 1. 如何得到这种蛋白质? 蛋白质的分离、纯化技术 2. 这种蛋白质的大小？ （SDS-PAGE） 3.它的pI是多少？ （等电聚焦） 4. 其他细胞或其他生物体内是否存在？ （Western印迹） 5. 其一级结构如何？ （序列分析） 6.其三维结构又如何？ X-射线衍射和核磁共振 蛋白质纯化 一、准备工作：要解决三个问题： （1）纯化蛋白质的目的； （2）目标蛋白的测活方法； （3）纯化蛋白质的原料。 二、纯化步骤： （1）破碎细胞或组织（混合和匀浆）； （2）去除残渣（离心）； （3）沉淀/浓缩（硫酸铵或聚乙二醇）； （4）纯化（层析）； （5）鉴定 蛋白质和酶纯化的 常见方法和方案设计 分离纯化蛋白质的各种方法都是利用蛋白质的理化性 质，例如溶解性、质量和形状、表面电荷、表面疏水 性、与特定配体结合的性质等。 常用的方法有：沉淀（溶解性）； 离子交换（电荷） ；聚焦层析（电荷）；凝胶过滤（大小和形状）；疏 水作用层析（疏水性）；亲和层析（与特定配体的特 异性结合）。 蛋白质纯化的准备工作。在进行蛋白质纯化之前首先 要解决三个问题：（1）纯化蛋白质的目的；（2）目 标蛋白的测活方法；（3）纯化蛋白质的原料。 一个典型的蛋白质纯化方案开始于完整的组织，一般 经过四个阶段：（1）破碎细胞或组织（混合和匀浆） ；（2）去除残渣（离心）；（3）沉淀/浓缩（硫酸铵 或聚乙二醇）；（4）纯化（层析）；（4）鉴定，包 括纯度、大小或pI的测定。 蛋白质纯度的鉴定 （1）电泳法：如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦和毛细 管电泳等，纯净的蛋白质电泳的结果应该是一条带。 如果使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则应该特别小心 ，因为SDS能够破坏蛋白质的四级结构，如果一种蛋白 质由不同的亚基组成，则会出现几条带。此外，电泳 法检测蛋白质的纯度时，应取分布在蛋白质等电点两 侧的两个不同的pH 值分别进行检测，这样得出的结论 才更可靠； （2）化学法：N-端测定，C-端测定。纯品蛋白质应该具 有恒定的N-端或C-端组成。如果一种蛋白质只有一条 链组成，则只会检测到一种N-端或C-端氨基酸； （3）仪器法：HPLC或质谱。如果一种蛋白质样品在HPLC 上只表现单一的峰，则可视为其为纯品；如果纯化的 是一种已知蛋白，经质谱分析测定出来的相对分子量 与实际的值一致，那么也可认为它是纯品。 等电聚焦需要在凝胶中加入两性电解质，以在阳极和阴极 之间建立递增的pH梯度，处在其中的蛋白质分子在电场的 作用下迁移，最后各自移动到并聚焦于与其pI相当的pH位 置上。于是通过等电聚焦，不仅可以实现pI不同的蛋白质 之间的分离，而且还可以测定出各种蛋白质的pI 蛋白质一级结构的测定 直接测定法 间接测定法： 先得到某一种蛋白质基因的核苷酸序列，然后根据通 用的遗传密码表间接推导出由其决定的氨基酸序列。 Western印迹 蛋白质组研究的基本技术路线 蛋白质样品的制备 双向电泳图像分析 转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白 混合肽 蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 蛋白质组学(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门 新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞 内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与 修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联 系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。 蛋白质的双向电泳 双向凝胶电泳（2DE）原理: 先根据蛋白质的等电点不同在pH梯度介质中 进行第一次分离，即等电聚焦（isoelectric focusing, IEF），然后根据蛋白质分子量的不同 进行第二次分离，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 完整的实验步骤包括： 样品分离、等电聚焦、平衡、第二向分离、 染色、成像、软件分析、蛋白质鉴定 1.样品制备 样品的制备是实验成败的关键，需根据不同的研究目的来 决定具体的实验方法。 蛋白样品的有效溶解是成功分离蛋白质的最关键的因素之 一。可以根据样品性质的不同，选用具有单一的增溶作用 的溶液，还可用含多种变性剂、去垢剂、还原剂的复杂混 合溶液，以使样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚集体 完全破坏。 制备样品的原则 样品制备步骤越简单越好，避免目的蛋白 的损失或丢失。 裂解细胞或组织要防止蛋白降解。裂解细 胞应在低温下进行(冰水浴或4)，最好用 加有蛋白酶抑制剂的裂解液直接裂解。 样品裂解液应新鲜配制，或分装冻存，而 且要采用高纯度的去离子尿素 蛋白样品应在等电聚焦前新鲜配制，或- 80分装冻存，绝对避免将样品反复冻融 。 通过超离心去除所有颗粒性物质，因为颗 粒性物质或脂会阻塞凝胶孔路。 为了防止蛋白质被修饰，加入尿素后，不 要加热蛋白样品。当样品中含有尿素时， 加热绝对不要超过37.升高温度会使尿素 水解成异氰酸盐(isocyanate),使蛋白发生氨 甲酰化(carbamylation)修饰。 最好用强烈变性剂直接裂解样品，这样可 以使蛋白水解酶立即变性失活。 双向电泳分析中的样品制备 |应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包 括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性 。 |防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 |防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 （如酶性或化学性降解等）。 |完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 |尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保 证待研究蛋白的可检测性。 提高2DE分辨率的策略 首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常 采用pH3-10的胶条 如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶 条 加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率 采用窄pH范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率 第二向采用梯度胶进行分离 去除高丰度蛋白，进行蛋白的fractionation处理,富集低丰 度蛋白 分子杂交技术 分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定 的生物分子的一门技术。 样 品 制 备 电 泳 杂 交 转 膜 结果显示 探 针 制 备 分 子 杂 交 原 理 及 流 程 图 表2 各种印迹技术 印迹类型 转移到膜 上的分子 探针获得的信息 Southern DNA片段 放射性标记的 互补RNA或 DNA 基因结构等 Northern RNA放射性标记的 互补RNA或 DNA 特定RNA的大小、分布 和含量 Western 蛋白质 一级抗体和与 酶偶联的二级 抗体 特定蛋白质的大小、分 布和含量 核酸分子杂交的基本原理 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。 杂交有固一液相杂交和液相杂交。 影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂 交效率 2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5 3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂 交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进 行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交 反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交 液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待 测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在 3542 杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶 液在68杂交 5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序 的总长度 （2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对 杂交率取决于DNA的相对复杂性 6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针 的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分 子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts 溶液或脱脂奶粉 一个理想的标记物应满足 ： (1)标记前后探针基本结构、化学性质相 同; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。 Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA 探针的标记 一、探针的种类 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 核酸分子杂交实验因素的优化 |探针的选择 在大多数情况下，可以选择克隆的DNA或cDNA 双链探针 |在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA单 链探针或RNA探针 |长的双链DNA探针特异性较强，适宜检测复杂 的靶核苷酸序列和病原体，但不适宜于组织原位 杂交 p探针的标记方法 选择什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件 而定； 但还应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等 一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高 在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素 探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统 五、核酸分子杂交实验因素的 优化 p探针的浓度 总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加 在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加 膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为 510ng/ml和251000ng/ml，而原位杂交中，无论 应用何种标记探针，其用量均为0.55.0g/ml 受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影 响 五、核酸分子杂交实验因素的优 化 p杂交率 现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均 在探针过剩的条件下进行 在探针过量的条件下，杂交率主要依赖于探针 长度（复杂度）和探针浓度。 下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列 杂交的情形 t1/2=ln2/kc t1/2半数探针与固定靶序列杂交所需的时间（s） k =形成杂交体的速率常数mol/(Lxntxs)决定于探针长度（L）、探 针复杂度（N）、温度、离子强度、粘度和pH c =溶液中的探针浓度（mol/L） 五、核酸分子杂交实验因素的 优化 杂交最适温度 杂交技术最重要的因素之一 反应温度低于Tm 1015，碱基顺序高度同源的 互补链可形成稳定的双链，错配对减少。若反应温 度再低（Tm-30），虽然互补链之间也可形成稳 定的双链，但互补碱基配对减少，错配对增多、氢 键结合的更弱 最适复性温度（Optimunm renaturation temperature, TOR）：Tor =Tm 25 苛刻复性温度：Ts = Tm (10或15) 非苛刻复性温度：Tns =Tm (30或35) 五、核酸分子杂交实验因素的优化 p杂交的严格性 影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格 性。一般认为在低于杂交体Tm值25时杂交最 佳 p 通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控 制所需的严格性 p 在实际应用中，寡核苷酸探针的最佳杂交温度 必须精确确定。最方便的一种方法是制备一张含 不同稀释度靶DNA和非特异靶DNA（如鱼精或大 肠杆菌DNA）的膜。在不同温度下使膜与探针杂 交，特异靶序列结合探针信号很强，而非特异靶 序列与探针无任何反应的温度就是最适温度 五、核酸分子杂交实验因素的优化 杂交反应时间 在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于 保温时间 一般杂交反应要进行20h左右 推荐用Cot =值来计算杂交反应时间 Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和反 应时间（t）的乘积，实验表明Cot =100时，杂交反 应基本完成 五、核酸分子杂交实验因素的优化 杂交促进剂 惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交 率，对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机 剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍 硫酸葡聚糖、聚乙二醇（PEG）、聚丙烯酸 小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交 五、核酸分子杂交实验因素的优化 Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 l转膜 l封闭 l一抗杂交 l二抗杂交 l底物显色 蛋白质的印迹技术(免疫印迹) 首先将混合蛋白质用PAGE按分子大小 分开，再将蛋白质转移到NC膜上，蛋白质 的位置可保持在胶中的原位上。 与DNA和RNA印迹相似之处 蛋白质的转移只有靠电转移。 蛋白质的检测以抗体作探针。 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶 （HRP）标记第二抗体，底物显色来检 测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发 光剂结合以提高敏感度。 或用同位素标记第二抗体，放射自显影 法检测蛋白区带的信号。 与DNA和RNA印迹不同之处 Western blotting应用 检测样品中的特异蛋白质的存在。 细胞中特异蛋白质的定量分析。 蛋白质分子的相互作用研究。 定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制 的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。 n PCR技术: 加热加热 变变 性性 复复 性性 复 温 DNADNA的变性和复性的变性和复性 加热或强酸、碱性作用加热或强酸、碱性作用 可以使可以使 DNADNA双螺旋的氢双螺旋的氢 键断裂键断裂, ,双链解离双链解离, ,形成形成 单链单链DNA,DNA,这称为这称为 DNADNA的的 变性。变性。 解除变性的条件后解除变性的条件后, , 变变 性的单链可以重新结合性的单链可以重新结合 起来起来, ,形成双链形成双链, ,其原有其原有 的特性和活性可以恢复的特性和活性可以恢复, , 这称这称DNADNA复性复性, , 也叫退火也叫退火 。 PCR技术与体内DNA复制的区别： 1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需 要； 2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用 TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶 在高温时会变性； 3. PCR一般要经历三十多次循环，而生 物体内DNA复制需要生物体自身的复制 。 对标本的纯度要求低 不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗 制品及总 RNA 均可作为扩增模板 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽 液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩 增检测 PCR技术的特点 简便、快速 PCR反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶， 一次性地将反应液加好后，即在DNA 扩增 液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应， 一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物 一般用电泳分析，不一定要用同位素，无 放射性污染、易推广 PCR技术的特点 灵敏度高 FPCR 产物的生成量是以指数方式增加 的，能将皮克 ( pg=10-12 ) 量级的起 始待测模板扩增到微克( ug=10-6)水平 F从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 F在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU (空斑形成单位) F在细菌学中最小检出率为3个细菌 PCR技术的特点 PCR原理 5 5 3 3 d.NTPs 耐热DNA聚合酶 引物 53 53 53 53 53 53 53 53 添加反应混合液 及样本 变性 53 53 53 53 53 53 退火 加入试管中 延伸 53 53 53 53 继续延伸 53 53 5 5 Taq Taq 3 53 Taq Taq 5 5 循环 PCR原理 53 5 3 5 35 3 5 53 3 53 5 3第二个循环 4个拷贝 第三个循环 8个拷贝 5 35 3 53 5 3 53 5 3 53 5 3 53 5 3 53 35 53 5 3 53 5 3 第n个循环 2n个拷贝 PCR原理 n指数增长期 n线形增长期 n平台期 循环数 # 理论值 实际值 Log 产物DNA PCR过程的实时监测 7272 94945555 PCRPCR循环循环 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 标准的PCR反应体系 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L PCR反应五要素 引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP ） 模板 （template） Mg2+ （magnesium） PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(1)(1) 模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物 BufferBuffer 预变性预变性 模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物 BufferBuffer TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 9494 o o C5C5 2 2 基本过程基本过程 PCRPCR技术的基本过程技术的基本过程(2)(2) Taq Taq 酶酶 模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物 BufferBuffer 循循 环环 仪仪 9494 55 55 72 72 Taq Taq 酶酶 模板模板DNA DNA dNTP dNTP 引物引物 BufferBuffer 72 72 5 57 min7 min PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 灵敏度高 1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6) 水平 2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 3.病毒检测的灵敏度可达3个RFU 4.细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 1.一次性加好反应液，24 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA 引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链 做引物，用 PCR就可将模板DNA在体 外大量扩增 引物设计引物设计： （1)1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无序列应位于高度保守区，与非扩增区无 同源序列。同源序列。 （2 2）引物长度以）引物长度以15-40 15-40 bpbp为宜。为宜。 （3 3）碱基尽可能随机分布，）碱基尽可能随机分布，G+CG+C占占50-60%50-60%。 （4 4）引物内部避免形成二级结构。）引物内部避免形成二级结构。 （5 5）两引物间避免有互补序列。）两引物间避免有互补序列。 （6 6）引物）引物33端为关键碱基；端为关键碱基；55端端无严格限无严格限 制。制。 标准的PCR反应体系 F10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10 100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul 2 2）循环参数）循环参数 (1)(1)变性变性 使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 9595 o o C 20-30C 20-30秒秒 (2) (2) 退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GCGC含量决定。含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结增加温度能减少引物与模板的非特异性结 合合; ;降低温度可增加反应的灵敏性。降低温度可增加反应的灵敏性。 （3 3）延伸）延伸 70-7570-75 o o C C， 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定 （4 4）循环次数）循环次数 主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度的浓度 一般为一般为25-3525-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率