粪便细菌学规范

粪便细菌学检验操作规范粪便细菌学检验操作规范 实验室常规检查是细菌培养，沙门氏菌、志贺氏菌、邻单胞菌实验室常规检查是细菌培养，沙门氏菌、志贺氏菌、邻单胞菌 和气单胞菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠杆菌作为实验室常规培养和气单胞菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠杆菌作为实验室常规培养 的主要腹泻病原菌。的主要腹泻病原菌。 一一 、标本采集与运送：、标本采集与运送： 1标本采集标本采集 （1）标本采集尽可能在发病早期和应用抗菌药物治疗之前。在不同）标本采集尽可能在发病早期和应用抗菌药物治疗之前。在不同 的时间采集的时间采集 23 份标本可以提高致病菌的分离率。份标本可以提高致病菌的分离率。 （2）自然排便采集粪便标本时，取有脓血、粘液、组织碎片部分的）自然排便采集粪便标本时，取有脓血、粘液、组织碎片部分的 粪便粪便 13g。液体粪便则取絮状物，一般取。液体粪便则取絮状物，一般取 13ml，直接装入粪便，直接装入粪便 容器或保存液或运送培养基中送检。容器或保存液或运送培养基中送检。 （3）直肠拭子采集粪便标本，检查带菌者时可以采取肛拭（棉拭先）直肠拭子采集粪便标本，检查带菌者时可以采取肛拭（棉拭先 用保存液或增菌培养基湿润）用保存液或增菌培养基湿润） ，深入肛门内，深入肛门内 710cm 除采样，不能及除采样，不能及 时接种时，应将标本放入保存液内。时接种时，应将标本放入保存液内。 (4)容器应清洁、带盖、广口的（不宜使用纸盒）容器应清洁、带盖、广口的（不宜使用纸盒） 、送检的标本中不、送检的标本中不 能加入防腐剂。能加入防腐剂。 2 标本运送标本运送 （1）粪便标本应尽快送检，室温条件下不能超过）粪便标本应尽快送检，室温条件下不能超过 2h。如不能及时。如不能及时 送检可加入送检可加入 pH7.0 的磷酸盐甘油或转运培养基，但不宜超过的磷酸盐甘油或转运培养基，但不宜超过 24h。 使用改良使用改良 Cary-Blair 培养基时，不能运送培养志贺氏菌的标本。培养基时，不能运送培养志贺氏菌的标本。 （2）直肠拭子采集的标本必须置入运送培养基或）直肠拭子采集的标本必须置入运送培养基或 GN 肉汤中送检，肉汤中送检， 转运时间不宜超过转运时间不宜超过 2h。 （3）高度怀疑霍乱弧菌感染的标本运送必须符合特殊标本的安全要）高度怀疑霍乱弧菌感染的标本运送必须符合特殊标本的安全要 求。求。 （4）直肠活检标本用粪便容器送检，内盛少量无菌蒸馏水以防止沉）直肠活检标本用粪便容器送检，内盛少量无菌蒸馏水以防止沉 淀。淀。 3标本保存标本保存 不能及时检验的标本通常不能及时检验的标本通常 4-6保存，用磷酸缓冲盐甘油溶液保保存，用磷酸缓冲盐甘油溶液保 存培养沙门氏菌和志贺氏菌的标本，保存培养弯曲杆菌和弧菌的标存培养沙门氏菌和志贺氏菌的标本，保存培养弯曲杆菌和弧菌的标 本，需加本，需加 CaCl2(100mg/L)。 二、标本镜检二、标本镜检 粪便标本直接镜检找到大量多核白细胞，提示侵袭性致病菌感粪便标本直接镜检找到大量多核白细胞，提示侵袭性致病菌感 染。如果是由肠道菌群紊乱引起的腹泻，革兰氏染色结果可以提示染。如果是由肠道菌群紊乱引起的腹泻，革兰氏染色结果可以提示 是酵母菌还是葡萄球菌感染。是酵母菌还是葡萄球菌感染。 2. 革兰氏染色革兰氏染色 制备一张薄的粪便涂片，采用常规革兰氏染色方法。镜下观察是否制备一张薄的粪便涂片，采用常规革兰氏染色方法。镜下观察是否 有大量有大量 WBCs，成丛的革兰氏阳性球菌，酵母菌。，成丛的革兰氏阳性球菌，酵母菌。 3.水样粪便的标本，采用悬滴法暗视野（或相差显微镜）镜检，如水样粪便的标本，采用悬滴法暗视野（或相差显微镜）镜检，如 发现细菌呈穿梭状极活泼的运动，则考虑为弧菌感染。加入发现细菌呈穿梭状极活泼的运动，则考虑为弧菌感染。加入 O1 群群 霍乱弧菌诊断多价血清或霍乱弧菌诊断多价血清或 O139 血清，显微镜下观察若运动停止则血清，显微镜下观察若运动停止则 为抑动试验阳性。为抑动试验阳性。 采用悬滴法镜检发现投镖式或螺旋式运动的细菌，革兰阴性弧形、采用悬滴法镜检发现投镖式或螺旋式运动的细菌，革兰阴性弧形、 S 形或螺旋形的小杆菌，提示弯曲杆菌感染。形或螺旋形的小杆菌，提示弯曲杆菌感染。 三、细菌培养及培养基的选择三、细菌培养及培养基的选择 1腹泻病原菌常规培养腹泻病原菌常规培养 对患者粪便标本进行腹泻病原菌常规培养，包括沙门氏菌、志贺氏对患者粪便标本进行腹泻病原菌常规培养，包括沙门氏菌、志贺氏 菌、致泻性大肠杆菌、邻单胞菌、气单胞菌，致病性弧菌。此外，菌、致泻性大肠杆菌、邻单胞菌、气单胞菌，致病性弧菌。此外， 也包括可引起菌群失调的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和酵母菌。也包括可引起菌群失调的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和酵母菌。 粪便标本至少应接种血平皿、粪便标本至少应接种血平皿、HE（XLD 或或 SS） 、EMB（或（或 MAC 或中国兰）等培养基。沿海地区还需增加或中国兰）等培养基。沿海地区还需增加 TCBS 琼脂培养基。琼脂培养基。 补充说明：补充说明： （1）SS 培养基对部分志贺氏菌有抑制作用。培养基对部分志贺氏菌有抑制作用。 （2）常用的肠道选择性培养基（如）常用的肠道选择性培养基（如 SS 等）对气单胞菌、邻单胞菌等）对气单胞菌、邻单胞菌 有抑制作用，初次分离时应接种血平皿和有抑制作用，初次分离时应接种血平皿和 MAC。 （3）若用）若用 EMB（伊红美兰）（伊红美兰） 、MAC（麦康凯）等培养基培养后，（麦康凯）等培养基培养后， 未检出常见致病菌，但感染性腹泻症状明显，可重新采集粪便标本未检出常见致病菌，但感染性腹泻症状明显，可重新采集粪便标本 接种接种 GN 肉汤，肉汤，35培养培养 4-6h，再转种，再转种 HE（肠道琼脂）等培养基，（肠道琼脂）等培养基， 进一步分离培养。进一步分离培养。 （4）如怀疑沙门氏菌感染，可先用）如怀疑沙门氏菌感染，可先用 SF 肉汤（亚硒酸盐增军液）肉汤（亚硒酸盐增军液） ， 以提高检出率。以提高检出率。 （5）正常人体肠道内可以存在金黄色葡萄球菌，因此只有每克粪便）正常人体肠道内可以存在金黄色葡萄球菌，因此只有每克粪便 细菌数达到细菌数达到 105CFU 时才有临床意义。时才有临床意义。 （6）气单胞菌能够在常规的鉴别培养基如）气单胞菌能够在常规的鉴别培养基如 MAC 和和 EMB 上生长，上生长， 但选择性培养基更有助于检出气单胞菌。选择性培养基：每但选择性培养基更有助于检出气单胞菌。选择性培养基：每 10ml 的的 BAP（血琼脂平板）培养基加入（血琼脂平板）培养基加入 10mg 氨苄西林（氨苄西林（BAP-AMP） 。 （7）邻单胞菌可以在一些常规鉴别培养基如）邻单胞菌可以在一些常规鉴别培养基如 MAC 或或 HE 生长，但生长，但 选择性培养基更有助于检出邻单胞菌。选择性培养基：选择性培养基更有助于检出邻单胞菌。选择性培养基：IBB 琼脂琼脂 （肌醇（肌醇-亮绿亮绿-胆盐琼脂）胆盐琼脂） 。 2腹泻病原菌的增菌培养腹泻病原菌的增菌培养 早期培养物传代培养后使用增菌肉汤培养，能提高低数量菌的检出早期培养物传代培养后使用增菌肉汤培养，能提高低数量菌的检出 率。常用增菌液有：率。常用增菌液有： GN 肉汤：用于沙门氏菌和志贺氏菌的增菌培养，严格保证培养肉汤：用于沙门氏菌和志贺氏菌的增菌培养，严格保证培养 4- 6h 后即进行传代。后即进行传代。 SF 肉汤：主要用于沙门氏菌的增菌培养，经肉汤：主要用于沙门氏菌的增菌培养，经 36培养培养 24h 后，接后，接 种鉴别培养基进行分离培养。种鉴别培养基进行分离培养。 TT 肉汤：主要用于沙门氏菌的增菌培养，但不包括伤寒沙门氏菌和肉汤：主要用于沙门氏菌的增菌培养，但不包括伤寒沙门氏菌和 副伤寒沙门氏菌，培养副伤寒沙门氏菌，培养 12h 后尽快传代。后尽快传代。 碱性蛋白胨水：主要用于弧菌增菌，碱性蛋白胨水：主要用于弧菌增菌， 35-37培养培养 5-8h 后，传代到后，传代到 TCBS 平板上培养。平板上培养。 四、培养物鉴定四、培养物鉴定 1、志贺氏菌的鉴定、志贺氏菌的鉴定 志贺氏菌属包括志贺氏菌属包括 4 个种即痢疾志贺氏菌（个种即痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae） 、福氏志、福氏志 贺氏菌（贺氏菌（S.flexneri） 、鲍氏志贺氏菌（、鲍氏志贺氏菌（S.boydii） 、宋内氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌 （S.sonnei） 。志贺氏菌血清学分群分为。志贺氏菌血清学分群分为 A、B、C、D 四群。目前，四群。目前， A 群含有群含有 15 个血清型，个血清型，B 群含有群含有 8 个血清型（前个血清型（前 5 个血清型又进一个血清型又进一 步分为步分为 11 个亚型）个亚型） ，C 群含有群含有 19 个血清型，个血清型，D 群只含有群只含有 1 个血清型。个血清型。 对于肠道培养基上可疑为志贺氏菌的菌落，首选鉴定试验：赖氨酸对于肠道培养基上可疑为志贺氏菌的菌落，首选鉴定试验：赖氨酸 脱羧酶试验、动力试验、葡萄糖产气试验、粘液酸盐试验、克氏柠脱羧酶试验、动力试验、葡萄糖产气试验、粘液酸盐试验、克氏柠 檬酸盐试验、乙酸盐实验。志贺氏菌上述这檬酸盐试验、乙酸盐实验。志贺氏菌上述这 7 个试验均为阴性。志个试验均为阴性。志 贺氏菌还必须进行血清学鉴定，可使用玻片凝集方法。但对于生化贺氏菌还必须进行血清学鉴定，可使用玻片凝集方法。但对于生化 试验符合志贺氏菌而血清凝集试验弱阳性或不凝集时，应制备生理试验符合志贺氏菌而血清凝集试验弱阳性或不凝集时，应制备生理 盐水菌悬液，盐水菌悬液，100水溶水溶 1530min，冷却后观察自凝现象，如果自，冷却后观察自凝现象，如果自 凝试验阴性，再进一步使用抗血清做凝集试验。凝试验阴性，再进一步使用抗血清做凝集试验。 2、沙门氏菌的鉴定、沙门氏菌的鉴定 沙门氏菌种及其亚种鉴定沙门氏菌种及其亚种鉴定 沙门氏菌属在含有乳糖的鉴别培养基经沙门氏菌属在含有乳糖的鉴别培养基经 36培养培养 18-24h 后，其菌后，其菌 落一般为无色透明或半透明，中等大或叫较小，边缘整齐、光滑，落一般为无色透明或半透明，中等大或叫较小，边缘整齐、光滑， 稍呈隆起。多数沙门氏菌因产生硫化氢，在稍呈隆起。多数沙门氏菌因产生硫化氢，在 SS、HE 培养基上可形培养基上可形 成中心带黑色或墨绿色的菌落。成中心带黑色或墨绿色的菌落。 生化反应鉴定为沙门氏菌或志贺氏菌的菌株还要进行血清学鉴定确生化反应鉴定为沙门氏菌或志贺氏菌的菌株还要进行血清学鉴定确 定菌体抗原（定菌体抗原（O 抗原）抗原） 。沙门氏菌和志贺氏菌都应进一步进行血清学。沙门氏菌和志贺氏菌都应进一步进行血清学 和全面生化鉴定。和全面生化鉴定。 3、 弯曲杆菌的鉴定弯曲杆菌的鉴定 培养培养 24-48h 后检查弯曲杆菌的特征性菌落：有扁平的、能扩散后检查弯曲杆菌的特征性菌落：有扁平的、能扩散 的、可以弥漫整个平板表面的菌落；有很小的、凸起的、半透明的的、可以弥漫整个平板表面的菌落；有很小的、凸起的、半透明的 菌落。颜色可为灰色、黄色或粉红色。氧化酶试验阳性。菌落。颜色可为灰色、黄色或粉红色。氧化酶试验阳性。 取可疑形态菌落进行革兰氏染色。由于常规革兰氏染色时弯曲取可疑形态菌落进行革兰氏染色。由于常规革兰氏染色时弯曲 杆菌不易着色，可用蕃红或石炭酸复红染液染片杆菌不易着色，可用蕃红或石炭酸复红染液染片 3min。最适于弯曲。最适于弯曲 杆菌的染色方法是用杆菌的染色方法是用 0.1% 的碱性复红染液染片的碱性复红染液染片 3min。显微镜下观。显微镜下观 察弯曲杆菌是小的、轻度弯曲的察弯曲杆菌是小的、轻度弯曲的 G杆菌，呈杆菌，呈“S”型或海鸥型。型或海鸥型。 动力试验：弯曲杆菌悬于肉汤培养液如营养肉汤或动力试验：弯曲杆菌悬于肉汤培养液如营养肉汤或 Mueller- Hinton(M-H)肉汤中，用相差显微镜或光学显微镜观察动力，盐水肉汤中，用相差显微镜或光学显微镜观察动力，盐水 和蒸馏水可能抑制其动力。和蒸馏水可能抑制其动力。 血清学试验：用玻片乳胶凝集试验商品试剂盒能鉴定到属的水平即血清学试验：用玻片乳胶凝集试验商品试剂盒能鉴定到属的水平即 空肠弯曲杆菌、海鸥弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌。此试验是检测以上空肠弯曲杆菌、海鸥弯曲杆菌和大肠弯曲杆菌。此试验是检测以上 3 种细菌的细胞壁抗原。当抗原与用弯曲杆菌抗体包被的乳胶颗粒种细菌的细胞壁抗原。当抗原与用弯曲杆菌抗体包被的乳胶颗粒 悬液发生反应时即产生凝集现象。悬液发生反应时即产生凝集现象。 DNA 探针：探针：DNA 探针商品试剂盒能鉴定出空肠弯曲杆菌、大肠弯探针商品试剂盒能鉴定出空肠弯曲杆菌、大肠弯 曲杆菌和海鸥弯曲杆菌，但不能进行种间鉴别。该试剂盒利用非放曲杆菌和海鸥弯曲杆菌，但不能进行种间鉴别。该试剂盒利用非放 射性检测系统射性检测系统 4h 内即获得快速检测结果。内即获得快速检测结果。 快速马尿酸盐水解试验：马尿酸盐试验阳性鉴定为空肠弯曲杆菌，快速马尿酸盐水解试验：马尿酸盐试验阳性鉴定为空肠弯曲杆菌， 马尿酸盐试验阴性需进一步鉴定。马尿酸盐试验阴性需进一步鉴定。 萘丁酸和头孢噻吩敏感试验：制备萘丁酸和头孢噻吩敏感试验：制备 2-3mlBHI 或或 Mueller-Hinton(M- H)肉汤微菌悬液。将菌悬液均匀涂布于血平板使菌落融合生长。再肉汤微菌悬液。将菌悬液均匀涂布于血平板使菌落融合生长。再 将将 30ug 萘丁酸和萘丁酸和 30ug 头孢噻吩纸片贴在平板上。在弯曲杆菌的微头孢噻吩纸片贴在平板上。在弯曲杆菌的微 需氧环境下培养需氧环境下培养 24h，如纸片周围出现抑菌环为敏感。，如纸片周围出现抑菌环为敏感。 4、弧菌的鉴定、弧菌的鉴定 观察培养后的观察培养后的 TCBS 平板，挑选符合弧菌菌落颜色和生长特征的菌平板，挑选符合弧菌菌落颜色和生长特征的菌 落进行鉴定，生化筛选结果阳性的菌落应进行全面生化鉴定。落进行鉴定，生化筛选结果阳性的菌落应进行全面生化鉴定。TCBS 平板上培养平板上培养 48h 后方能报告阴性结果。后方能报告阴性结果。 一些大肠杆菌、弯曲杆菌和肠球菌也可以在一些大肠杆菌、弯曲杆菌和肠球菌也可以在 TCBS 培养基中生长，培养基中生长， 但通常情况下其菌落小且为半透明。变形杆菌发酵蔗糖产生的黄色但通常情况下其菌落小且为半透明。变形杆菌发酵蔗糖产生的黄色 菌落一定要仔细与弧菌的黄色菌落相区别。邻单胞菌和气单胞菌都菌落一定要仔细与弧菌的黄色菌落相区别。邻单胞菌和气单胞菌都 可以在可以在 TCBS 平板上生长，它们通常形成蓝色菌落。选血平板上非平板上生长，它们通常形成蓝色菌落。选血平板上非 假单胞菌落进行氧化酶试验，氧化酶阳性可能为弧菌或气单胞菌。假单胞菌落进行氧化酶试验，氧化酶阳性可能为弧菌或气单胞菌。 常规肠道培养基上生长的弧菌不发酵乳糖。常规肠道培养基上生长的弧菌不发酵乳糖。 与腹泻性疾病相关的弧菌要鉴定到与腹泻性疾病相关的弧菌要鉴定到“种种”的水平。嗜水气单胞菌易被的水平。嗜水气单胞菌易被 错误鉴定为河弧菌。河弧菌可通过以下错误鉴定为河弧菌。河弧菌可通过以下 1 个或个或 2 个试验鉴别：个试验鉴别：O/129 敏感试验（备敏感试验（备 0.5 McFarland 标准菌悬液，涂布标准菌悬液，涂布 M-H 琼脂平板，贴琼脂平板，贴 上上 50ugO/129 的纸片，的纸片，35-37培养培养 24h，观察抑菌环，河弧菌，观察抑菌环，河弧菌 /129 敏感，气单胞菌敏感，气单胞菌/129 耐药）耐药） ；NaCl 刺激生长试验（分别接刺激生长试验（分别接 种不含种不含 NaCl 和含和含 1% NaCl 的营养肉汤，的营养肉汤，35-37培养培养 18-24h，观，观 察生长状况。气单胞菌在不含察生长状况。气单胞菌在不含 NaCl 和含和含 1%NaCl 的营养肉汤中均的营养肉汤中均 不生长，河弧菌是一种嗜盐弧菌，没有不生长，河弧菌是一种嗜盐弧菌，没有 NaCl 不生长，在含不生长，在含 1%的的 NaCL 营养肉汤中生长。营养肉汤中生长。 血清学鉴定霍乱弧菌：用霍乱弧菌血清学鉴定霍乱弧菌：用霍乱弧菌 O1 抗血清鉴定霍乱弧菌。抗血清鉴定霍乱弧菌。O1 群群 霍乱弧菌和非霍乱弧菌和非 O1 群霍乱弧菌都能引起霍乱样疫病，但群霍乱弧菌都能引起霍乱样疫病，但 O1 群菌株最群菌株最 易引起流行。将可疑菌落尽早用非选择性培养基进行密集划线传代，易引起流行。将可疑菌落尽早用非选择性培养基进行密集划线传代， 35-37培养培养 5-8h 后制成奶样菌悬液，在玻片上将后制成奶样菌悬液，在玻片上将 1 滴此菌悬液与滴此菌悬液与 1 滴抗血清混合，晃动玻片滴抗血清混合，晃动玻片 1min，观察是否凝集，凝集反应阳性提，观察是否凝集，凝集反应阳性提 示为霍乱弧菌示为霍乱弧菌 O1 群，然后再通过生化反应验证血清学鉴定。实验群，然后再通过生化反应验证血清学鉴定。实验 室如果无室如果无 O1 群抗血清储备，一定要将霍乱弧菌分离物送至当地卫群抗血清储备，一定要将霍乱弧菌分离物送至当地卫 生防疫机构实验室。生防疫机构实验室。 5、致病性大肠埃希氏菌的鉴定、致病性大肠埃希氏菌的鉴定 目前尚无稳定特异的生化试验能鉴别粪便标本中致病性大肠埃目前尚无稳定特异的生化试验能鉴别粪便标本中致病性大肠埃 希氏菌和非致病性大肠埃希氏菌。希氏菌和非致病性大肠埃希氏菌。EPEC、ETEC、EIEC 和和 STEC 的血清型只作为鉴定致病性大肠埃希氏菌的一个方面。确证大肠埃的血清型只作为鉴定致病性大肠埃希氏菌的一个方面。确证大肠埃 希氏菌致病性的方法有：细胞毒素测定、侵袭试验、希氏菌致病性的方法有：细胞毒素测定、侵袭试验、DNA 探针检测探针检测 致病基因、组织培养测定细胞毒素等。致病基因、组织培养测定细胞毒素等。 （1）STEC（以前称（以前称 EHEC）:发病发病 5 天内留取粪便标本，大肠埃希天内留取粪便标本，大肠埃希 氏菌氏菌 O157：H7 是最常见的能引起出血性结肠炎的血清型，但是最常见的能引起出血性结肠炎的血清型，但 EPEC O26：H11 和和 O111 也能产生细胞毒素而引起此综合征。在山也能产生细胞毒素而引起此综合征。在山 梨醇麦康凯培养基上为无色菌落。梨醇麦康凯培养基上为无色菌落。 鉴定：选择鉴定：选择 5-10 个乳糖阳性菌落接种于山梨醇麦康凯平板培养基上个乳糖阳性菌落接种于山梨醇麦康凯平板培养基上 进行山梨醇发酵试验，选择进行山梨醇发酵试验，选择 5-10 个山梨醇发酵试验阴性菌落进行个山梨