登革热病毒(完整)

登革热病毒的霍乱毒素 B 亚单位结构域 III 的包膜糖蛋白 E 融合蛋白在转基因植物中的制备 登革热病毒包膜糖蛋白 E，它在其进入宿主细胞中扮演着关键角色，具有 一个免疫原性结构域 III，它能诱导中和抗体。然而，无佐剂的 EIII 蛋白的小 鼠免疫引起低免疫反应。为了提高免疫反应，霍乱毒素 B 亚基和 EIII 基因组成 的一个 DNA 片段(CTBEIII)，通过农杆菌机理转换方法构建并引入到烟草植物 细胞（红花烟草 L. cv. MD609）。已经证实了 CTB-EIII 融合基因在转基因植 物中的整合与转录是分别通过基因组 DNA PCR 扩增和 northern 印迹分析。抗 CTB 和抗登革热病毒抗体的免疫印迹分析结果显示了转基因植物提取物中的 CTB- EIII 融合蛋白的表达。基于 GM1-ELISA 的结果,CTB-EIII 蛋白在植物中 的表达显示肠道上皮细胞膜醣脂类受体的生物活性，GM1-神经节苷脂，,其表达 水平大约占转基因植物叶组织中可溶性蛋白总量的 0.019%。利用植物生产 CTB- EIII 融合蛋白产生针对域 III 的免疫原性的可行性，将在未来的动物实验中进 行测试。 关键词关键词 登革热病毒 ; 包膜糖蛋白的结构域 III ; 霍乱毒素 B 亚单位 ; 以植物为基础的疫苗 ; 粘膜免疫 引言引言 登革热病毒是由伊蚊传播并且在人类中引起非常严重的虫媒病毒病。这是 世界性疾病，虽然主要发生在亚热带地区，每年约 50-100 亿人感染。黄病毒包 括三个结构蛋白衣壳（C），被膜（E）和膜（M）蛋白和一个感染性 RNA 的单链。全病毒和其包膜糖蛋白 E 的结构已通过拟合 X 射线晶体学和低温 电子显微镜（冷冻电镜）确定。登革热病毒的包膜糖蛋白 E 在宿主细胞附着和 进入中起着至关重要的作用，同时也引发抗体显示保护性免疫。这种糖蛋白 E 包含三个胞外结构域（域 I-III）和一个跨膜结构域。结构域 III 是病毒与受 体之间在靶细胞表面的相互作用上的基本位点，并包含中和抗原，它可以引发 单克隆抗体，从而强烈地阻断病毒吸附的细胞。 转基因植物和转基因植物细胞悬液培养已经被越来越多地用作工具生产商 用和药用蛋白。一个这样的工具是基于植物的可食用疫苗，以防止各种各样的 人类感染和自身免疫性疾病。以植物为基础的疫苗有以下几个优点：生产成本 低，便于贮存和运输，动物病原体污染的安全性，以及没有有针对性的相关损 伤以及疾病传播。植物生产的小鼠肌肉内免疫的登革热病毒蛋白 EIII，它使用 了以烟草花叶病毒为基础的载体系统，诱导针对登革热病毒中和抗体活性，表 明植物生产的 EIII 蛋白具有合适的抗原性和免疫原性。 基于植物的可食用疫苗可诱导免疫耐受性和低免疫应答，这是因为在转基 因植物中的靶抗原的表达水平低。克服这一障碍的另一种方法是通过使用肠毒 素 B 亚基作为融合抗原的载体，以提高抗原摄取到粘膜免疫系统。细菌毒素由 A 和 B 结构域组成，B 结构域已被用于增加抗原摄取到肠上皮细胞中，从而增加 了粘膜免疫应答。霍乱毒素（CT）是通过霍乱弧菌所产生的异源二聚体 AB 毒素 的典型代表，并且是最有效的肠靶向分子之一。CTB 亚基是由五个相同的多肽 （11.5 kDa）组成的，并在细菌中组装成一个高度稳定的五聚体环状结构。CTB 五聚体选择性地结合到糖脂质 M1神经节苷脂分子嵌入在肠上皮细胞膜（肠） 和微皱（M）细胞。CTB 已显示出它的功能，它可作为有效载体分子融合外源蛋 白，包括粘膜疫苗抗原和自身抗原。 登革病毒 E 糖蛋白结构域的表达已报道，在植物中用烟草花叶病毒为基 础的载体系统和转基因无尼古丁的烟草。植物生产的 EIII 蛋白无佐剂时不引起 小鼠的免疫反应。为了克服转基因植物中这个问题，抗原需要与配体融合，如 霍乱毒素 B 亚基（CTB）和肠毒性大肠杆菌热不稳定性肠毒素 B 亚基（LTB）， 以提高抗原进入粘膜免疫系统的效率。在这项工作中，我们研究了转基因烟草 的能力，其中包含低或无尼古丁含量的能力，以产生融合蛋白组成的霍乱毒素 B 亚基（CTB）和登革热病毒包膜的结构域 III 的糖蛋白（EIII）的控制下的重 复 35S 花椰菜花叶病毒启动子，它可以在无佐剂时有效地诱导免疫反应。目标 融合基因的整合和表达分别通过基因组 DNA PCR 和 Western blot 分析来证实。 转基因植物表达 CTB-EIII 融合蛋白作为以植物为基础的可食疫苗提高免疫反应 和保护登革病毒感染宿主的可行性，将在进一步的实验进行研究。 讨论 CTB 由五个相同的多肽组成，形成了一个五聚体环，并且 CTB 五聚体已经被证 明能选择性结合 GM1-神经节苷脂，CTB 的生物活性受体存在于肠上皮细胞（肠） 和微皱（M）细胞的质膜。抗 CTB 和抗登革热病毒的单克隆抗体的免疫印迹结果 表明植物生产的 CTB-EIII 融合蛋白在未煮沸条件下呈五聚体状态。CTB-EIII 融合蛋白的单体和五聚体在未煮沸条件下检测到具有抗登革热病毒的抗体， CTB-EIII 融合蛋白聚集的量通过光密度法测定出 CTB-EIII 单体占 60（数据 未列出）。此外，通过 GM1-ELISA 法测定植物产生的 CTB-EIII 融合蛋白用作 GM1-神经节苷脂的生物活性。用 CTB 融合抗原免疫的小鼠比单独用抗原免疫的 小鼠的抗原特异性 IgG 具有较高的抗体效价。CTB 已被用作载体和佐剂用来熔 融植物疫苗生产的抗原。因此预计植物生产的 CTB-EIII 融合蛋白可有效地由粘 膜免疫系统产生，从而提高免疫反应抑制登革热病毒的传播。 煮过的蛋白免疫印迹结果表明它的两条链约在 26 kDa。下带预计是 CTB- EIII 融合蛋白单体，上带可能包含信号肽或是被糖基化的蛋白，因为 CTB 有糖 基化位点，但 EIII 却没有。在抗登革热病毒单克隆抗体的免疫印迹中观察到两 个低频段（26 kDa），而在抗 CTB 抗体免疫印迹微弱或没有检测到。对这些 结果的解释是：抗 CTB 抗体是由纯化的细菌 CTB 五聚体开发的，并且可能不能 有效地检测到 CTB 单体。 虽然基因组 DNA 的 PCR 分析表明，所有转基因植物中 CTB-EIII 融合基因的 条带，两种转基因植物（6，7）具有 CTB-EIII 的高频段 mRNA，而其余的 则 Northern blot 分析低表达。转基因植物中的 CTB-EIII 融合基因的这些不同 的表达水平是由于目标基因的不同结合位点，这个基因位于植株的染色体中， 被称为“位置效应”。最近的实验报道，在转基因植物中的转基因表达是通过 RNA 静默敲除基因。基因沉默的病毒编码抑制剂阻断基因沉默并增强植物中的 瞬时表达系统。 在我们以前的研究中，转基因水稻愈伤组织已被构建来表达 LTB。免疫的 小鼠用 20 毫克转基因水稻愈伤组织的冻干粉 1.7 微克 LTB 诱发体液免疫应 答，免疫血清抑制细菌 LTB 与其受体的结合。虽然这个转基因植物比表达 LTB 的转基因植物（TSP 的 0.12）表现出了较低的表达水平（TSP 的 0.019）， 如果增加剂量（每喂食 300 毫克冻干的烟草样品）和喂食频率，可以预计植物 生产的 CTB-EIII 融合蛋白会引起小鼠和其它动物口服疫苗显著的免疫反应。 登革热病毒是黄病毒家族的成员，并有四个密切相关的，抗原性不同的血 清型：登革热 1，登革热 2，登革热 3 和登革热-4。与原发感染或疫苗接种不同 血清型的继发感染通常会导致更严重的疾病状态，这是由于抗体依赖性增强的 作用。用于控制登革热感染的新疫苗必须影响到所有的登革热血清型。使用四 种登革热病毒血清型的结构域 III 的四价登革热疫苗在酵母中表达，并接种四 价蛋白的小鼠表现出针对所有四种血清型的中和活性。预期转基因植物混合物 表达 4 种血清型的糖蛋白 E，对所有登革热血清型均能有效地引发免疫反应。 在这项研究中，我们构建了一种可食用的烟草植物（尼古丁含量低或