基因组DNA的提取及电泳鉴定

分子生物学实验分子生物学实验 1、 欢迎大家参加分生实验的学习； 2、 学习分生实验的重要性； 3、 守纪律，听老师安排，穿白衣； 4、 每组做一份实验 4、 本课件原则上禁止拷贝，要作好记录 ; 5、 关于课间休息和上课时间 每天实验结束应主动整理实验台。值日安排。 1 实验课考试实验课考试 1. 最后最后 2学时进行实验课考试学时进行实验课考试 2. 开卷开卷 , 内容为实验课学习内容。内容为实验课学习内容。 2 3 一、加样器的使用及注意事项 1、 用途 2、 如何使用？ 2.1 根据取样量，选择合适的加样器。 5ul、 50ul、 500ul， 应选择哪个加样器 ? 顶部标有加样器的 最大量程 ， 分别为： 20ul: 0.5 20 l 100/200ul: 20 100/200 l 1000ul: 200ul 1000 l 实验仪器的使用及注意事项 4 练习：加样器读数为练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少，实际体积各为多少 ? 2.2 如何调节？ (1)首先观察目前读数 ,假设为 050: 1000 l: 500 l 100/200 l: 50 l 20 l： 5 l (2)顺时针调节 - 读数变小 逆时针调节 - 读数变大 (3)注意：调节前加样器读数正处于最大量程或最小 量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将 会损害加样器的精度。 5 2.3 加样器使用步骤 (示教及学生练习 )： 1）选择加样器）选择加样器 ,观察读数观察读数 ,调节读数，吸头的安装要紧密。调节读数，吸头的安装要紧密。 不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下。 2）吸取液体前，先打到）吸取液体前，先打到 第一挡第一挡 。 3）将吸头插入液面下适当深度，）将吸头插入液面下适当深度， 过深可能会腐蚀加样器过深可能会腐蚀加样器 , 过浅可能会吸入空气。过浅可能会吸入空气。 4） 缓慢缓慢 松开拇指松开拇指 ,吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器 ; 完全放开拇指后，停留约半秒钟完全放开拇指后，停留约半秒钟 , 急于离开液面，容易吸入空气。急于离开液面，容易吸入空气。 5）抬起加样器）抬起加样器 ,估计体积是否正确估计体积是否正确 ,将外壁液体用容器口引流回去将外壁液体用容器口引流回去 6） (吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损 坏加样器！坏加样器！ ),贴容器内壁，将液体贴容器内壁，将液体 匀速匀速 打出，加样器推到打出，加样器推到 第二挡第二挡 。 观察吸头内液体是否完全打出并立即观察吸头内液体是否完全打出并立即 弃弃 于废物盒内于废物盒内 . 6 1、打开电源 2、离心管中的液体为 2/3,盖紧盖子 ,防止离心机被腐蚀。 二、离心机的使用注意事项 1代表转速盘上方的数据， 2代表下方的数据。 3、样品配平 , 对称 放入离心机 (管的连接 处朝外 ). 4、设定离心时间 (如 设定 2分钟，可定时多 点时间，再用手表记 时 )。 5、 统一离心 ，逐渐 升到要求转速。 7 实验一、实验一、 真核细胞基因组真核细胞基因组 DNA的的 提取、酶切及电泳提取、酶切及电泳 实验目的 1. 掌握掌握 人外周血基因组人外周血基因组 DNA的的 提取技术提取技术 。 2. 学习学习 酶切酶切 技术技术 3. 学习学习 DNA琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 电泳电泳 的原理和技术。的原理和技术。 第一部分 ：裂解血细胞、 蛋白酶 k消化 第二部分 : 酚氯仿抽提、 乙醇沉淀 第三部分： 酶切、 DNA电泳 实验内容 （到 8： 308:40） 8 1）取 0.3ml抗凝血置于 1.5ml Eppendorf管中 . 2）加入 1ml STMT 溶液，充分混匀，静置 5min，使其溶血。 3） 9,000rpm,离心 3 分钟 (统一离心 )。 4） 弃上清。 弹管底重悬 沉淀 。 注意 :离心时离心机内样品要平衡 实验步骤实验步骤 实验第一部分：裂解红细胞、蛋白酶 K消化 8： 409： 15 STMT 溶液 ： S: Sugar 8% T: Triton X-100 1% M: MgCl2 0.5mM T: Tris-HCl 10mM (PH:8.0) 作用： 用 Triton 细胞膜上打孔，裂解细胞。 9 4）加 0.4ml生理盐水，悬浮细胞。 5） 9000rpm,离心 3分钟 (统一离心 )，弃上清，弹匀。 6）加 460 l NE溶液，混匀。 7）加 30 l 10%SDS, 迅速混匀。 8）加 50 l 蛋白酶 K(20mg/ml),混匀， 置 50C水浴 1小时。 操作注意事项： 1、混匀时确认沉淀已被悬起。 2、注意 30ul、 50ul加样体积准确。 10 作用： a. 阴离子型去污剂阴离子型去污剂 ，溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性 c.将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用 N: NaCl 50mM E: EDTA.Na2 25mM (PH:8.0) 作用： 金属离子螯合剂，抑制 DNase的活性 (螯合 DNase发挥活性所需的 2价阳离子 )。 各种试剂的作用 1、 NE 溶液： 2、 SDS ： 十二烷基硫酸钠 终浓度 0.5% 3、蛋白酶 K(或链霉蛋白酶 ) 是广谱蛋白酶，能在 SDS和 EDTA的存在下保持很高的活性， 降解蛋白质降解蛋白质 ，将，将 DNA游离。游离。 11 一、核酸提取的主要步一、核酸提取的主要步 骤骤 课间介绍 n真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步 : n1) 破碎细胞； n2) 去除蛋白质，糖类等等生物大分子； 由于 真核细胞基因组较大，在纯化出的的操 作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最 大限度地减少机械和化学作用对的剪切 ，从而获得相对完整的 n3) 沉淀核酸 12 乙醇沉淀 SDS裂解 蛋白酶 K消化 琼脂糖电泳 PCR DNA提取步骤图解 酚氯仿抽提 13 重蒸酚重蒸酚 : 酚的作用是酚的作用是 变变 性蛋白性蛋白 质质 ，而，而 对对 DNA结结 构没有影响。构没有影响。 无色无色 酚的氧化酚的氧化 产产 物物 (如如 醌醌 等等 ,粉粉 红红 色色 ) 破坏磷酸二脂破坏磷酸二脂 键键 。 重蒸酚是将酚中的酚的氧化重蒸酚是将酚中的酚的氧化 产产 物去除。物去除。 TE溶液溶液 : Tris-HCl 10mM (pH:8.0) EDTA.Na2 1mM (pH:8.0) 作用：提供略碱的作用：提供略碱的 pH值值 ，保，保 证证 DNA溶于水相。溶于水相。 在酸性条件下，在酸性条件下， DNA分配于有机相。分配于有机相。 8-羟羟 基基 喹喹 啉：啉： 0.1% 黄色黄色 酚相指示酚相指示 剂剂 抗氧化抗氧化 剂剂 作用： 去除蛋白等杂质。酚对蛋白有强烈的变性作用，用酚和氯 仿抽提样品，可以使样品中的蛋白质变性沉淀，可通过离心去除。 为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。 1、 TE饱和重蒸苯酚： 14 氯氯 仿作用：仿作用： a. 氯 仿的 变 性作用不如酚好， 但与酚共同但与酚共同 /交替使用可增交替使用可增 强强 去蛋白效果；去蛋白效果； b. 氯氯 仿有加速有机相和水相的分离、仿有加速有机相和水相的分离、 去除植物色素和蔗糖、抑制核酸去除植物色素和蔗糖、抑制核酸 酶酶 活性；活性； 2、酚 /氯仿 3、氯仿 /异戊醇 ( 24 : 1) 氯氯 仿的作用：仿的作用： 去除去除 DNA水溶液中残留的微量酚。水溶液中残留的微量酚。 异戊醇的作用：异戊醇的作用： 减少操作减少操作 过过 程中气泡的程中气泡的 产产 生。生。 15 在在 单单 价阳离子存在的情况下，乙醇可以使价阳离子存在的情况下，乙醇可以使 DNA发发 生沉淀。可生沉淀。可 离心收集离心收集 . v 核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子 形成 盐类 而沉淀， 在 许 多种有机溶 剂 中不溶解 ，也不会 被 变 性。 v 最常用沉淀 剂为 1价 钠 、 钾 、胺和 锂 等离子的 盐类 ，如 醋酸 钠 、 NaCl、 氯 化 锂 、 氯 化 钾 等 v 常用有机沉淀 剂 有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等 。 5、无水乙醇 ： 作用：提供作用：提供 单单 价阳离子。价阳离子。 4、醋酸钠： 3M NaAc pH: 5.2 16 课间课间 休息休息 同学自己练习： 加样器使用提示： （ 1）吸头的安装要紧密。 （ 2）打到 第一挡 ，将吸头 插入液面下适当深度（ 3） 缓慢松开拇指，吸取液体 。拇指完全放开后，吸头 在液面下停留一下（约半 秒钟）（ 4）将外壁液体用 容器口引流回容器。吸头 内的体积应大致正确。（ 5 ）贴目的容器内壁，将液 体匀速打到目的容器内， 加样器推到 第二挡 。观察 吸头内液体是否完全打出 。 十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate，简称 SDS)等离子型表面 活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白 ，使核蛋白解聚，从而使 DNA得以 游离出来。 蛋白酶 K,再加入苯酚和氯仿等有机 溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提 液分相，因核酸 (DNA、 RNA)水溶性 很强，经离心后即可从抽提液中除 去细胞碎片和大部分蛋白质。 上清液中加入无水乙醇使 DNA沉淀 ，沉淀 DNA溶于 TE溶液中，即得总 DNA溶液。 10:00上上 课课 17 1、 加入 550ul(等体积 )TE饱和酚 , 混匀 1min. 10,000rpm, 2 min。 (注意抽取下层酚相 ; 酚可腐蚀加样器等 , 加样器头用过即弃掉 ) (轻柔混匀，避免 DNA链断裂 ; 但是太轻又起不到变性蛋白的作用 ) 2、将 上层水相 移至一新管中 (要尽量抽尽，又不可吸起酚相 )。 加入 500ul(等体积 )酚 /氯仿 (已经配好，体积比 1:1), 同上条件 混匀、离心。 3、 将上层水相移至一新管中。 加入 500ul(等体积 )氯仿 -异戊醇 ， 同上条件 离心、取上清。 4、加入 1/10体积（约 30ul） 醋酸钠 于上清中充分混匀。 加入 2-2.5倍体积 无水乙醇 （约 1ml） （通常加满小离心管 ）， 混匀后交给老师，（统一置） -20 1 h ( 或 -70 10 min)。 实验第二部分、 酚氯仿抽提 DNA及乙醇沉淀 18 乙醇沉淀后午休。 注意事项： 1） 本实验将用到的 TE饱和重蒸苯酚、氯仿 /异戊醇 是有机试剂，比水的比重大，而 DNA溶解在水里，我 们 总是取上清。 2） 在 抽取完苯酚、氯仿等 有机试剂， 不能将加样器 平放或倒置 ，以防液体导流损坏加样器， 加完样后立 即弃掉加样器头。 3） 基因组 DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断 裂，因此，为了得到完整的基因组 DNA， 尽量不要多 次进行物理性操作。 19 7、加入 13 l 双蒸水 , 溶解沉淀， -20 保存。 6、 10,000 r/min 离心 5 min，弃上清。 8 l： 酶切、电泳 余 5 l ： PCR模板（下次课进行）。 蓝头 黄头 滤纸条 (吸干内壁液体 ) 观察 DNA沉淀的颜色。 一定要 充分充分 溶解沉淀 20 8、基因组 DNA的酶切： 基因组 DNA 8 ul 10x Buffer H 1 ul EcoR I(最后加入 ) 0.6 ul 置 37 保温 45 min。 实验第三部分：基因组 DNA的酶切 1:002:20 21 课间介绍（ 2）： 1. 酶切相关知识 1、 酶活性单位 Unit （ U）： 1U: 是指在 1小时 内，适当温度下 (37C)，在 50ul 反应体系中， 将 1ug of lambda DNA(底物 DNA)完全消化所需的酶量。 2、 酶切体系： 10反应缓冲液 ： 提供内切酶反应最适 pH值及所需离子。 双蒸水：无细菌和其他酶类污染。 BSA ： 100-200ug/ml， 保护酶蛋白不失活。 内切酶：含 50%甘油， -20 保存。 反应体积：一般根据底物 DNA的量来计算。反应体系中甘油浓度 应 5%。 22 1. Southern blot DNA水平基因结构分析的重要策略之一 . 基因组 DNA酶切电泳后可以直接用于 Southern blot 转膜。 2.构建基因组文库 3.PCR的模板 克隆表达基因 分析基因一级结构的变化 基因组 PCR产物的酶切电泳可以分析基因多态性； 利用内参法可以相对定量分析特定基因在基因组上的拷贝数。 课间介绍 提取模板 DNA的常见目的： 基因组 DNA的链很长，常用的蛋白酶 K酚抽提法由于机械 剪切力的作用，很难获得完整的 DNA分子 , 可获得 100kb- 150kb大小的 DNA片断，可满足下述实验用途。 23 DNA琼脂糖凝胶电泳 1. 内切 酶消化 后的 DNA片 段 琼脂糖凝胶 取下硝酸纤维素膜 标记探针 杂交袋 4. 将硝酸纤维素 膜放入杂交袋中 , 预 杂交 ; 杂交 : 与标记的核酸探 针 ; 洗膜 放射自显影后的 X光底片 将硝酸纤维 素膜与 X-光 片曝光 2. 变性 中和 3. 转膜 5. 放射自显影 或显色 Southern Blot 基本过程 24 实验第四部分、 DNA质量检测 琼脂糖电泳 一、 原理 DNA分子在 pH 8.0 的电泳环境中，带负电 荷，在一定强度电场力的作用下，从负极向正极 迁移。 电泳样品载体琼脂糖是一种线性多糖聚合物 ，煮沸冷却后形成网格样结构，电泳中起分子筛 作用。通常情况下，分子量大的 DNA电泳过程中 由于受到的阻力较大，泳动速率较慢，反之，分 子量较小的 DNA片段跑在前面。 25 二、 常用试剂 上样液成份： 1 0.25%溴酚蓝或 /和 0.25%二甲苯青（样品指示剂） 2 40%蔗糖 或 30% 甘油（增加样品比重），利于加样。 电泳缓冲液： TAE 为例 T: Tris碱 A: 冰醋酸 E: EDTA 提供有一定缓冲能力的 pH值 (8.0), EDTA可抑制 DNase 的作用。 溴化乙锭（ EB）： 染色剂 一种荧光染料，分子呈扁平型，可嵌入到 DNA或 RNA 的碱基之间。在紫外光激发下能发出红色的荧光。 致癌剂致癌剂 26 1% 琼琼 脂糖凝胶脂糖凝胶 电电 泳。泳。 在样品中加在样品中加 2 3ul 6上样液，混匀，上样液，混匀， 加入上样孔内加入上样孔内 电电 泳条件：泳条件： 100 110伏，伏， 30-40分钟。分钟。 电电 泳泳 结结 束后照像保存，束后照像保