支气管肺泡灌洗(bal) 操作方法：

支气管肺泡灌洗(BAL) 操作方法： 一、术前准备 同纤维支气管镜(纤支镜) 术前准备, 常规在纤支镜气道检查后于活检刷检前做 BAL。局部 麻醉剂为 2 %利多卡因。 二、BAL 操作技术 1.灌洗部位选择: 对弥漫性间质性肺疾病选择右肺中叶(B1 或 B5 ) 或左肺舌段，局限性肺病变则在相应支气 管肺段进行 BAL 2. BAL 操作步骤 首先在要灌洗的肺段经活检孔通过一细硅 管注入 2 %利多卡因 12ml ,做灌洗肺段局 部麻醉 然后将纤支镜顶端紧密楔入段或亚段支气管开口处,再经活检孔通过硅胶管快速注入 37 灭菌生理盐水,每次 2550ml ,总量 100250ml ,一般不超过 300ml 立即用 50 100mmHg(1mmHg = 0. 133kPa) 负压吸引回收灌洗液, 通常回收率为 40 %60 % 将回收液体立即用双层无菌纱布过滤除去粘液,并记录总量 装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中(减少细胞粘附) ,置于含有冰块的保温瓶中,立即送往实 验室检查 支气管肺泡灌洗液(BALF) 实验室检查 一、BALF 细胞总数和分类计数检测 1.将上述回收灌洗液装入塑料离心管内, 在 4 下以 1 200r/ min 离心 10min ,上清( 原液或 10 倍浓缩) - 70 储存,用做可溶性成分的检测。 2. 经离心沉淀的细胞成分用 Hanks 液(不含 Ca2+ 、Mg 2+ ) 在同样条件离心冲洗 2 次, 每次 5min。弃去上清后 Hanks 液 35 ml 制成细胞悬液。也可以应用灌洗原液以减少细胞丢失 3. 在改良的 Neubauer 计数台上计数 BALF 中细胞总数,一般以 1 109/ L 表示。如果细胞 数过高时,再用 Hanks 液稀释,调整细胞数为 5 109/ L ,并同时将试管浸入碎冰块中备用 4. 细胞分类计数:采用细胞离心涂片装置,加入备用细胞悬液( 细胞浓度为 5 109/ L) 100l , 在 4 下以 1 200 r/min 离心 10 min 通过离心作用将一定数量的 BALF 细胞直接平于载 玻片上。取下载玻片立即用冷风吹干,置于无水乙醇中固定 30 min 后进行染色, 一般用 Wright 或 HE 染色 RPMI 1640 培养液 35ml 制成细胞悬液 2. 将细胞悬液倒人平皿中,置于 37 5 %CO2 培养箱中孵育 2h ,进行贴壁处理,去除肺泡巨 噬细胞 3. 取出细胞悬液,再用 Hanks 液冲洗离心 1 次,弃上清留 20100l 。经贴壁处理后的细 胞悬液中,肺泡巨噬细胞显著减少 ,淋巴细胞相对增多 4. 将经贴壁处理的细胞悬液分装 3 个小锥 形离心管内,每管 2030l ,用微量加样器向标 本中加单克隆抗体 CD3 ,CD4 和 CD8 各 2040l ,混匀置于 4 冰箱中作用 12h 5. 取出标本,先用 Hanks 液冲洗离心 2 次, 以 12 000 r/ min 离心 20s ,然后加羊抗鼠荧光 抗体各 2040l ,置于 4 冰箱作用 30min。 6. 取出标本用 Hanks 液以同样速度和时间离心冲洗 2 次,弃上清留 20l 充分混匀细胞, 取 1 滴于载玻片上加盖玻片。荧光显微镜下数 200 个淋巴细胞并计算出标有荧光细胞的 阳性率 几点说明 1. 用于做支气管肺泡灌洗的纤支镜顶端直径应在 5. 56. 0mm 左右,适于紧密楔人段或亚 段支气管管口,防止大气道分泌物混入和灌洗液外溢 ,保证 BALF 回收量 2. 在灌洗过程中咳嗽反射必须得到充分的抑制,否则易引起支气管壁粘膜损伤而造成灌洗 液的混血,同时影响回收量 3. 一份合格的 BALF 标本应是:BALF 中没有大气道分泌物混入 ;回收率 40 % ,存活细胞 占 95 %以上;红细胞T TH TS h ： S b 细胞 Yamada 1986 25 138 630 454 253 190 53 Wallaert 1987 12 77 664 484 275 18 ?/FONT 三、可溶性物质检查 BALF 离心液的上清液中含有复杂的可溶性成份，例如各种蛋质、酶类、脂类等（表 13-3）。这些成 分的来源有：被动漏出者（如白蛋白、血清类粘蛋白）；主动转运者；局部产生分泌成分。这些物 质反映肺泡表面衬液成份，其测定对了解某些肺部疾病的病变特征，研究发病机制提供重要手段。 表 13-3 BALF 检测的可溶性物质 全屏显示表格 溶质 浓度近似值 溶质 浓度近似值 总蛋白 70g/ml 纤维连接蛋白 30-150ng/ml 白蛋白 70g/ml 白细胞弹性蛋白酶 + 免疫球蛋白 胶原酶 + IGG 2.5-10g/ml 血管紧张素转换酶 + IGA 2.5-6g/ml 极性脂质 78g/ml IGM 100ng/ml 非极性脂质 45g/ml IGE 0.06-0.3g/ml 前列腺素 E 200-2000pg/ml 1-抗胰 蛋白酶 1-2g/ml 血栓素 B 25-85pg/ml 2-巨球蛋白 0.04g/ml 癌胚抗原 0.8ng/ml 转铁蛋白 4g/ml 四、微生物学检查 1 涂片 BALF 不像痰液那样易受上呼吸道杂菌的污染，也不含气管和左右 支气利害的分泌物，含 非病原性阿菌很少，故其涂片检菌的意义较大 取 BALF 沉淀物进行本兰氏染色与抗酸染色检查，对结 核分支杆菌的检查有较大意义。 2 培养：严格无菌操作采 BALF 进行增菌培养或取其沉淀物直接分离培养，是检查支气管和肺部感 染的重要方法，不仅适用于对细菌和真菌等检查，也适用于对支原体的培养和病毒分离，当培养的细菌 105CGU/ml 时被认为有诊断意义。但标本采集方法复杂。 五、寄生虫学检查 1 卡氏肺孢子虫 ：人类 般受感染后 无明显症状。但若患者的免疫功能低下，特别是 AIDS 患者 和大量使用免疫抑制剂的患者易受感染，并可引起严重的间质性肺炎。于患者痰中不易查到寄生虫，而 B ALF 沉淀物检出的阳性率较高。 2 卫氏并殖吸虫 卵：轻型肺吸虫病患者痰中可能查不到虫卵，而可从 BALF 沉淀物中查到。 除以上各项检查外，还可检查 BALf 中有无其它异特。若在 BALf 沉淀物中查到石棉小体，有助石棉 肺的诊断。 六、临床应用 由于 BAl 能获取肺泡表面衬液，因此对其内容物的检查有助于肺部疾病的诊断、治疗、预后判断及 发病机制研究。其应用范围越来越广，此处钗做重点介绍： 1 肺部感染的病原学诊断：BAL 检查在下呼吸道感染的检查中占有重要的地位。BAL 可以收集较大 范围肺实质的肺泡表面衬液标本，可进行原虫、病毒及细菌学等检查。对于普通细菌感染者其细菌培养大 于等于 105cfu/ml 时为确定感染的阈值。但对于某些特殊感染，如在 BALF 中分离出结核分支杆菌、军团 菌即可做出诊断。BALF 对免疫功能低下合并肺感染的诊断也很有帮助，如对巨细胞病毒感染的敏感性达 96%，对肺孢子虫的感染敏感性为 85-90%。 2 BALf 检查：诊断呼吸道原发性或继发性恶性肿瘤有较好效果，也包括周围性肺癌、弥漫性肺恶 性肿瘤（如支气管肺泡癌）、小细胞肺癌等。但 BALF 检查结果受癌类型和肿瘤大小的影响，以腺癌和肺 泡癌阳性率最高。 3 对间质肺疾病的诊断、治疗评价及预后提供帮助 （1）外源性变应性肺泡炎 ：急性期 BALF 细胞总 明显增加，达对照组 4 倍。急性期早期肥大细胞 增多，恢复后降至正常。淋巴细胞亦明显增多，其亚群以 CD8+增多为主，CD4/CD8 比值降低，CD57 + 和 CD16+也增加。临床上认为 BAl 是外源性变应性肺泡炎最敏感的检测手段。优于 X 线胸片及肺功能检 查。 （2）结节病 ：BALF 细胞总数增高，主要为 T 细胞增多，以 CD4+为主。CD4/CD8 比值明显增高， 些变化有重要的诊断意义。中性粒细胞和肥大细胞的增多预示病人闰变的有可能发展为纤维化。 （3）特发性肺间质纤维化 ：BALF 中主要为中性粒细胞增多，嗜酸性粒细胞也可能增加，据此与以 淋巴细胞增多为主的其它崩牙肿肺疾病鉴别。 BAL 做为一 特殊的检查方法对某些其它肺疾患如支气管哮喘，成人呼吸窘迫综合征、弥漫性肺出 血、肺泡蛋白沉着症（BALF 外观呈乳状）等的临床意义也处于研究和观察之中。 BALF 检查中细胞计数和分类包括 T 淋巴细胞亚群分类，经过多年的研究已基本 标准化了，但对可溶 性物质检查还存在某些问题，主要是灌洗液量与方法不同，对肺衬液稀释程度影响测定结果，尚须进一步 的研究。 BAL 应用越来越广泛，虽然其操作复杂，有上些生理性改变及轻度并发症，但只要选好适应的证，操 作正确，还是一种安全有效的检查方法。进行 BAL 检查的禁忌证有：严重的肺功能损害者；新近发 生急性心肌梗死患者；新近发生大咳血者；活动性肺结核未经治疗者等。 支气管肺泡灌洗术 支 气 管 肺 泡 灌 洗 术 （ BAL） 介 绍 ： 支 气 管 肺 泡 灌 洗 术 （ BAL） 通 过 纤 维 支 气 管 镜 对 支 气 管 以 下 肺 段 或 亚 肺 段 水 平 ， 反 复 以 无 菌 生 理 盐 水 灌 洗 、 回 收 ， 对 其 进 行 一 系 列 检 测 和 分 析 ， 从 而 获 得 下 呼 吸 道 病 变 的 性 质 特 点 和 活 动 程 度 ， 有 助 于 确 立 诊 断 。 支 气 管 肺 泡 灌 洗 术 （ BAL） 正 常 值 ： 正 常 。 支 气 管 肺 泡 灌 洗 术 （ BAL） 临 床 意 义 ： 适 应 症 ： 肺 部 感 染 ， 特 别 是 免 疫 受 损 、 免 疫 缺 陷 肺 部 感 染 的 病 原 学 诊 断 ;弥 漫 型 和 周 围 型 肺 部 肿 瘤 的 细 胞 学 诊 断 ;间 质 性 肺 疾 病 ， 如 结 节 病 、 特 发 性 肺 间 质 纤 维 化 、 外 源 性 变 应 性 肺 泡 炎 、 肺 泡 蛋 白 沉 着 症 、 胶 原 血 管 伴 肺 纤 维 化 等 的 诊 断 、 治 疗 、 疗 效 和 预 后 估 计 。 以 纤 维 支 气 管 镜 对 支 气 管 以 下 肺 段 或 亚 肺 段 水 平 ， 反 复 以 无 菌 生 理 盐 水 灌 洗 、 回 收 的 一 项 技 术 ， 对 其 回 收 液 进 行 细 胞 学 、 生 化 学 、 酶 学 和 免 疫 学 等 一 系 列 检 测 和 分 析 。 1.全 肺 灌 洗 ： 用 于 肺 泡 蛋 白 沉 着 症 、 矽 肺 、 肺 泡 微 石 症 、 哮 喘 持 续 状 态 等 的 治 疗 。 2.肺 段 灌 洗 ： 主 要 用 于 弥 漫 性 间 质 性 肺 纤 维 化 、 石 棉 肺 和 卡 氏 肺 囊 虫 肺 炎 的 诊 断 ， 对 弥 漫 性 肺 泡 癌 的 诊 断 ， 也 有 重 要 价 值 。 1 第二节 支气管肺泡灌洗液检查 痰液检查虽可对呼吸道疾病的诊断提供帮助，但不够灵敏与特异且对疾病定位帮助不 大。支气管肺泡灌洗术（bronchoalceolar lavage,BAL）中在纤维支气管镜基础上发展起来的 一项新技术。BAL 是应用纤维支气管镜进行支气管肺泡灌洗，采取肺泡表面衬液进行炎症 与免疫细胞及可溶性物质检查的方法。与支气管冲洗少量液体注入支气管信灌注大量的液 体进行支气管肺泡灌洗不同，利用支气管肺泡灌洗液进行细胞学、微生物学、寄生虫学和 免疫学等方面的各项检验，对一些下呼吸道疾病和诊断、病情观察和预后判断开辟了一条 新途径。 支气管肺泡灌洗术分全肺灌洗和肺段亚肺段灌洗。前者多用于治疗，后者多用于采集 检验标本。 一、标本采集和处理 通常于局部麻醉后将纤维支气管镜插入右肺中叶或左肺舌段的支气管，将其项端契入 支气管分支开口，经气管活检孔缓缓少入 37 摄氏度灭菌生理盐水，每次 30-50 毫升，总量 100-250 毫升，不应超过 300 毫升。每次注液后以-13.3-19.95kpa 负压吸出，要防止负压过 大，过猛。分别收集于用硅油处理进的容器中，容器周围宜用冰块包围，并及时送检。记 录回收液量，至少应回收 30-40%以上，BALF 方能进行分析。分别注入的液体每次回收后 混合一起进行试验。第一份回收的标本往往混支气管内成分，为防止其干扰，也可将第一 份标本与其它标本分开检查。首先用单层纱布过滤以除去粘液，将滤液离心后分离上清液 供生化检查和免疫学测定，沉淀物供细胞检查。微生物学检查的标本须严格遵守无菌操作； 合适的 BALF 应要求：达到规定的回收比例；不混有血液，红细胞数小于 10%；不 应混有多量的上皮细胞（一般小于 3%） 。 二、细胞学检查 1有核细胞计数和分类计数：计数除上皮细胞及红细胞以外的所有细胞，经每毫升回 收液的细胞总数表示。细胞分类可用沉淀物制定涂片或用细胞离心器进行，正常非吸烟者 BALF 细胞数见表 13-1，正常人的 BALF 含有核细胞为（5-10）106/L。 2淋巴细胞亚群分析：BALF 中淋巴细胞增多，可用单克隆抗体进行淋巴细胞亚群分 析。例如 CD3、CD4、CD8 、HLA-DR 等以有助于发病机制的研究。正常人非吸烟者 BALF 中淋巴细胞表面抗原表型见表 13-2。 3癌细胞：支气管肺癌患者的 BALF 沉淀物检出癌细胞，有助于肺癌诊断。 表 13-1 正常非吸烟者 BALF 细胞 作者 年 例数 注入量 回收量（%） 总细胞数（ 106） 细胞（106/ml ） Mac Lym Neut Eos Hunninghske 1983 8 100 52 140 269 93 7 0 0 北医大三院 1987 10 150 62 134 147 86 13 09 005 Ettensohn 1988 78 120 63 73 94 95 4 1 0 注：Mac 巨噬细胞；Lym 淋巴细胞；Nuet 中性粒细胞；Eos 噬酸性细胞 表 13-2 正常非吸烟者 BALF 中淋巴细胞表面抗原表型 作者 年 例数 淋巴细胞（%） 总-?/FONTT TH TS h ：S b 细胞 Yamada 1986 25 138 630 454 253 190 53 Wallaert 1987 12 77 664 484 275 18 ?/FONT 三、可溶性物质检查 BALF 离心液的上清液中含有复杂的可溶性成份，例如各种蛋质、酶类、脂类等（表 13-3） 。这些成分的来源有：被动漏出者（如白蛋白、血清类粘蛋白） ；主动转运者； 局部产生分泌成分。这些物质反映肺泡表面衬液成份，其测定对了解某些肺部疾病的病 变特征，研究发病机制提供重要手段。 表 13-3 BALF 检测的可溶性物质 溶质 浓度近似值 溶质 浓度近似值 总蛋白 70g/ml 纤维连接蛋白 30-150ng/ml 白蛋白 70g/ml 白细胞弹性蛋白酶 + 免疫球蛋白 胶原酶 + IGG 2.5-10g/ml 血管紧张素转换酶 + IGA 2.5-6g/ml 极性脂质 78g/ml IGM 100ng/ml 非极性脂质 45g/ml IGE 0.06-0.3g/ml 前列腺素 E 200-2000pg/ml 1-抗胰 蛋白酶 1-2g/ml 血栓素 B 25-85pg/ml 2-巨球蛋白 0.04g/ml 癌胚抗原 0.8ng/ml 转铁蛋白 4g/ml 四、微生物学检查 1涂片 BALF 不像痰液那样易受上呼吸道杂菌的污染，也不含气管和左右大支气利 害的分泌物，含非病原性阿菌很少，故其涂片检菌的意义较大。取 BALF 沉淀物进行本兰 氏染色与抗酸染色检查，对结核分支杆菌的检查有较大意义。 2培养：严格无菌操作采 BALF 进行增菌培养或取其沉淀物直接分离培养，是检查 支气管和肺部感染的重要方法，不仅适用于对细菌和真菌等检查，也适用于对支原体的培 养和病毒分离，当培养的细菌为 105CGU/ml 时被认为有诊断意义。但标本采集方法复杂。 五、寄生虫学检查 1卡氏肺孢子虫：人类一般受感染后多无明显症状。但若患者的免疫功能低下，特别 是 AIDS 患者和大量使用免疫抑制剂的患者易受感染，并可引起严重的间质性肺炎。于患 者痰中不易查到寄生虫，而 BALF 沉淀物检出的阳性率较高。 2卫氏并殖吸虫卵：轻型肺吸虫病患者痰中可能查不到虫卵，而可从 BALF 沉淀物 中查到。 除以上各项检查外，还可检查 BALf 中有无其它异特。若在 BALf 沉淀物中查到石棉 小体，有助石棉肺的诊断。 六、临床应用 由于 BAl 能获取肺泡表面衬液，因此对其内容物的检查有助于肺部疾病的诊断、治疗、 预后判断及发病机制研究。其应用范围越来越广，此处钗做重点介绍： 1肺部感染的病原学诊断：BAL 检查在下呼吸道感染的检查中占有重要的地位。 BAL 可以收集较大范围肺实质的肺泡表面衬液标本，可进行原虫、病毒及细菌学等检查。 对于普通细菌感染者其细菌培养大于等于 105cfu/ml 时为确定感染的阈值。但对于某些特 殊感染，如在 BALF 中分离出结核分支杆菌、军团菌即可做出诊断。BALF 对免疫功能低 下合并肺感染的诊断也很有帮助，如对巨细胞病毒感染的敏感性达 96%，对肺孢子虫的感 染敏感性为 85-90%。 2BALf 检查：诊断呼吸道原发性或继发性恶性肿瘤有较好效果，也包括周围性肺癌、 弥漫性肺恶性肿瘤（如支气管肺泡癌） 、小细胞肺癌等。但 BALF 检查结果受癌类型和肿 瘤大小的影响，以腺癌和肺泡癌阳性率最高。 3对间质肺疾病的诊断、治疗评价及预后提供帮助 （1）外源性变应性肺泡炎：急性期 BALF 细胞总数明显增加，达对照组 4 倍。急性 期早期肥大细胞增多，恢复后降至正常。淋巴细胞亦明显增多，其亚群以 CD8+增多为主， CD4/CD8 比值降低，CD57+ 和 CD16+也增加。临床上认为 BAl 是外源性变应性肺泡炎最 敏感的检测手段。优于 X 线胸片及肺功能检查。 （2）结节病：BALF 细胞总数增高，主要为 T 细胞增多，以 CD4+为主。CD4/CD8 比 值明显增高，这些变化有重要的诊断意义。中性粒细胞和肥大细胞的增多预示病人闰变的 有可能发展为纤维化。 （3）特发性肺间质纤维化：BALF 中主要为中性粒细胞增多，嗜酸性粒细胞也可能增 加，据此与以淋巴细胞增多为主的其它崩牙肿肺疾病鉴别。 BAL 做为一种特殊的检查方法对某些其它肺疾患如支气管哮喘，成人呼吸窘迫综合征、 弥漫性肺出血、肺泡蛋白沉着症（BALF 外观呈乳状）等的临床意义也处于研究和观察之 中。 BALF 检查中细胞计数和分类包括 T 淋巴细胞亚群分类，经过多年的研究已基本标准 化了，但对可溶性物质检查还存在某些问题，主要是灌洗液量与方法不同，对肺衬液稀释 程度影响测定结果，尚须进一步的研究。 BAL 应用越来越广泛，虽然其操作复杂，有上些生理性改变及轻度并发症，但只要选 好适应的证，操作正确，还是一种安全有效的检查方法。进行 BAL 检查的禁忌证有：严 重的肺功能损害者；新近发生急性心肌梗死患者；新近发生大咳血者；活动性肺结 核未经治疗者等。 支气管肺泡灌洗检查介绍： 以纤维支气管镜对支气管以下肺段或亚肺段水平，反复以无菌生理盐水灌洗、回收，对其一系列检 测和分析。 支气管肺泡灌洗临床意义： 以纤维支气管镜对支气管以下肺段或亚肺段水平，反复以无菌生理盐水灌洗、回收的一项技术，对 其回收液进行细胞学、生化学、酶学和免疫学等一系列检测和分析。 1.全肺灌洗：用于肺泡蛋白沉着症、 矽肺 、肺泡微石症、哮喘持续状态等的治疗。 2.肺段灌洗：主要用于弥漫性间质性肺纤维化、石棉肺和卡氏肺囊虫肺炎的诊断，对弥漫性肺泡癌的 诊断，也有重要价值。 近二十年代里无论从 BALF 检验测定规模和检验测定项目上都有了长足的进展。从 BALF 中细胞学、单克隆抗体标记 T 淋巴细胞亚群、可溶性卵白、酶类到细胞因数、有生命的物 质活性介质等方面检验测定,揭晓了大量研究结果，对某些肺疾病的病发机理、诊断、辨别 诊断和病变勾当性、疗效及预后判定等方面已经显示出重要临床价值。现就 BAL 操作技能、 BALF 实验室检验测定以及临床应用等方面做简要叙述。 一、 支气嗓肺泡灌洗操作方法 常规纤支镜气道检查后在活检刷检前做 BAL。对漫溢性间质性肺疾病凡是选择右肺中 叶(B4 或者 B5)或者左肺舌叶,局限性肺病变则在相应支气嗓肺段进行 BAL。首先对拟在 要灌洗肺段经活检孔灌注 2%利好卡因 12ml,做灌洗肺段局部麻醉, 之后将纤支镜顶端楔 入段或者亚段支气嗓开口处,再从活检孔快速灌注 37灭菌 SL 盐水，立即以 50100mmHg(6.6613.3kPa)负压吸引回收液体,每次灌注 3050ml,总量 100250ml, 一般不跨越 300ml,凡是回收率可达 40%60%。立行将回收液用双层无 菌沙布过滤,祛除黏液,并记载总量。装入硅塑瓶或者涂硅灭菌玻璃器皿中( 减少细胞黏着), 置于含有冰块的保暖瓶中,立即送往实验室检查。在支气嗓肺泡灌洗的技能操作时,必须注 重以下几点: 纤支镜选择,用于灌洗纤支镜末端直径 5.56.0mm,相宜于紧密楔入段或 者亚段支气嗓管口,防止大气道分泌物混入和灌洗液的外溢,保证 BALF 的满意回收量;在 灌洗过程当中咳嗽反射必须获患上满意的按捺,否则易导致支气嗓壁黏膜的损伤而造成灌洗 液的混血,同时也影响回收量; 灌洗的 SL 盐水需加温至 37,过冷或者过热将导致支气嗓 痉挛和刺激性咳嗽;负压吸引应保持在 50100mmHg,负压过大时导致支气嗓陷闭和 损伤,并影响回收量。 二、管肺泡灌洗液细胞学检验测定 （一）细胞总额和分类统计 1. 将上述回收灌洗液装入塑料离心管内以 1200 转/分,在 4下离心 10 分钟,上清(原 液或者 10 倍浓缩) 70储存 ,用做可溶性身分的检验测定。 2. 经离心沉淀的细胞身分用 Hanks 液( 不含 Ca2+Mg2+)再以一样条件离心冲洗两次,每 次 5 分钟。弃去上清后加 Hanks 液 35ml 制成细胞悬液。 3. 之后在改良的 Neubauer 统计台上统计 BALF 中细胞总额,一般以 1106/ml 表示。 如果细胞数过高时,再用 Hanks 液稀释, 调整细胞数为 5106/ml,并同时将玻璃管浸入碎 冰块中备用。 4. 细胞分类统计,采用特制细胞离心涂片装置, 加入备用细胞悬液(细胞浓度为 5106 个/ml)100l,在 4，1200 转/ 分离心 10 分钟,路程经过过程离心作用将一定量 BALF 细胞直接平铺于载玻片上,取下载玻片立即用冷风吹干, 置于无水乙醇中固定 30 分钟后行染 色,一般用 Wright 或者 HE 染色。 5. 在 40 倍光学显微镜下统计 200 个细胞,进行细胞分类统计。 （二）T 淋巴细胞亚群 1. 采用间接免疫荧光法,将上述获患上的 BALF 细胞身分,用 10%小牛血清 RPMI 1640 造就液 35ml 制成细胞悬液。 2. 将细胞悬液倒入玻璃平皿中,置于 5%CO2,37造就箱中孵育 2 小时, 进行贴壁措 置惩罚,去除肺泡巨噬细胞。经贴壁措置惩罚后的细胞悬液中,肺泡巨噬细胞显著减少, 淋巴 细胞相对于增多。 3. 取出细胞悬液,再用 Hanks 液冲洗离心一次,弃上清留 80100 ml。 4. 将经贴壁措置惩罚的细胞悬液分装 3 个小锥形离心管内 ,每管 2030ml, 用微量加 样器向标本中加单克隆抗体 CD3、CD4 和 CD8 各 2040ml,混匀置于 4冰箱中作用 12 小时。 5. 取出标本,先用 Hanks 液冲洗离心两次,以 12000 转/ 分离心 20 秒,之后加羊抗鼠 单克隆抗体各 2040 ml,置于冰箱作用 30 分钟。 6. 取现标本用 Hanks 液以一样速率和时间离心冲洗两次,弃上清留 20ml 充分混匀细 胞,取 1 滴于载玻片上加盖玻片。荧光镜下数 200 个淋巴细胞并计算出标有荧光的细胞阳 性率。 三、支气嗓肺泡灌洗检验测定技能在间质性肺疾病中的应用 漫溢性间质肺疾病(DILD)是一组临床特征相似免疫病理过程各异的浩繁肺疾病构成的 疾病谱，病因不明者占 65%,，其病发机理至今尚未完全清晰。间质性肺疾病(ILD)的早 期体现为肺泡炎,晚期为漫溢性间质性肺纤维化。此病的早期诊断、早期治疗是决定预后与 转归的要害。而路程经过过程 BAL 来收集检验测定 ILD 患者下呼吸道炎症免疫效应细胞 及其有生命的物质活性介质的变化,对 ILD 的病发机制,免疫病理过程以及诊断、辨别诊断 和判定病变的勾当性和预计预后都具备重要的临床价值。 （一）对 ILD 病发机制的研究 当吸入有害事物或者接触抗原后,首先连累到肺泡上皮细胞和血管内皮细胞,进一步激 活肺泡巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及肥大细胞。目前以为,肺泡巨噬细胞(Am)在致 肺纤维化中起到一个枢纽作用,Am 是一种数目至多, 分泌功效最强的炎症效应细胞,一旦被 激活可分泌 100 余种细胞因数。其中对肺纤维化起首要作用的细胞因数有血小板源性生长 因数(PDGF),白介素 1(IL-1)、白介素 6(IL-6),肿瘤坏死因数(TNF-) 、转化生长因数 (TGF),中性粒细胞趋化因数(NCF),成纤维细胞生长因数(FGFs)和粒细胞-巨噬细胞集落 刺激因数(GM-CSF) 。当肺部急或者慢性损伤后 ,这些个细胞因数抒发较着增长,它们彼此 作用,在调节、募集、活化多形核白细胞(PMN),淋巴细胞(LYM),成纤维细胞(Fib),内皮细 胞及 AM 本身具备重要作用,从而构成一个庞大的细胞因数网络。出格是 Am 被激活后分泌 IL-1,TNF-、TGF- 和 NCF 等细胞因数作用于肺内成纤维细胞并使其活化、增生导致分 泌及合成胶原增多,细胞外基质淤积导致肺纤维化的发生。 目前以为 IPF 的病发机制多是原因不明的抗原进入机体后, 首先激活肺内 B 淋巴细胞, 孕育发生免疫球卵白(IgG)。在 IgG 介导下抗原- 抗体结合形成免疫复合物，刺激活化 Am 不断自发地分泌、释放 PMN 趋化因数和促 Fib 活化增生的细胞因数 ,PMN 趋化因数趋化吸 引中性粒细胞(也吸引嗜酸细胞和单核细胞) 使之从轮回血迁徙至肺泡结构中聚集并活化。 是以,在 IPF 患者支气嗓肺泡灌洗液(BALF)中有较多的中性粒细胞。这些个被募集入肺并 活化的 PMN 路程经过过程释放氧自由基产物损伤肺泡壁的实质细胞,并路程经过过程释放 各种卵白催化水解酶(如胶原酶、弹性硬卵白酶) 等损伤肺泡壁的基质身分, 从而导致肺泡结 构的粉碎。Am 释放的促 Fib 增生因数,促使 Fib 活化增生, 分泌胶原增多,过多的胶原淤积 在肺实质内最终导致肺纤维化的形成。 在结节病中，以往以为结节病是细胞免疫功效低下（如淋转、E 一种植物的花花圆环 成，血中 T 淋巴细胞减少等）和组织液体免疫功效加强（血中 B 淋巴细胞和球卵白增长） 的自身免疫性疾病。近年来，借助于 BALF 检查，对结节病的病发机理有了新的熟悉和新 的相识。勾当期肺结节病 BALF 中淋巴细胞可以由正常的 7%上升到 15%30%。而 90%为 T 淋巴细胞。其中 T 匡助细胞（CD4）占上风。以是证实结节病是以肺局部细胞免疫功效 加强的自身免疫性疾病。 结节病是在原因不明抗原或者有丝裂素的刺激下，肺内 T 淋巴细胞被激活，活化的 T 淋巴细胞释放单核细胞趋化因数和巨噬细胞移动按捺因数，使血中单核细胞聚集逗留在肺 泡结构中。另外，活化的 PAM 释放 IL-1，在局部环境中激活 T 淋巴细胞，使之破裂增生。 以是结节病早期肺内是以 T 淋巴细胞和单核-巨噬细胞浸润为主的肺泡炎。当上述免疫效 应细胞构成肉芽肿时，细胞团中具备活性的 PAM 不断分泌 IL-1，刺激 T 淋巴细胞分泌 IL-2，进而刺激 B 淋巴细胞孕育发生免疫球卵白（即高球卵白血症） 。当病变进一步发展， 肺泡炎的细胞身分逐渐减少，而类上皮细胞不断增多，并在其分泌性肉芽肿引发因数作用 下，逐渐形成典型的非干酪样结节性肉芽肿。后期 PAM 释放纤维连结卵白，能吸引大量 成纤维细胞，分泌胶原纤维。最终导致肺纤维化形成。 （二）BALF 检验测定技能在 ILD 诊断的应用 1. 结节病： 结节病是一种原因不明的多系统遭到牵累的肉芽肿性疾病。 BALF 的细胞 身分和 T 淋巴细胞亚群的检验测定阐发, 对进一步相识结节病肺部的局部免疫过程，病变的 勾当性有着意要意义。结节病患者 BALF 的细胞总倍增长,在细胞分类统计中淋巴细胞百分 比增高(10%50%)。首要是 T 淋巴细胞增长,而 B 淋巴细胞相对于减少。用单克隆抗体 标记的 T 淋巴细胞亚群检验测定, 未经治疗的结节病 BALF 中 T 匡助/ 引诱细胞(CD4)增长, T 按捺 /细胞毒细胞(CD8)减少,CD4/CD8 比率增高。跟着糖皮质激素治疗病情好转, 其比 率下降。然而,外源性过敏性肺泡炎、慢性铍肺、淋巴瘤或者假性淋巴瘤和结节病等都可呈 现 BALF 中淋巴细胞百分比增长, 但它们的 T 淋巴细胞亚群检验测定却有较着的差别 , CD4/CD8 比率不增高 ,出格是外源性过敏性肺泡炎 CD4/CD8 比率减低。此外,结节病 BALF 中的血管紧张素转换酶增高, 免疫球卵白 IgG 减低。 2. 特发性肺纤维化：特发性肺纤维化(IPF)是以漫溢性肺泡单位慢性非特异性炎症和间 质纤维化为首要病理特征的疾病。急性/勾当期 IPF 患者肺泡灌洗液中细胞总额较着增高 (可高于正常 23 倍), 在 BALF 细胞分类统计中嗜中粒细胞百分比较着增高(可高达 25% 以上), 晚期有嗜酸粒细胞百分比增高。BALF 中嗜中性粒细胞百分比增高的间质性肺疾病 另有胶原血管病伴肺纤维化、亲族性肺纤维化、组织细胞增多症 X、ARDS 和传染。但从 疾病的肺外体现和胸脯 X 线独特的地方,能将这一类疾病辨别开来。 3. 外源性过敏性肺泡炎：外源性过敏性肺泡炎(简称 EAA)为吸入外界有机粉尘抗原事 物所导致免疫介导的肺部肉芽肿性疾病。BALF 中细胞学检查显示细胞总倍增高，在细胞 分类统计中淋巴细胞百分比较着增高。 急性期可有嗜酸粒细胞百分比增高,慢性期亦呈现 嗜中粒细胞相对于增高。BALF 中 T 淋巴细胞亚群检验测定,显示 T 按捺细胞/ 细胞毒细胞 (CD8+)增多, 而 T 匡助/引诱细胞(CD4+)相对于减少,CD4/CD8 比率减低,免疫球卵白 IgG 增高,这点与结节病完全差别( 结节病 CD4/CD8 比率增高,) 此外,外源性过敏性肺泡炎 病变绝大大都只限于肺脏,而结节病是全身多内脏器官遭到牵累,并从胸脯 X 线体现两者很 容易辨别。 4. 肺泡卵白淤积症：肺泡卵白淤积症(PAP)是一种少见疾病, 以过碘酸席夫(PAS) 染色 阳性的磷脂物在肺泡内过多沉着为特征。PAP 可分为特发性和继发性两种,当临床和放射线 学体现不典型时,PAP 常被误诊。一些研究证实 ,BAL 对 PAP 的诊断有重讨价值。从 PAP 患者 BALF 肉眼不雅察呈乳白色, 离心后可获患上深褐色沉淀物即可确诊。BALF 中细胞总 额和淋巴细胞百分比增长,CD4/CD8 比率增高,肺泡巨噬细胞相对于减少。离心涂片,用 May-Grunwald-Giemsa,MGG 染色后, 发明细胞外有大量的嗜碱性沉着物 ,胀大的沫子状 肺泡巨噬细胞和细胞碎片。这些个细胞外事物和巨噬细胞的胞浆身分用抗淀粉酶染色阴性 而 PAS 弱阳性。在电子显微镜下,其超微结构特征呈鞘磷脂样多层结构的小板层体。与其 它肺疾病比拟,BAL 对 PAP 具备较高的诊断率,大都病例不必作开胸肺活检。此外,BAL 在 PAP 患者的随访和治疗中也具备重讨价值。 5. 急性呼吸窘迫综合征：ARDS 是一种重症急性呼衰歇。在机械通气撑持下(吸氧浓度 50%PEEP5cmH2O)对 ARDS 进行 BAL 是安全行患上通的。ARDS 患者 BALF 中细胞 总倍增长大约是正凡人的 10 倍,嗜中性粒细胞增长至约 70%,卵白含量增长 40 倍。此外, 路程经过过程淋巴细胞亚型鉴定,发明 ARDS 患者 BALF 中 CD8+CD4+。 BALF 可溶身分中抗中性粒细胞弹性卵白酶活性加强,弹性卵白酶含量增长, 胶原酶活性 加强,1-AT 含量为正常对照的 60 倍。用 BAL 获患上的肺泡表面活性事物(PS) 与板层体 内 PS 身分相似,其中 90%是脂质 ,剩下首要是卵白质。BALF 中鞘磷脂含量升高,卵磷脂的 含量较着减低,糖脂含量较着升高,C- 反映性卵白浓度为正常对照的 24 倍。糖脂、C 反映 卵白均可按捺 PS 活性。促发了肺间质和肺泡水肿。 BAL 有助于对 ARDS 高危患者或者 ARDS 的早期诊断及病情监视检测和预后判定。 6. 肺嗜酸细胞性肉芽肿和嗜酸性综合征：该病为一组病因不明,与变态反映涉及的疾病。 肺嗜酸粒细胞肉芽肿又称原发性组织细胞增多症 X,它除开组织细胞异常外,尚有嗜酸粒细 胞的浸润。嗜酸性综合征系指一组肺部嗜酸粒细胞浸润,伴有或者不伴有四周嗜酸细胞增多 的疾病,又称嗜酸粒细胞学肺浸润 (Pulmonary InfiltrationEosinophellolia,PIE)。除 X 线体现为单侧或者双侧肺部浸润性、边沿模糊呈游走性小片或者大片非肺阶段性分布暗影 外,肺泡灌洗液中嗜酸粒细胞较着增多(40%80%)。 7. 肺泡出血性疾病：漫溢性肺泡出血综合征，包括肺出血-肾炎综合征 （Goodpastures 综合征）和肺含铁血黄素沉着症及血液系统疾病等疾病。肺泡出血 BALF 外不雅呈血性或者桔红色, 也可能为正常或者半透明状。在光学显微镜下, 与不抽烟相 比较，BALF 中细胞总额和 AM 百分比增长,并能不雅察到游离的红细胞,肺泡巨噬细胞中的 红细胞和充满含铁血黄素的肺泡巨噬细胞,即便没有血性 BALF,游离的红细胞或者 AM 内红 细胞存在,也应高度怀疑肺出血。是以, 为证实肺出血(出格是肺泡出血 )和检查肺出血的基 础疾病(如传染和恶性肿瘤 )时 ,BAL 是值当选用的方法, 尤其在血小板减少或者出血性疾病 时,BAL 是安全的检查方法。 （三）在 ILD 患者分类、疾病勾当性及预后判定 1.ILD 分类：关于 ILD 分类目前尚无同一尺度。大都学者倾向于按导致疾病的病因, 分原因已经明和原因不明两大类(在其它章节叙述) 。近年来跟着 BAL 技能的开展与应用, 发明差别的 ILD 患者在其 BALF 中的细胞身分亦有所差别。是以, 也有人主张按 BALF 中 炎症效应细胞相相比较例的差别,对 ILD 进行分类。 间质性肺疾病分类(基于 BALF 炎症效应细胞身分) 淋巴细胞-巨噬细胞增高的疾病 结节病 过敏性肺炎(Hypersensitivity Pneumonitis) 铍尘肺 淋巴细胞浸润性(淋巴瘤、假性淋巴瘤) 结石病 中性粒细胞-巨噬细胞增高的疾病 特发性肺纤维化(IPF) 亲族性肺纤维化 胶原血管病所致间质性肺疾病 组织细胞增多症 X 石棉肺 抽烟者 引自 Daniele,et al,Ann Intern Med 1985;102(经修改) 巨噬细胞-中性粒细胞型( 又称中性粒细胞性肺泡炎)。 BALF 中各种炎症效应细胞均增 多,但以巨噬细胞和嗜中粒细胞增长为主。出格是嗜中粒细胞占炎症细胞的 5%10%(正 常1,而结节病10%, 提示是高密度肺泡炎,病变处于勾当期, 应施用激素治疗。淋巴细胞比例相对于增高对激素 治疗效验好,如呈现嗜酸粒细胞相对于增多, 提示疾病处于晚期, 激素疗效差,预后不良。在肺 结节病患者 BALF 中淋巴细胞20%,CD4+/CD8+3.5 有助于本病的诊断(特异性94%), 活化的 T 淋巴细胞28%提示病变处于勾当期,需施用激素治疗。如呈现中性粒细胞和嗜 碱粒细胞增多,标记疾病处纤维化阶段, 激素疗效差。在外源性过敏性肺泡炎患者 BALF 中 淋巴细胞15%以上 CD4+/CD8+,有助于提示诊断;具备活性 T 淋巴细胞30% 提示病 变处于勾当期。 四、支气嗓肺泡灌洗检验测定技能在其它肺疾病中的应用 1. 肺部传染和寄生虫病：对机体免疫功效正常院外获患上性肺炎和院内获患上性肺炎 患者在病原菌未确定之前,可按照临床经验进行适当的诊断和治疗,然而对免疫受损或者免 疫缺陷患者肺部传染,因病情危重, 时间紧迫,准确的诊断和微有生命的物质学鉴定对选择正 确的治疗方案极为重要。当无创性痰、血造就不能稳固建立病原菌时,路程经过过程防污染 毛刷、BAL 和经支气嗓肺活检 (TBLB)可获取微有生命的物质学标本。如霉菌、曲霉菌、 肺包虫病、肺吸虫病和卡氏肺胞子虫肺炎等。其副作用小,诊断率高。据报道 BAL 对卡氏 肺胞子虫肺炎的诊断率90%,TBLB75%,而刷检仅有 32%。BAL 诊断下呼吸道时机性 传染出格对伴有免疫受损和免疫缺陷患者值当选用的方法。 2. 漫溢型和周边型肺部肿瘤：纤支镜检查目前仍是诊断支气嗓肺部肿瘤的重要手眼之 一,但对纤支镜视野以外漫溢型和周边型肺肿瘤常规活检和刷检诊断阳性率较着低