大鼠肝组织rna提取策略与注意事项

第一部分 RNA 提取策略 1、RNA 降解的原因内源性 RNAase 是造成 RNA 降解的最重要原因，因为人体 细胞自身就是几十分钟（20min？）mRNA 被降解一轮，所以不管是组织还是 细胞还是液体状样本在离开其中细胞的最佳生活状态后都应该尽快的被妥善的 方法保存起来。外源性 RNA 酶也是一个需要注意的因素，最常见的就是毛发 尤其头发，灰尘，唾液，塑料手套这四个兄弟。针对它们我们应该戴帽子，口 罩，橡胶无菌手套，在清洁灰尘少的地方提取 RNA。我上面说了内源性 RNAase 污染才是关键，所以有些同志没有注意这些对外源性 RNAase 的防护 RNA 也提取的很出色。但是如果你运气不太好的话外源性 RNAase 污染影响很 大的。 2、样品的取材 我们抽提 RNA 往往都是需要其 mRNA，而 mRNA 的表达量和 细胞或者组织的生长状态息息相关，我们取组织块应该避免取到坏死组织，而 细胞我们应该在其处于生长旺盛的时期收集（贴壁细胞消化要迅速，离心要稍 为快些，甚至可以不消化下来直接进入裂解步骤；此外还可以采取先震荡敲击 培养瓶的方法使细胞和培养瓶的结合下降，然后用吸管吹打培养基地方法把细 胞吹打下来，这样细胞的代谢不会明显的受到抑制。注意在平时传代的时候就 要注意观察细胞除了用胰酶消化下来以外是否还有其他比较简单的方法）（此 外还可以把培养液倒掉后迅速的加入裂解试剂开始抽提）。 3、待提取样品保存方法这些保存方法温度从 4 度到零下 196 度不等，选择哪一 种保存方法关键是要对这些保存方法的优缺点有清醒的认识。根据你需要的 RNA 种类可以做简单的分类。包括 RNA 病毒 RNA ，mRNA （各种），rRNA 等其中最容易降解或者破坏的就是 mRNA，最不容易损失的就是 RNA 病毒 RNA（因为有蛋白壳保护）。超低温保存： 特指液氮保存不管组织还是细胞 如果需要其中的 mRNA 必须在液氮中保存，-70 度等方法都是错误的方法，在 很短的时间内或许可以，但是长期是不可能的。-20-70 摄氏度保存： RNA 病毒的 RNA 可以在这个温度段安全的保存。但是其产生的 mRNA 还是必须超 低温保存。 4 度保存： 有特殊的保护试剂存在地情况下组织的保存：应该是离体后在 1min 内就放入液氮或者保护试剂中。由于提取 RNA 对组织块有一定量的要求，大 约 100mg 居多（脂肪细胞需要的量多的多，因为细胞是大大膨胀的），所以在 取材前就需要明确到底你需要的组织大概多大是 100mg，令少勿多。如果是取 临床的标本，就应该带上液氮罐子，DEPC 处理的器械，锡箔纸，线等在手术 室外等候，标本一切下就尽快进行切割（大概 100mg 一块），包装（锡箔纸内） ，捆扎（方便在液氮罐子中寻找），迅速丢入液氮罐子中，最好是 1min 内完成 （所以大家取材前一定要好好联系一下，不要到时候手忙脚乱的_）细胞的保 存：比较麻烦些，所以大多都是直接提取 RNA 再保存。建议离心收集后用特 殊保护试剂重悬后保存。 4、RNA 提取提取 RNA 可以分为总 RNA，mRNA ，Virus RNA（RNA 病毒） 几类 Trizol 即异硫氰酸胍- 苯酚法，这种方法的原理是：首先用强变性剂异硫氰 酸胍裂解细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性，释放出核酸。释放出来的 DNA 和 RNA 由于在特定 pH 时溶解度不同，分别位于整个体系中的中间相和 水相，从而使 DNA 和 RNA 分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀 RNA，就可以得到纯净的 RNA； Trizol 最早是 MRC 实验室的科学家发明的方法，后来把专利卖给了 invitrogen/Gibco，invitrogen/Gibco 将此方法推广到世界。他的 trizol 曾经由其他 公司 OEM 制作，现在已经自己生产。本来 Trizol 是一个专利的品牌，但是国 内也有不少仿制的品牌，基本的原理是一样，配方稍有不同。RNeasy kit： Qiagen 的王牌产品，号称适用于各种 RNA 抽提，其实在特殊的组织比如大脑， 肌肉，脂肪组织还是选择特殊抽提试剂为佳。此外细菌 RNA 抽提也最好使用 专用抽提试剂盒。这些产品 Qiagen 都提供。注意凡是 Qiagen 的试剂盒抽提应 该是没有 5S 带的，因为它将 5S 破坏掉了。其他的比如 roche，promega 等都很 好的是的。尤其 promega 性价比最高！ 注意各种方法对于组织都需要先碾磨，应该用陶瓷碾磨器，同时一定要在碾磨 同时不断的加入液氮。（少数牛人号称从来不加液氮也提取的很好，我只能说 他运气实在不错）。 特殊的 RNA 抽提试剂盒-mRNA 抽提试剂盒： 单纯的抽提 mRNA 的试剂盒 很少见到有人在使用，但是其具有一般 RNA 抽提试剂盒没有的优点，在一些 实验中有出奇致胜的效果，推荐 promega 的总 RNA 提取 KIT，效果与 Qiagen 差不多，价格便宜多了，性价比最高的好东东！ 试剂盒提取的其优点有以下几点： 1、提取得 mRNA 纯度高，因为对于很多实验 rRNA 其实也是一种污染，我们 只想 RT 我们需要的 mRNA，但是如果用特异性引物或者随机引物就会连 rRNA 一起 RT，造成大量的我们不需要的 cDNA 出现。 2、鉴定时观察是否有严重的 DNA 污染时非常方便。mRNA 抽提后电泳只是看 到淡淡的一条短拖影带，此时如果有 DNA 污染可以很容易发现，因为背景很 浅。 3、RNA 的鉴定 RNA 抽提出来之后，首先做的工作是分装保存，然后取其中一 管用于鉴定。鉴定方法如下： 对 RNA 的鉴定包括几个方面，第一是数量的鉴 定，第二是质量的鉴定，重点是质量的鉴定。 一般的琼脂糖凝胶电泳，注意不要用甲醛变性电泳（又不是做 northern，实在 没有必要）。电泳槽注意一定不要用 DEPC 处理，一定要保证电泳体系中有少 量的 RNAase 存在。分别在加样孔中加入 1，2，3lRNA 抽提溶液。在旁边加 入 DNA marker。1%琼脂糖凝胶， 10V/cm 的电压，电泳 10min 成像一次，看电 泳情况，如果 28s 和 18s 还没拉开，继续电泳 10min 成像，如果任没有拉开再 次电泳 5min。如果还没有分开多半 28s 已经遭到破坏，不可