家兔关节软骨细胞的分离与培养

家兔关节软骨细胞的分离与培养 实验动物 3 周龄新西兰大白兔 实验试剂 胎牛血清 , 胰蛋白酶 , II 型胶原酶, 台盼蓝 , DMEM 培养基, 甲苯胺 蓝染色剂 主要试剂配制方法 1.0.01mol/L PH7.2 一 7.4PBS NaCI 8.0 克 KCI 0.2 克 KH2PO3 0.2 克 Na2HPO312H2O 2.08 克 精确称量上述药品并充分溶解于 1000mL 三蒸水中，用 1mol/L HCI 和 1mol/L NaOH 溶液调整 pH 值至 7.2 一 7.4。 2.DMEM 培养液 将 DMEM 干粉一包溶于 1O00mL 三蒸水中，按说明书加入 NaHCO3，并加入 双抗(终浓度为:青霉素 100U/mL，链霉素 100U/mL)和维生素 C(终浓度为: 50mg/L)，调节 PH 到 7.0 一 7.2，超净工作台内过滤除菌。置一 200C 冰箱保存 备用。如需含血清的培养基，于使用前加入足量 56水浴灭活 30 分钟的胎牛 血清(FCS)。 .1.3 主要实验仪器 倒置显微镜, 数码照相机, 二氧化碳培养箱(2300 型),超净工作台(SW-CJ 一 IF 型), 低温离心机(Megafuge1.oR 型),电子天平(MAllo 型) 磁力搅拌器 .2 方法 .2.1 兔关节软骨细胞的培养与传代 将一只健康的三周龄新西兰大白兔耳缘静脉空气栓塞处死，备皮，用碘酒消 毒背部及四肢皮肤，在无菌操作下，在超净工作台内用手术刀削下双侧膝关节 软骨，以不渗血为度。充分漂洗软骨小块。用眼科剪将软骨组织剪成约 lmm3 小的碎块，收集置于离心管中，以 PBS 冲洗 2 次，向离心管加 10 一巧 mLO.% 胰酶。吹打成组织悬液，装入 50mL 玻璃培养瓶。放进二氧化碳培养消化 1 时。 消化后将培养瓶静置桌上，待软骨组织沉淀后，吸出胰蛋白酶。将配好 0.10kH 型胶原酶 10mL 以滤器过滤入培养瓶，加入 0.stnL 胎牛血清。放进二化碳培养 箱消化 4 一 6 小时。细胞从基质中释放于消化液中，经过滤除去未 被消化的软骨碎片，将消化液置于离心管中 100orpm、10min 离心，弃上清液 收集软骨细胞，加 DMEM 液，1000 印 m、10 而 n 离心，冲洗 2 次，弃上清液， 加入上述细胞培养液(含 10%FBS 的青霉素、链霉素的 DMEM 培养液)制成细胞 悬液，滤网过滤，血球计数板计数，并把细胞悬液稀释成 2x105/c 时的密度， 接种于 25c 衬的培养瓶中，血球记数板计数。以台盼蓝染色法检查死亡细胞比 例，死亡细胞比例约 10%左右。把培养瓶置于二氧化碳培养箱中进行软骨细胞 原代培养(温度 37，饱和湿度，50k 二氧化碳，950k 空气)。每日在倒置显微 镜下观察软骨细胞生长情况，72 小时后视细胞贴壁情况更换培养液，以后每两 天更换培养液一次。待软骨细胞铺满瓶底后，进行传代培养。 细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察软骨细胞聚集成片，待约 80%的细 胞汇合，即进行细胞传代。吸除培养液，PBS 清洗后，加入 0.25%的胰蛋白酶 ZmL，室温下静置消化 5 一 10 分钟，倒置显微镜下观察细胞质回缩，细胞重新 变成圆形，细胞间隙增加，少量细胞开始浮游，此时迅速而轻柔地倾去胰蛋白 酶溶液(不使瓶底细胞随胰蛋白溶液流失)。以 PBS 液轻洗一遍后加入新培养液。 然后吹打细胞使其散开重新成细胞悬液，按前述方法分瓶培养。每日在倒置显 微镜下观察软骨细胞生长情况并拍照，2 一 3 天换液 1 次，待软骨细胞铺满瓶 底后，再次进行传代。 1.1.2.2 软骨细胞的形态学观察以及组织化学染色鉴定 1.1.2.2.1 镜下观察软骨细胞并制作细胞爬片 每日在倒置显微镜下观察软骨细胞形态、生长情况，照相。将传一代细胞按 2x105/c 时的密度接种到铺有多聚赖氨酸盖玻片的 6 孔细胞培养板中，培养条件 与原代培养相同，制作细胞爬片。 1.1.2.2.2Gicmsa 染色光镜观察 细胞 70%融合时取出细胞爬片，放在冰醋酸与甲醇之比为 1:3 的固定液中固 定 10 分钟。晾干用 Giemsa 染液( 将 oiemsa 原液用 pH6.8 的 PBsl:10 稀释)染色 15 分钟。晾干后用二甲苯、透明树脂封片。倒置显微镜下观察，并行细胞照相。 1.1.2.2.3 甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型 细胞在盖玻片上长满后取出细胞爬片，PBS 漂洗二次，70%乙醇固定 20 分 钟以除去四价铵离子，以免影响染色，再用 PBS 漂洗二次后，吹干。加入甲苯 胺蓝乙醇液(甲苯胺蓝 0.29 溶于 30%乙醇 IO0ml 中配制而成 )染色 10 分钟，用 蒸馏水冲洗，倒置显微镜下观察并照相。因软骨细胞分泌的蛋白多糖能被甲苯 胺蓝异染，呈红色、紫红色，据此可鉴定软骨细胞的表型。 讨论 1.3.1 软骨细胞的原代培养方法 过去曾经广泛认为软骨细胞不具备分裂增殖的能力，故长久以来未能开展其 体外培养研究。1967 年，ManningandBonner 用胰蛋白酶和胶原酶联合消化关节 软骨，从坚韧的软骨基质中分离出来软骨细胞，获得数量充足且纯度比较高的 软骨细胞接种于培养液中进行体外培养，并发现其具备分裂增殖的能力，从此 开创了软骨细胞的体外培养技术，为研究 OA 提供了新的方法。因为成年动物 关节内可用于分离培养细胞的软骨总量较幼年动物少，而且成年动物的关节软 骨组织 容易存在损伤，在此基础上获得的关节软骨细胞本身的增殖、合成、分化功能 就比幼年来源的软骨细胞差20，所以本实验采用 3 周龄的新西兰幼兔获取软 骨细胞。关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，建立良好的机械和化学解离 方法，通过原代培养和传代培养，可分离培养出较高纯度的软骨细胞 12 。 机械分离时，需注意除干净软骨表面的滑膜组织。不能误带软骨以外的组织， 尽可能把软骨切碎至 于 lm 角 3 大小。软骨细胞的化学解离主要是用酶法解离，有联合酶消化法，单 酶消化法等【2。本实验采用胰蛋白酶和胶原酶 H 联合消化法。取材中消化 的时间至关重要，时间太短，软骨细胞不能充分游离，影响软骨细胞的收获量， 不于培养。胶原酶接触时间过长对软骨细胞有毒性作用，死亡的细胞机会增多， 样不利于培养 lz2。作者的经验是，先采用胰蛋白酶消化 1 小时，离心清洗后 再以胶原酶 H 消化 4 一 6 小时，镜下观察到细胞充分游离悬浮呈大团鱼子状即 可加入牛血清终止消化收集细胞。软骨细胞属于低氧、低代谢细胞，它适合在 PH 值 7.2-7.4 的培养液，10%胎牛血清，5%CO:中生长，胎牛血清对细胞的生 存增殖是可缺少的，维生素 C 是软骨细胞合成胶原必需的原料，对软骨细胞保 持还原性着重要的作用。原代细胞贴壁较慢，一般需要 24 一 36 小时，其分裂 增殖的速度较慢，而传代后贴壁和增殖的速度都大为增加，一般在 12 小时左右。 这可能原代细胞在消化分离时受到一定的机械或化学性的损害有关。软骨细胞 的接种度若过低，因为软骨细胞依靠自分泌或旁分泌的信号而存活，软骨细胞 只有接邻近软骨细胞释放的活性因子才能维持生理功能，故细胞易与基质间失 去联，细胞因子无法提供反馈调节，细胞出现去分化，呈成纤维细胞样，合成 H 型原的能力下降。合理的培养密度，有助于自分泌因子维持其表型和基质的 新代谢，阻止或减缓细胞的去分化23，2 。但过高密度的接种也会引起接 触抑制导软骨细胞死亡。所以在培养时，要注意细胞接种的密度。软骨细胞的 接种密度 2xl 护/c 时为宜。 .3.2 软骨细胞的表型鉴定以及实验用软骨细胞的选择 11 型胶原纤维是关节软骨的主要组成成分，软骨细胞能特异性地合成 11 型 胶纤维。它们相互交织为网状的微纤维形式，使得胶原纤维之间有较大的空隙 可容纳硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitinsulfateprotcoglycancSPG)分子和结水分子， 既起到关节软骨组织的支架作用又保证软骨组织富有弹性，能适应抗和耐磨需 求。胚胎期胶原纤维由 I 型转为 11 型，显然是遵循着形态和机能相统 的原则随软骨细胞逐渐分化成熟而实现的。除了胶原纤维，软骨基质中另一重 组分是蛋白多糖，它们填充在由胶原纤维构成的支架中，是软骨发挥正常生理 能的物质基础25 。在正常情况下，软骨细胞合成并调节其胞外基质中的结构 成分，使它们在合成与降解之间维持动态的平衡26。软骨细胞可以特异性产 生 H 型胶原及 CSPG，只有软骨细胞和视网膜神经细胞才具备合成 11 型胶原的 能力，其它细胞和组织则不能。甲苯胺蓝能使 CSPG 中的硫酸软骨素异染成紫 红色，故 11 型胶原免疫组化染色或甲苯胺蓝染色阳性，结合细胞的外形特征和 取材部位，均可作为对软骨细胞进行鉴定的手段27l。本研究采用甲苯胺蓝染 色的方法，证实所培养的细胞是纯化的软骨细胞，并保持了体内软骨细胞的基 本特性和表型。软骨细胞在体外培养过程中有两种转归:一是继续维持表型 (PhenotyPe)，具有分泌 11 型胶原蛋白和 csPG 的能力，二是发生去分化 (Dediffereniiation)I28。软骨细胞在体外培养过程中 fl 型胶原和蛋白多糖表达降 低而失去其生物学特性的 现象被称为“去分化”z9 一 30，细胞不仅形态发生改变，由多角形、椭圆形 逐渐变为梭形，而且所分泌的胶原蛋白不再是 11 型而成为 I 型，CSPG 的合成 能力也随之丧失。3 代以内的培养软骨细胞相对稳定，以圆形、类上皮细胞样 外形为主，细胞分泌基质形成群体后，变成梭形或多角形，但组织化学染色证 实其分泌硫酸软骨素，故也是软骨细胞，3 代以内的软骨细胞活性高，保持细 胞的表型，是实验研 究的理想细胞。3 代以后的细胞逐渐发生去分化，细胞体积增大，出现许多指 状突起，胞核增大，细胞增殖速度明显减慢，分泌基质的能力下降。逐渐丧失 其表型特征。但可作为软骨细胞退行性变的研究模型。有研究者认为在 5 代以 内软骨细胞表型可保持稳定22l，能用于试验研究，这可能与试验动物的年龄、 接种的密度以及培养的条件相关。国外有研究通过测定 H 型胶原和蛋白多糖的 变化，认为传代对细胞表型影