与pcr相关的计算机知识的应用课件

第一章 引物设计的原则 首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或 发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配） 。 围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length） 、产物长度（product length） 、序列Tm值 (melting temperature)、G值 (internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin） 、错误 引发位点（false priming site） 、引物及产物GC 含量（ composition） ，有时还要 对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。总结出以下的要点： 1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长 会导致其延伸温度大于74，即Taq 酶的最适温度。 2.引物3 端的序列要比5 端重要。引物3端的碱基一般不用A（3端碱基序 列最好是G、C、CG、GC） ，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另 外引物间3 端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对 PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 3.引物的GC含量一般为40-60%，以45-55为宜，过高或过低都不利于引 发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能在上 述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及 Tm 值保持接近（上下游 引物的GC 含量不能相差太大） ，以有利于退火温度的选择。如果 G-C比例超出， 则在引物的5端增加As或Ts；而如果A-T比例过高，则同样在5端增加Gs或 Cs。但也有认为：原来普遍认为PCR 引物应当有50% 的GC/AT比率的观点其实 是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、 长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链 温度，PCR引物的GC/AT 比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。 4. 引物所对应模板序列的Tm 值最好在72左右。 （Tm 值曲线以选取72 度附近为佳，5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应） ，至少要在 5580之间。 5. G值( 自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的 2 G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低， 且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值） ，如此则有利于正确引发反应而 可防止错误引发。3末端双链的G是02 kcal/mol时，PCR 产量几乎达到百 分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在6时只有40%、到8时少于 20%、而 10时接近于0。 6. 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相 似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出 非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引 发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错 误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可 以接受的。 7. Frq 曲线为Oligo6新引进的一个指标，揭示了序列片断存在的重复机率 大小。选取引物时，宜选用Frq 值相对较低的片断。 8. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚 体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行，与二聚体相关的一 个参数是碱基的分布，3端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成 的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。 虽然有些带有发夹环，其G为3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的 结果，但是如果它的3末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延 伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5末端对反应 就没有多大的影响了。 9. 以公式(4 G/C + 2A/T5)计算Tm值，即退火温度。选择较低Tm值的 引物的退火温度为反应的退火温度。4-6的差别似乎对PCR产量影响不大。最 好，保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75范围内。 10. 要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差 异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA 的解链温度也取决于它的长度，所 以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以 避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度 等于或小于500 bp，选用短的(1618 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer 3 的引物。有人用2023 mer引物得到40 kb的产物。 11. 在DNA测序和PCR中最好用5末端稳定(如GC 含量较多)，而3末端不太 稳定( 如 AT含量较多 )的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这 就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3末端稳定性低的引物在这些反应中 能起好作用的原因在于，接近或在3末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配 对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效 地引发反应，引物的5末端和中央部分必须与靶DNA 也形成双链。与此相反， 带有稳定的、GC丰富的3末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序 列配对，只凭借其3末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生 非专一产物。无论如何，寡核苷酸3末端最后5个核苷酸的稳定性小于9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸3末端越不稳定，假引发 的可能性越低。 12. 如果用3末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。 这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。 13. 引物的唯一性：为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列 就应当是唯一的，即在模板中没有重复序列。如果用哺乳动物基因组序列作为 模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。由此也可 知，应当避免使用同寡聚物(如AAAAAA)和二核苷酸重复(如ATATAT )。 14. 引物和产物的Tm值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。定下引物的 Tm值范围之后即可定下引物的长度范围。 15. 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确 定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后 的工作。 16. 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件较 差，比如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；有时 PCR产物要作为克隆对象插入到载体中表达，因此PCR引物设计的可选择度很 低。遇到这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件，这时，使用自动搜索引 物及正确地评价引物可使研究人员对实验心中有数。 4 17. 在设计克隆PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切点，必然存在发夹 结构，而且能值不会太低，这种PCR需要灵活调控退火温度以达到最好效果， 对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。 18. 如扩增出多条带（引发错配所致） ，不出目的带或出目的带很弱（引物 引发效率低下）。 第二章 Primer Premier 5.0 Primer Premier 是由加拿大的 Premier 公司开发的专业用于 PCR 或测序引 物以及杂交探针的设计，评估的软件。其主要界面同样也是分为序列编辑窗口 （Genetank） ，引物设计窗口（Primer Design） ，酶切分析窗口（Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif） 。这里我们主要介绍其引物设计功能，其他功 能的介绍请参看 Plasmid Premier2.02。 打开程序首先进入的是序列编辑参看，有一个语音校正的功能，即在输入 序列的时候，程序自动将碱基读出，以便用户进行校正，保证输入的正确和快 速。 点击该界面的按钮即可进入到程序的引物设计窗口。 5 该界面共分为四层，最上面一层左面是 5 个控制按钮，用于实现引物设计 中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑；右边是观察两 个引物在模板上结合位置的直观图以及对正链还是负链引物进行选择；第二层 是显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示；第三层是显示两个引物的 各种参数，包括给引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm 值、GC 消光系数、简并性；最后一层是给出的有关于引物的二聚体结构、发卡结构、 错配情况和引物间二聚体结构的预测，左边是显示是否存在以上各种对 PCR 扩 增有影响的结构，右边显示的是这些结构的位置，结构细节和稳定能，利用这 些参数可以对引物作出可靠的评价。 下面是根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要搜索的引 物的类型，包括 PCR 引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能 设定搜索引物的范围，以及最终 PCR 产物的长度和引物的长度等。 并通过来点击按钮来设置一些搜寻参数：这些参数包括引物的 Tm 值，GC 比，有简并性碱基，3端稳定性，引物的稳定性，重复序列，二聚体/ 发卡结构 和与模板及可能的杂质 DNA（需要从另外的序列文件中读入）之间的错配情况， 这些参数的设定可以根据要求变化，程序本身根据一定的标准分成从极高严谨 性到极低严谨性 5 个档次。该程序对引物的自动搜索过程是采用的排除法，根 6 据用户设定的引物范围和产物长度所规定区域内，所有的符合设定的引物长度 的寡核苷酸都被视为可能的引物，然后根据以上各个参数逐步去除不符合条件 的寡核苷酸，经过这种层层剔除的筛选，最终找到符合用户所设定标准的引物， 如果找不到合适的引物可以逐步降低要求来进行进一步搜寻。 搜寻到引物结果最终显示在下面的窗口中： 在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起 始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中 7 相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。其 中用 File 菜单中的 Parameter 命令可以对系统参数，PCR 反应条件和程序打分 系统进行设置，以帮助用户根据自己的特殊要求来进行引物设计，其中反应条 件按照引物浓度，单价离子浓度，Mg 离子浓度， Na 盐浓度等。而打分系统是 参照的以下公式： 利用该打分系统可以为对引物进行有效评估和和在引物之间进行对比选择 提供有效的依据。 最后还可以在利用引物编辑窗口对程序自动找到的或手工找到的引物序列 进行编辑，以便用户能在引物引入突变及加入特定的酶切位点，并对修改后的 序列的二聚体结构、发卡结构和错配进一步评估。其中是对修改后的引物再次 搜寻找出其最合适的引发位置。 8 除了以上的直观地对引物进行基本的设计和评估功能外，该程序还提供了 多种数据报告，主要通过 Report 菜单和 Graph 菜单中命令来实现： 9 另外，Primer Premier 在引物设计上一个比较独到的功能，就是能辅助进 行巢式 PCR 引物设计，在首先进行了引物自动搜索后，即可通过 Function 菜单 中 Multiplex/Nested Primer 命令进入巢式 PCR 引物设计，通过点中代表各个引 物的三角号来选择引物，然后根据最下面的窗口中各个引物之间的二聚体形成 情况来判断引物是否适合于作为巢式 PCR 的引物。另外该菜单中的 Database 命 令可以让用户建立自己的引物数据库，方便于查找和对照。 整体而言，Primer Premier 这个软件在引物设计方面还是比较优秀的，能够对全面的 给出一个引物的各种参数，并在多个必需的方面对引物作出有效的评价，但是在程序设计 中还有一些不足，例如在错配情况中，只对是否存在错配作出了预测，也给处理错配的稳 10 定性，但是错配对 PCR 的影响还需要根据错配是否发生在引物的 3来判断，3发生的错配 要比其他位置的错配对引物的引发效率的影响大的多，所以在使用中应当结合着错配的具 体配对情况来综合分析，这方面程序未能进行量化，只有通过用户根据经验判断；另外， 程序对于产物的 Tm 值和引物 Tm 值之间的差异也为能给出评价，如果二者差异较大（如 22） ，则容易造成退火时引物模板和模板模板退火之间的竞争。而在结果输出方面， 该程序也只能以图文格式打印，无法转换成文本格式。 第三章 Oligo 6.0 在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复 杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。 Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和 G 图；Oligo 6.0 的界面更复 杂，出现三个图，加了个 Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一， 就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。 oligo 的下载和安装我就不多说了，打开 oligo 相信也无需多讲。打开 oligo 的页面如下： 11 单击 file 菜单再点 open 或点击“打开”快捷图标或者用快捷键 “CTrlO”可打开下面的窗口，在打开的 OPEN 窗口内选择 FreqSeq 再点“打 开” 选择 drosfr 或者其它一个文件点击“打开”，出现以下窗口，点击 “window”， 12 再点击“Tile”，出现以下窗口： 图中显示的三个指标分别为 Tm、G 和 Frq，其中 Frq 是 6.0 版本的新功 能，委邻近 6 至 7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。 该频率高则可增加错误引发的可能性。 因为分析要涉及多个指标，起动窗口的 cascade 排列方式不太方便，可从 windows 菜单改为 tile 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如 Frq，这 样界面的结构同于 Oligo 5.0，只是显示更清楚了。 G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的 G 值在 5端和中间值比 较高，而在 3端相对低（如图：） Tm 值曲线以选取 72附近为佳，5到 3的下降形状也有利于引物引发 聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的 重复机率大小。选取引物时，宜选用 3端 Frq 值相对较低的片段 13 再点击 Search 再点“For Primers and probes”或使用快捷键 F3 ， 出现以下窗口，点 OK 就 OK 了。当然你也可以点击“Prameters”和 “Search Range”选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度。 14 出现 Search Status 窗口，点“OK”， 出现 Primer pairs 窗口，代表引物对的编号，依次为引物对所处的