973 三维培养干细胞自我更新与定向分化的调控网络

四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 第一年 1 构建适合不同类型干细胞培养的三维支架，建立干细胞三维培养体系。 2 三维培养体系下干细胞表型研究，并与二维培养体系相比较。 3 建立三维培养条件下干细胞定向分化的研究体系，检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化 过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化及细胞功能等。 4 用二维培养的细胞作为实验材料，建立稳定的蛋白质/ 磷酸化蛋白质分离、纯化、质谱学鉴定、以及生物信 息学分析的实验和数据分析体系。 5 模式动物干细胞体内观察体系和小鼠脑内立体定位细胞导入的方法研究。 6 制备荧光光谱从可见光区到近红外区的量子点和超顺磁纳米颗粒，对其表面进行功能化修饰，对量子点荧光 性能研究。 1 选择适宜干细胞培养的三维培养材料，建立干细胞三维培养体系。 2 获得三维培养干细胞形态、增殖情况、凋亡情况等细胞表型结果。 3 初步建立三维培养条件下干细胞定向分化体系。 4 建立成熟的能鉴定超过 3000 个干细胞总蛋白和 1000 个磷酸化位点的实验体系。 5 获得多个稳定的转基因线虫株系，并完成系统跟踪神经干细胞及其分化子细胞在体内的生成、迁移以及分化 过程；得到小鼠脑内细胞导入的立体定位参数。 6 制备得到高质量的量子点和磁性粒子，并对其表面进行生物相容性修饰；完成单分子/单量子点荧光成像系 统搭建。 发表论文 3-5 篇 第二年 1三维胶原支架材料的修饰、优化 2三维培养干细胞的自我更新相关基因的表达研究。 3三维培养干细胞定向分化的研究 4制备二维和三维培养条件下干细胞的蛋白质样品，并应用 IMAC 技术和免疫亲和层析技术纯化磷酸化蛋白，乙酰化 蛋白、以及泛素化蛋白，并进行初步的质谱学分析。 5获得二维和三维不同培养状态下的干细胞，提取细胞 RNA，利用 microRNA 芯片进行高通量筛选。对筛选到的序列 进行生物信息学分析。 6检测以 Wnt，Notch 为代表的信号分子对神经干细胞体内维持及定向分化的影响。开展全基因组 RNAi 筛选，确定 与体内干细胞定向分化相关的潜在靶基因。 7优化近红外量子点和磁性纳米颗粒对三维培养的神经干细胞在体外进行标记的条件， 并将经纳米材料示踪标记的 神经干细胞将通过立体定位的方法直接导入到包裹小鼠纹状体的脑室侧壁，即神经干细胞的 niche 区。 8利用特异性的识别分子对量子点进行修饰，制备特异性修饰量子点，通过单分子/单量子点荧光共定位技术研究量 子点对细胞及其亚结构组分的特异性标记，并进行体外干细胞诱导分化及标记；优化磁共振影像技术中磁共振影像脉 冲序列、空间分辨率和以细胞数量为基准的信号灵敏度等系统指标。 1初步获得二维、三维培养干细胞自我更新和定向分化相关基因表达差异。 2制备能够进行 5 次重复实验的二维和三维干细胞总蛋白样品。其中每个总蛋白样品不少于 1 毫克，每个蛋白质修饰 的样品不少于 500 微克。 3确定二维和三维培养的干细胞在生长和分化过程中 microRNA 的时空表达谱。系统发现和鉴定一批二维和三维培养 条件下未分化干细胞和经诱导分化细胞中有表达差异的 microRNA。 4 探明以 Wnt，Notch 为代表的信号分子在神经干细胞体内维持及定向分化中的作用， 确定几个与体内神经干细胞 定向分化相关的靶基因。 5 完成三位培养神经干细胞体外纳米材料标记的适宜条件和干细胞脑内导入。 6实现量子点对细胞及其亚结构的特异性标记，实现单分子水平双色荧光共定位测量，定位精度20nm；完成对磁共 振影像技术的各种优化指标。 发表论文 5-8 篇 第三年 1三维培养干细胞发育潜能鉴定。 2三维培养干细胞自我更新的调控网络研究。 3三维培养干细胞定向分化的调控网络研究。 4大规模的定量蛋白质组学分析。系统地鉴定并比较二维和三维培养条件下细胞内蛋白质表达和翻译后修饰的差异。 5 microRNA 基因结构和表达调控研究：microRNA 基因结构分析，包括启动子、转录起始位点、可能的内含子等；重 点分析独立转录的 microRNA 基因的上游调控元件；用报告基因系统研究 microRNA 基因的启动子和转录调控因子。 6对 RNAi 筛选获得的靶基因进行初步表达图谱分析，解析其在神经干细胞定向分化中可能的细胞自主或非自主性行 为，并获得相应突变体，进一步分析该靶基因功能，开展以 EMS 为主的化学诱变，分离神经干细胞定向分化有缺陷的 突变株系。 7小鼠体内纳米示踪标记，系统地检测外源神经干细胞在体内的维持、分化行为。同时使用核磁共振活体成像技术， 分析外源神经干细胞在体内的增殖、定位、迁移、分化等。 8将近红外量子点或磁性纳米粒子标记的干细胞在体外进行标记，研究适合近红外成像的激光共聚焦显微技术，然后 利用荧光信号进行二维培养干细胞在老鼠体内行为示踪，实现活体干细胞的标记；利用磁共振影像示踪技术系统研究 二维培养干细胞移植小鼠脑部后的维持分化过程及其功能。 1获得二维、三维培养胚胎干细胞发育潜能差异结果。 2确定二维、三维培养干细胞调控网络差异。 3明确 mTOR 信号通路在干细胞定向分化中的作用 4确定新发现的 microRNA 的基因结构；确定一些 microRNA 的启动子元件和转录调控因子。 5揭示某些细胞因子、小分子化合物在人类心肌分化上的作用机制。 6通过 5 次重复实验， 定量鉴定出超过 3000/1000 个二维和三维培养干细胞的总蛋白 /磷酸化位点，以及不少于 50 个乙酰化和泛素化位点。 7进一步确认与神经干细胞维持分化有关的几个靶基因的功能，并分离神经干细胞定向分化缺陷株系。 8完成约 60-80 只小鼠的脑内神经干细胞导入，系统地分析外源神经干细胞在小鼠脑内的定位、迁移、维持与分化。 9实现二维培养干细胞的近红外量子点标记三维荧光成像技术和磁性纳米粒子的活体磁共振成像。 发表论文 5-8 篇 第四年 1三维培养干细胞自我更新和定向分化的调控网络进一步研究。 2 生物信息学分析，找出三维培养条件下干细胞自我更新和定向分化的调控网络，并用生物化学和分子生物学 的手段对蛋白质组学和生物信息学的研究结果进行独立验证。 3 microRNA 在干细胞自我更新和定向分化中的功能研究和靶基因的鉴定。利用多种蛋白标记，深入分析化学 诱变获得的突变体其表型产生的根源，开展基因克隆，表达谱建立等工作，结合遗传互作，蛋白质互作，找到哺乳动 物中相对的同源蛋白，通过 RNAi 等基因敲除手段研究其在三维培养干细胞中调控干细胞维持和分化的作用。 4 将三位培养神经干细胞将通过立体定位的方法移植到舞蹈病模型小鼠脑内，功能上评估外源干细胞参与神经 组织修复的能力。 5 利用活体荧光成像手段或者核磁共振成像技术对三维培养的干细胞和活体干细胞进行示踪。建立基于荧光成 像的三维培养干细胞分化过程的定量分析手段；利用磁共振影像示踪技术系统研究三维培养干细胞移植体内后的维持 分化过程及其功能，在单纳米粒子水平研究干细胞结构的特异性标记技术，实现纳米示踪与成像。 1 争取确定 15-20 个重要的磷酸化位点，找出调控三维培养干细胞自我更新信号调控网络的关键分子。 2. 阐明在干细胞定向分化中 mTOR 信号传导通路是否起关键调控作用。 3. 筛选多个影响干增殖分化的 microRNA；鉴定多个 microRNA 调控的靶基因并进行相关功能研究。 4. 揭示某些细胞因子、小分子化合物在人类心肌分化上的作用机制。 5通过系统地研究与神经干细胞维持分化有关的几个靶基因，确定靶基因间的相互调控关系以及在哺乳动物三位培养 干细胞中的作用 6完成约 60 只舞蹈病模型小鼠的脑内神经干细胞导入，系统地从功能上分析外源神经干细胞参与神经退行性疾病模 型小鼠脑内神经组织的修复。 7实现三维培养干细胞的近红外量子点标记三维荧光成像技术和磁性纳米粒子的活体磁共振成像。 发表论文 5-10 篇。 第五年 1确定调控三维培养干细胞自我更新和定向分化信号调控网络的关键分子的基础上，对其上下游的调控因子及调控 机制进行深入研究。 2进一步确定神经干细胞体内维持、定向分化调控网络。进一步从病理学