医学课件fish技术在肿瘤病理诊断及肿瘤分子靶点治疗中的应用

FISH技术在肿瘤病理诊断及肿瘤分 子靶点治疗中的应用 中山大学肿瘤防治中心 分子病理诊断实验室 王芳 邵建永 细胞遗传学技术 原理：通过荧光标记的 DNA探针与细胞核内的 DNA 靶序列杂交 观察：荧光显微镜 原位观察（细胞、组织）细胞核 彩色探针信号 目的：获得细胞内多条染色体 (或染色体片段 )或多种 基因状态的信息。 Fluorescence in situ hybridization （ FISH） 用已知的标记单链核 酸为探针，按照碱基 互补的原则，与待检 材料中未知的单链核 酸进行异性结合，形 成可被检测的杂交双 链核酸。由于 DNA分子 在染色体上是沿着染 色体纵轴呈线性排列 ，因而可以探针直接 与染色体进行杂交从 而将特定的基因在染 色体上定位 荧光标 记探针 探针变性 样本 DNA变性 杂交 原理 FISH技术的特点 操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合， 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析 方法敏感，能迅速得到结果， 24小时就可以完成检测 标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或 未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测 centromere telomere subtelomere locus specific whole chromosome paint CSP探针：染色 体着丝粒探针 GLP探针：位点 特异性探针 WPP探针：全染 色体或染色体区 域特异性探针 FISH探针的种类 操作流程简图 制片 预处理 FISH结果分析 破坏细胞膜利于探针 杂交。 蛋白酶消化、 HCl处理 变性 杂交 洗涤 复染 FISH技术在乳腺癌检测中的应用 乳腺癌 Her-2基因 l 致癌基因： Her-2基因； l 位点： 17q11.2-q12； l 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源 ）； l 25-30% 乳腺癌病人都有 HER-2的扩增； l HER-2基因扩增是决定 Herceptin治疗 是否有效的关键 性指标。 Her-2基因的检测方法 检测方法 检测指标 优点 缺点 IHC Her-2蛋白 费用低 光镜即可观察结果 准确性差，主 观性强，假阳 性率高 CISH Her-2 DNA 光镜即可观察结果 对低度扩增及 染色体非整倍 扩增检测灵敏 度下降 FISH Her-2 DNA 对于低倍、高倍染色 体非 整倍性扩增检测 准确性高，灵敏度特 异性好，结果判断客 观 相对费用较高 疾病 名称 检测探针 标记颜 色 探针定位 探针名称 乳腺 癌 GLP Her2 / CSP17 红 /绿 Her2： 17q11.2-q12 CSP17: 17p11.1q11.1 CSP17:17号染 色体着丝粒 正常 : 2红 /2绿 异常 : 红信号 大于 2为异常细胞 (绿色信号不少于 2 个的细胞 ) Her-2基因 FISH 探针组 DAPI染色后与 HE切片对比图 观察浸润部分 导管内癌 结果判断 统计 Ratio值（计数 浸润性部分 的 20个细胞） l Ratio值 20个细胞核中红信号总数 /绿信号总数 l Ratio 1.8 为阴性结果 l Ratio 2.2或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果 l 比值 2 4为低度扩增 l 4 10为中度扩增 l 10为高度扩增 lRatio在 1.8-2.2 之间时，则需要再计数 20个细胞核中 的信号。如仍为临界值，则应在 FISH检测报告中注明。 A. 无须计数的大簇团信号 （高度扩增） B. 颗粒状信号（ R10，高度扩增） C. 须计数的颗粒状信号 （ R=3.5，低度扩增） A C B Her-2基因扩增状况 Her-2基因无扩增情况 红信号数 2，同时绿信号非整倍体 R30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜高强度着色 免疫组化 （ 3+） 与 FISH对比图 40 100 住院号： 177319 浸润性导管癌 级 IHC： + FISH：呈 簇团状高度扩增 免疫组化 （ 2+） 与 FISH对比图 1. 30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜 弱至中等 着色 40 住院号： 175465 浸润性导管癌 级 IHC： + FISH： Ratio5，中度扩增 100 免疫组化 （ 2+） 与 FISH对比图 2. 30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜弱至中等着色 40 100 住院号： 176921 浸润性导管癌 级 IHC： + FISH： Ratio 1.45，无扩增 30%的肿瘤细胞弱的着色 免疫组化 （ 1+） 与 FISH对比图 1 40 100 住院号： 175689 浸润性导管癌 级 IHC： + FISH： Ratio 1.62，无扩增 免疫组化 （ 1+） 与 FISH对比图 2 40 100 住院号： 175895 浸润性导管癌 级 IHC： + FISH：簇状扩增 30%的肿瘤细胞弱的着色 免疫组化 （） 与 FISH对比图 1 10040 住院号： 176846 浸润性导管癌 级 IHC： FISH： Ratio 1.02， Her2基因无扩增 7% 的细胞出现黄色融合信号 病例 1： 会诊 84363， 男 ， 74y l 腹腔肿物； lFISH： 54%的细胞可见融合 信号； l 诊断 ： FL 。 4 40 100 病例 2：会诊 84362，女、 36 l 颈部肿物 l 抗炎治疗后（出现变性坏死） l 诊断： DLBCL l FISH：阳性， 10%的细胞可 见融合信号 40 IHC:BCL2 100 t (8;14) (q24;q32) 染色体易位 意义： l t (8;14)易位后形成的 IGH/MYC基因能编码完整 MYC蛋 白， IGH基因附近的增强子使 MYC过表达 应用范围： l 所有 Burkitt淋巴瘤都有 t (8;14)易位 l 诊断不典型 Burkitt淋巴瘤须有 t (8;14)易位的 MYC异常 l可见于继发于滤泡性淋巴瘤的前驱 B淋巴母细胞白血病 / 淋巴瘤 MYC 8q24 region 14q32 region C region V regionV regionC region IGH/MYC, CEP8 Tri Color, Dual Fusion Translocation Probe 探针杂交示意图 正常 细胞核 IGH/MYC, CEP8 三 色双融合 易位探针杂交后显示 2R2G2A信号 检测探针 标记颜色 探针定位 LSI IGH green 14q32 LSI MYC orange 8q24 CEP 8 aqua 8p11.1-q11.1 正常 :2G/2O/2A 异常 :1G/1R/2F/1A或 2A 肿瘤细胞核 IGH/MYC 双色双融合 易位探针杂交后显示 1O1G2F信号 10 40 病例 3: 399318， 女 、 5y l 颈淋巴结活检； l ISH: EBERs（ +）； l FISH:45% 的细胞可见融 合信号； l诊断：散发性经典型 BL 。 病例 4: 405618， 女， 21y l盆腔肿物穿刺； l ISH: EBERs（ +）； l FISH: 23%的细胞可见融合 信号； l诊断：考虑为散发性经典型 BL。 4 40 活检穿刺标本 病例 5:399625，男、 42y l ISH:EBERs（ -）； l 经多学科大会诊； l 诊断：较符合散发性非 典型 BL； l FISH: 25%的细胞可见 融合信号； 4 40 活检穿刺标本 t (11; 14)(q13; q32) 染色体易 位 意义 l t (11;14)易位后形成 IGH/CCND1基因 ， IgH基因附近的增 强子使 Cyclin D1过表达 应用范围 l 套细胞淋巴瘤的 诊断性 指标 l 也出现过零星其它淋巴瘤 t (11;14)易位的检出 IGH/CCND1Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 11q13 region 14q32 region C region V region J chain 简洁示意图 探针杂交示意图 肿瘤 细胞核 IGH/CCND1双色双融 合易位探针杂交后显示 1R1G2F信号 细胞核 IGH/CCND1双色双融合 易位探针杂交后显示 2R2G信号 检测探针 标记颜色 探针定位 IGH/CCND1 green/orange IGH: 14q32 CCND1: 11q13 正常 : 2O/2G 异常 : 1O/1G/2F 10 40 IHC:CyclinD1 病例 6: 393301， 男 ， 40y； l 肘部肿物； l IHC： CyclinD1弱阳性； l 经科内会诊； l FISH:21%的细胞 可见融合 信号； l诊断 ： MCL 所示箭头为染色体易位 产生的融合信号（ 100） 10 CyclinD1 40 病例 7: 386766， 女 ， 67y l 扁桃体活检 2块 ， 直径 0.3CM l IHC： CyclinD1弱阳性； l FISH:45%的细胞可见融合信号； l诊断：不排除 MCL的可能，重取 活检； 形态不典型 +IHC不理想 所示箭头为染色体易位产生的融合 信号（ 100） FISH检测标本要求 新鲜活检或手术切除标本； 石蜡包埋组织或石蜡切片（ 3 5um）； 肿瘤穿刺活检组织或细胞涂片； 骨髓穿刺组织尽量送涂片，不用活检组织（因为 脱钙需要使用盐酸，破坏 DNA）； 肿瘤细胞阳性的胸腹水涂片； 一般在 3个工作日后可以发出检测报告； EBV-DNA定量 PCR结果的稳定 性分析 EBV-DNA定量 PCR标准样品扩增曲线 107 106 105 104 鼻咽癌检测结果比较 5个不同样品重复检测 ； 扩增可靠性 99.4%； 每个样品同时进行 5次 重复，结果重复性很 好； 同时扩增，结果存在 显著差异的为 8； 不同时间扩增，结果 存在显著差异的为 6.7 。 5个样品，每个样品分 5管 抽提 DNA后，同时进行 定量 PCR检测结果 86987 21134 (24%) 62902.67 786.2834080716EB07 82113.15 1026.4144080716EB07 88629.72 1107.8715080716EB07 80556.48 1006.95605080716EB07 120732.72 1509.159080716EB07 6579 2729 (41%) 7632.05 95.40062080716EB06 1822.53 22.78165080716EB06 8748.75 109.359375080716EB06 7055.78 88.19726080716EB06 7633.76 95.42204080716EB06 138 370 (268%) 0.00 0080716EB05 0.00 0080716EB05 0.00 0080716EB05 827.34 10.341734080716EB05 0.00 0080716EB05 Final resultsQuantitySample Name 3335827 485146 (14%) 3038537.20 37981.715080716EB09 3244077.60 40550.97080716EB09 3300465.28 41255.816080716EB09 4161768.80 52022.11080716EB09 2934283.76 36678.547080716EB09 489681 47968 (10%) 497186.24 6214.828080716EB08 498939.18 6236.7397080716EB08 458680.