DB 37T 3105—2018 向日葵种子纯度蛋白电泳检测标准

ICS 67.060B21DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/T 31052018向日葵种子纯度蛋白电泳检测标准The variety purity identification technique of sunflower seeds with PAGE2018 - 02 - 02 发布 2018 - 03 - 02 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局   发 布DB37/T 31052018I前 言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由山东省农业厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、北京德农种业有限公司。本标准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、李岩。本标准为首次发布。DB37/T 310520181向日葵种子纯度蛋白电泳检测标准1 范围本规程规定了蛋白质电泳的试剂配比、蛋白质提取、凝胶制备、电泳、染色、判别分析等技术要求。本规程适用于向日葵品种及杂交种种子的纯度室内的快速鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 3543 种子检验技术规程GB 20464 农作物种子标签通则3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 杂交种各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。3.2 品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。3.3 标准样品能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。4 原理4.1 不同品种遗传组成不同，在种子形成时期合成的蛋白质不同。4.1.1 不同的蛋白质由于分子大小、形状不同，在一定的 pH 条件下所带的电荷多少不同，因此在电场作用下，在凝胶中移动的快慢不同，通过电泳可以把不同的蛋白质区分开，近而区分不同的亲本和杂交种。DB37/T 3105201824.1.2 利用该电泳技术，杂交种具有不育系和恢复系的双亲谱带，双亲有差异蛋白谱带是杂交种纯度检测的关键位置。4.2 蛋白谱带的命名方法：以点样孔为零点，在凝胶中部每个样品都含有的条带为 50（图 1），在050 之间细分为 50 等份作为标尺，50 以下的部分按该标尺进行区分，读取泳道内所有蛋白指纹所处位置的数值，记为蛋白质谱带名称。图 1 蛋白质谱带命名示意图5 仪器与试剂5.1 仪器单粒种子磨粉器，天平（感量0.0001 g，0.001 g），移液管(10 mL)，离心管（1.5 mL），离心管架，容量瓶（100 mL、500 mL、1000 mL），微量进样器（1L100 L），离心机，双垂直板电泳槽，电泳仪，恒温箱，电冰箱，观片灯。5.2 试剂丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，冰醋酸，过硫酸铵，尿素，四甲基乙二胺(TEMED)，三氯乙酸，考马斯亮蓝R-250，十二烷基磺酸钠(SDS)，无水乙醇（所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水)。6 溶液6.1 2% SDSDB37/T 310520183称取2 g SDS倒入100 mL烧杯中，加入去离子水溶解，加去离子水定容至100 mL，转入试剂瓶，4 贮存备用。6.2 蛋白提取液称取18 g尿素，加约 50 mL去离子水溶解后加12 mL冰乙酸， 3 mL 四甲基乙二胺，7.5 mL 2% SDS，加去离子水定容至100 mL，转入试剂瓶并加入0.05 g甲基绿，4 贮存备用。6.3 凝胶溶液称取50 g丙烯酰胺、50 g尿素、1.0 g甲叉双丙烯酰胺，加去离子水溶解后加入15mL冰乙酸，0.10 g硫酸亚铁，加去离子水定容至500 mL，4 贮存备用。6.4 催化剂溶液称取1.75 g过硫酸铵，加去离子水溶解并定容至50 mL，4 短期贮存。6.5 电极缓冲液量取20 mL冰乙酸加水定容至1000 mL。6.6 染色液称取0.4 g考马斯亮蓝R-250，用25 mL无水乙醇溶解，倒入染色盘，加50 g60 g三氯乙酸，加去离子水500 mL，搅匀。7 操作程序7.1 蛋白质提取7.1.1 从送验样品中随机数取向日葵种子 200 粒，将种子去壳后用单粒种子磨粉器压碎，放入 1.5 mL 离心管中，按向日葵种子与提取液质量体积比 1:6 加蛋白提取液、摇匀，25 提取 20 min， 用离心机 4000 g 离心 4 min，取上清液备用。7.1.2 与标签值比较时，为了减少工作量，可以顺序测定 50 粒/次，将测定结果与标签值比较是否在允许误差范围内。7.2 凝胶制备将洗净晾干的玻璃板采用水平平板灌胶的方式组装玻璃板，用铁夹固定，取40 mL凝胶溶液于烧杯中，加65L80 L催化剂溶液，迅速搅匀沿玻璃棒向玻璃板中倒满凝胶溶液，迅速插入样品梳，2 min3 min聚合后将样品梳拔出，吸出样品槽中的水分，将玻璃板固定在电泳槽内。7.3 点样用微量移液器取离心后的样品上清液30 L加入样品槽，每加一个样品后，用去离子水清洗移液器两次。7.4 电泳加样完毕后，加入2 %电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板，将电源线正极接上槽，负极接下槽。接通电源，85 mA稳流电泳2 h。DB37/T 3105201847.5 卸板、染色倒出电极液，卸开电泳槽并用油灰刀取出胶片，置染色液中染色12 h左右。7.6 电泳分析7.6.1 取出凝胶洗净，在观片灯上观察蛋白质谱带，鉴定各泳道谱带的特征和一致性。7.6.2 检测时以标准样品为参考，以亲本与杂交种的互补带为依据，分析杂粒和自交粒。7.6.3 谱带与标准样品不一致的记为非本品种籽粒，非本品种籽粒谱带中仅在互补谱带位置缺少某一亲本的为自交粒。8 结果计算待整个供检样品电泳结束后，鉴定凝胶胶片上电泳谱带的一致性，计数供检样品粒数（N）和非