夹竹桃叶提取物的抑菌作用研究

1夹竹桃叶提取物的抑菌作用研究姓名：刘再明 学号：0312402015 专业：生物工程1. 前 言夹竹桃(Nerium indicu. Mill.)属于夹竹桃科，是一种四季常绿灌木，花朵艳丽、有 红、黄、白三种花色，春、夏、秋季开花。因其在一定程度上净化空气而被广泛种植于庭院、公园或道路两旁。也是一种常见的园艺花卉，但其花粉有毒，它的树皮、 树枝、树叶、花和果实内均含有毒的夹竹桃甙，如触及其分泌的乳白色汁液会中毒（它也是毒物和药用植物）。夹竹桃所含毒物为强心甙配糖体，且种类较多，夹竹桃的叶、树皮、树根及种子含有属于强心甙的夹竹桃甙，有剧毒。夹竹桃生命力极强，人们很早就发现夹竹桃很少有病虫害，而且发现其叶、枝、皮都可以用作杀虫剂等 1。夹竹桃的叶、茎皮和根含有多种强心甙，其中欧夹竹桃甙丙是主要的药效成分。夹竹桃甙的作用类似于地高辛和洋地黄，是一种强心剂，具有强心、利尿、祛痰、定喘、镇痛、去瘀之功效，主要用于治 疗心脏病并心力衰竭、哮喘、癫痫等疾病;同时在体内、体外有抗癌功效，对人体癌细胞有显著杀伤作用，但服用过量会中毒，用量要遵医嘱。孟加拉国则把夹竹桃叶作为抗菌消炎药来使用有“绿色抗生素” 之美誉。此外，夹竹桃叶可祛除脚气，其方法是 :将水烧开后,放进 20 多片夹竹桃叶，再煮半小时，冷却至 5060时反复用其洗脚，每晚 1 次半个月即可根除 2。夹竹桃含有大量的强心甙对多种害虫有拒食、毒杀、抑制生长发2育等作用。夹竹桃叶片烘干后磨成粉末与小麦混合，可防止仓库害虫赤拟谷盗的侵害。夹竹桃全株或其根、茎、叶、花提取物对黄猩猩果蝇、二化螟、米象、绿豆象、四纹豆象、稻飞虱、蝗虫等和蔬菜上菜青虫、蚜虫等都具有胃毒和触杀作用。此外，夹竹桃叶杀虫颗粒剂在棉田对地老虎幼虫有较强的诱杀效果，平均死亡率达到 63%84%故可在钉螺孽生地区大量种植夹竹桃，以生态灭螺工程来防治血吸虫病。夹竹桃及其提取物在生物防治中显示了一定的实用性，因此，具有广阔的市场应用前景。夹竹桃提取液对血吸虫病的寄主钉螺达 83.3%2。夹竹桃的气体挥发物主要由水杨酸甲酯、乙酰乙酸乙酯、丙烯醛、丙烯酸、丁酮醇等构成。其中的水杨酸甲酯(6.71%)是一种消毒剂和防腐剂，具有较强的杀菌能力；丙烯酸(3.81%)能够酸化环境起到抑制细菌快速繁殖的作用；乙酰乙酸乙酯(0.60%0.91%)和丁酮醇(0.65%2.49%)有令人愉快的香味儿，是对人体精神状态起调剂作用的气体；所以，夹竹桃的气体挥发物总体上有保健和杀菌作用 2。近年来，其更多的药用价值被发现，因而广泛用于医药行业，具有极广的开发应用前景。有关其研究报道，国内外都寥寥无几，为了更进一步地了解夹竹桃，以便更全面的综合利用这种植物资源，本文对夹竹桃提取物的抑菌作用进行了研究，比较了不同浓度提取所得的提取物的抑菌效果，并对具有较好抑菌作用的提取物进行最低抑菌浓度的测定，为开发利用夹竹桃提供科学依据。目前对夹竹桃的报道主要集中在水提物灭螺活性研究、中毒分析以及提取物对松材线虫致死性的研究等方面。测试水提物作用后钉螺3的死亡率，用直线回归法进行量效和时效分析，夹竹桃水提物具有很强的灭螺活性 3。红花夹竹桃全株及乳白色汁液有毒新鲜树皮的毒力比叶强花的毒力较轻，干燥后毒性减弱有毒成份为多种强心甙，有一定的强心作用 4。用夹竹桃的树皮和树叶的酒精提取物和水提取物对松材线虫有很强的毒性,尤其是叶片的水提取物对松材线虫的杀伤性极强，这对利用植物提取液来毒杀松材线虫提供了一个初步的理论 5。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 实验仪器及试剂立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-50S1 ，上海博迅 实业有限公司医疗设备厂)、摇床(ZHWY200B,上海智城分析仪器制造有限公司)、电热恒温培养箱(DHP-2000 型，天津市 华北实验 有限公司) 、水平层流净化工作台(苏 州洁净技术研究所制造)、SHZ- 型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）、旋转蒸发器（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）、电冰箱、培养皿、涂布棒等。化学试剂均为国产 分析纯。2.1.2 供试菌种大肠埃希氏菌(Escherichia coli CVCC249 )、普通变形杆菌(Proteus vulgaris CCTCC AB91103 )、铜绿 假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus CCTCC AB91053)、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、八叠球菌（Sarcina lutea）。均由怀化学院微生物学 实验室提供。42.1.3 实验样品及处理夹竹桃(Nerium indicum.Mill.) 样品，采自湖南省 怀化市怀化学院校园内。取 夹竹桃叶，烘干并磨成粉末过 100 目筛备用。2.1.4 培养基LB(Luria-Bertani)液体培养基:蛋白胨 10g，NaCl 10g，酵母粉 5g，用 1mol/L NaOH 调 pH 7.0，重蒸馏水定容至 1000mL。于 121灭菌20min。LB 固体培养基：LB 液体培养基中加 1.6%的 琼脂粉，煮沸溶化后定容。于 121灭菌 20min6。2.2 实验方法2.2.1 夹竹桃叶提取液的制备方法水提液采用煎煮法。取夹竹桃叶，于 60恒温干燥 1618h 后，用蒸馏水煎煮 2 次，每次 30min7。合并滤液，于 4000r/min 离心10min，取滤 液浓缩至含生 药 1g/mL。灭菌后放入冰箱中保存 备用。醇提液和醚提液的制备。取夹竹桃叶，分别溶于 50%、70%、95%的乙醇和石油醚中，浸提 2h 后，然后置于超声波设备中超声波提取45min8，于 4000r/min 离心 10min,取滤液浓缩至含生药 1g/ml。2.2.2 菌液的制备 将所有供试菌活化两代后，分别接入试管斜面培养基上，各菌株接多支斜面，在 37恒温培养 1824h。每次实验每种菌取 1 支斜面5供试，其余于 4冰箱保存备用。实验时分别取 6 种供试菌种的斜面培养物适量，接种于 LB 液体培养基内，于 37、160r/min 下培养 1618h 。然后采用 10 倍稀释法，用生理盐水稀释至 110-4备用 9。2.2.3 抑菌实验在无菌条件下，将灭菌试管分成 2 大组，每组 42 支。42 支试管再分成 6 小组，每组 7 支。第 1 支试管中加入 1mL 2 倍浓度的 LB 液体培养基，第 25 支试管中各加入 1mL LB 液体培养基，向第 1 支试管中加入 1mL 提取液后按 2 倍稀释法，使各管 药液浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125g/mL，然后向各管中加入 0.1mL 的10-4 菌液，第 6 支试管中加 2mL LB 液体培养基，不加提取液作 为阳性对照，第 7 支试管中加提取液但不加菌液作为阴性对照,将培养物置于 37培养 1618h。从以上培养物中分别取 0.1mL 涂布于固体 LB 培养基平板上，于 37培养 1618h 后观察 7。以上试验重复 3 次。2.2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定采用 2 倍稀释法，将各提取液稀释成不同浓度的系列，加入0.1mL 的 10-4 菌液，同时设置不加提取液的作 为对照，于 37恒温培养箱中培养 1618h 后，从中取出 0.1mL 涂布于固体 LB 培养基平板上，于 37培养 1618h 后观察。以上试验重复 3 次。以完全无菌生长的平板所对应的提取液浓度作为最低抑菌浓度(MIC) 10。63 结果与分析3.1 夹竹桃叶提取液的抑菌效果夹竹桃叶不同浓度的水、50%乙醇、70%乙醇、95% 乙醇、石油醚的提取液对大肠埃希氏菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠 球菌、八叠球菌等供试菌的抑菌效果。如表 1表 5。表 1 夹竹桃叶的水提取液对供试菌种的抑制作用水提取液的浓 度（g/mL）供试菌种 阳性对照 阴性对照0.5 0.25 0.125 0.0625 0.03125大肠埃希氏菌 + - - + + + +普通变形杆菌 + - + + + + +铜绿假单胞菌 + - - + + + +粪 肠 球 菌 + - - + + + +八 叠 球 菌 + - - + + + +金黄色葡萄球菌 + - - + + + +注：“-”：无菌生长， “+”：少数菌落生长， “+”：一些菌落生长， “+”：菌落生长良好。以下同。表 2 夹竹桃叶的 50%乙醇提取液对供试 菌种的抑制作用50%乙醇提取液的浓度（g/mL）供试菌种 阳性对照 阴性对照0.5 0.25 0.125 0.0625 0.03125大肠埃希氏菌 + - - + + + +普通变形杆菌 + - + + + + +铜绿假单胞菌 + - - + + + +粪 肠 球 菌 + - - + + + +八 叠 球 菌 + - - + + + +金黄色葡萄球菌 + - - + + + +注：“-”：无菌生长， “+”：少数菌落生长， “+”：一些菌落生长， “+”：菌落生长良好。以下同。表 3 夹竹桃叶的 70%乙醇提取液对供试 菌种的抑制作用70%乙醇提取液的浓度（g/mL）供试菌种 阳性对照 阴性对照 0.5 0.25 0.125 0.0625 0.03125大肠埃希氏菌 + - - + + + +普通变形杆菌 + - - + + + +铜绿假单胞菌 + - - + + + +粪 肠 球 菌 + - - + + + +八 叠 球 菌 + - - - + + +金黄色葡萄球菌 + - - - + + +注：“-”：无菌生长， “+”：少数菌落生长， “+”：一些菌落生长， “+”：菌落生长良好。以下同。7表 4 夹竹桃叶的 95%乙醇提取液对供试 菌种的抑制作用95%乙醇提取液的浓度（g/mL）供试菌种 阳性对照 阴性对照0.5 0.25 0.125 0.0625 0.03125大肠埃希氏菌 + - - + + + +普通变形杆菌 + - + + + + +铜绿假单胞菌 + - - + + + +粪 肠 球 菌 + - - + + + +八 叠 球 菌 + - - + + + +金黄色葡萄球菌 + - - + + + +注：“-”：无菌生长， “+”：少数菌落生长， “+”：一些菌落生长， “+”：菌落生长良好。以下同。表 5 夹竹桃叶的石油醚提取液对供试 菌种的抑制作用石油醚提取液的浓度（g/mL）供试菌种 阳性对照 阴性对照0.5 0.25 0.125 0.0625 0.03125大肠埃希氏菌 + - + + + + +普通变形杆菌 + - + + + + +铜绿假单胞菌 + - + + + + +粪 肠 球 菌 + - + + + + +八 叠 球 菌 + - - + + + +金黄色葡萄球菌 + - - + + + +注：“-”：无菌生长， “+”：少数菌落生长， “+”：一些菌落生长， “+”：菌落生长良好。以下同。由表 1 可知夹竹桃叶的水提取液对这六种菌的抑菌效果都不明显，大肠埃希氏菌、普通变形杆菌、 铜绿假单 胞菌、粪肠球菌、八叠球菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别是 0.25g/ml、0.5 g/ml、0.25 g/ml、0.25 g/ml、0.25 g/ml、0.25 g/ml。由表 2 可知夹竹桃叶的 50%乙醇提取液对这六种菌的抑菌效果都不明显，大 肠埃希氏菌、普通变形杆菌、 铜绿 假单胞菌、粪肠球菌、八叠球菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别是 0.25g/ml、0.5 g/ml、0.25 g/ml、0.25 g/ml、0.25 g/ml、0.25 g/ml。由表 3 可知夹竹桃叶的 70%乙醇提取液对大肠埃希氏菌、普通变形杆菌、 铜绿假单胞菌、粪肠球菌的抑菌效果不是很明显，最低抑菌浓度是 0.25g/ml，而对八叠球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果相对8好一些，最低抑菌浓度分别是 0.125g/ml。由表 4 可知夹竹桃叶的 95%乙醇提取液对这六种菌的抑菌效果都不明显，大 肠埃希氏菌、普通变形杆菌、 铜绿 假单胞菌、粪肠球菌、八叠球菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度分别是 0.25g/ml、0.5 g/ml、0.25 g/ml、0.25 g/ml、0.25 g/ml、0. 25 g/ml。由表 5 可知夹竹桃叶的石油醚提取液对大肠埃希氏菌、普通变形杆菌、铜绿 假单胞菌、粪肠球菌的抑菌效果不是很明显，最低抑菌浓度是 0. 5g/ml，而 对八叠球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果相对好一些，最低抑菌浓度 0.25g/ml。如上所示，表 1表 5 为夹竹桃不同溶剂提取液的抑菌效果，试验结果显示， 夹竹桃对 6 种供试菌均有不同程度的抑制作用。三种不同的溶剂提取所得的提取液，醇提取液的抑菌效果最好，水提取液较弱，醚提取液最弱。其中 70%乙醇提取液的抑菌效果最 为明显。夹竹桃叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，其它细菌对其的敏感度较弱。3.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定夹竹桃叶的各种提取液采用二倍稀释法，对各种供试菌种的最低抑菌浓度参照表 6。结果显示其中水提取液、50% 乙醇提取液、95%乙醇提取液对供试菌种：大肠埃希氏菌、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、八叠球菌的抑菌效果相同。石油醚提取液在八叠球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果上与上述提取液相当，而在其它菌种上较差。70%乙醇提取液在八叠球菌和金黄色葡萄球菌9的抑菌效果上好于其它提取液，而在其它菌种上的抑菌效果与水提取液、50%乙醇提取液、95%乙醇提取液相当。由此可以得出用 70%乙醇提取夹竹桃叶，是最可取的。表 6 夹竹桃叶的各种提取液对供试菌种的最低抑菌浓度供试菌种 水提取液（g/mL）50%乙醇（g/mL）70%乙醇（g/mL）95%乙醇（g/mL）石油醚提取液（g/mL）大肠埃希氏菌 0.25 0.25 0.25 0.25 0. 5普通变形杆菌 0. 5 0. 5 0.25 0. 5 0. 5铜绿假单胞菌 0.25 0.25 0.25 0.25 0. 5粪 肠 球 菌 0.25 0.25 0.25 0.25 0. 5八 叠 球 菌 0.25 0.25 0.125 0.25 0.25金黄色葡萄球菌 0.25 0.25 0.125 0.25 0.254 讨论抑菌剂主要是通过抑制微生物细胞的膜透性或某些酶作用，从而抑制代谢过程发挥作用的。具体来说，是抑制新陈代谢中某些酶或蛋白质的合成，也有的是通过改变细胞透性，如干扰细胞壁的组成物质合成等，也有许多抑菌剂则是作为代谢拮抗物影响代谢的进行而发挥抑菌作用的。一般说来抑菌剂的分子结构特征与生物膜脂分子结构特征愈相似，则愈易进入菌