果胶酶提取银耳多糖的研究

目 录摘 要 .1关 键 词 .1Abstract.1Key words.11 前言 .22 仪器、设备和试剂 .22.1 材料、与设备 .22.2 试剂及溶液的配制 .23.方法及试验步骤 .23.1 葡萄糖含量标准曲线的制作 .23.2 银耳多糖的提取方法 .33.3 银耳多糖含量的测定 .44 结果与分析 .44.1 银耳多糖含量测定结果 .44.2 酶解法提取银耳多糖结果分析 .55 小结与讨论 .6参考文献 .71果 胶 酶 提 取 银 耳 多 糖 的 研 究摘 要 ： 国 内 常 用 的 银 耳 多 糖 提 取 方 法 有 热 水 提 取 法 ， 酸 碱 提 取 法 和 酶 解 提 取 法 等 ， 其中 酶 解 提 取 法 具 有 提 取 时 间 短 ， 条 件 温 和 等 优 点 。 本 试 验 选 取 了 酶 解 时 间 和 提 取 时 间 作 为 研究 对 象 ， 探 讨 了 不 同 条 件 下 银 耳 多 糖 的 收 率 ， 由 试 验 结 果 表 明 ， 解 法 提 取 银 耳 多 糖 的 最 适 条件 为 ： 银 耳 与 水 的 比 例 为 1g:50ml,加 入 果 胶 酶 浓 度 为 1%， 酶 解 时 间 45min,提 取 时 间 60min。关 键 词 ： 果 胶 酶 ； 银 耳 多 糖 ； 酶 解On Pectinase extract of Tremella polysaccharidesAbstract: Tremella polysaccharide extraction of hot water extraction method, the acid-base extraction and enzymatic extraction, enzymatic extraction with extraction time is short, under mild conditions. This test selected the study of enzymatic hydrolysis time and extraction time to explore the Tremella polysaccharides yield under different conditions, the results showed that the optimal conditions of the solution extract of Tremella polysaccharides: white fungus and water ratio 1g: 50ml join the pectinase concentration of 1%, the hydrolysis time was 45min, extraction time 60min.Key words: Pectinase; the Tremella polysaccharide; enzymatic21 前言银耳俗称白木耳，是一种高等真菌，属于有隔担子菌亚纲银耳科。银耳作为药食两用的食用菌已久负盛名。传统汉方医学认为，它具有润肺生津、滋阴养胃、益气和血和补脑强心等功效。现代生物医学研究表明，银耳中多糖物质具有提高机体免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗溃疡、抗血栓形成，还可增强机体耐缺氧能力，清除自由基，抑制肿瘤等作用。我国银耳资源丰富，为开发应用银耳多糖提供了有利条件。近年来，有关银耳多糖的研究越来越多，但这些研究多为银耳多糖的化学特性和药理作用方面的研究，少有关于银耳中提取银耳多糖的研究。目前银耳多糖的提取方法多为热水浸提法或酸碱法提取，但热水浸提法耗时过长，且收率较底，费时费力，因此不适合大规模的工业生产，而酸碱法提取虽然提取时间较短，却会破坏银耳多糖立体旋光活性结构，降低甚至失去银耳多糖的生物活性，使提取到的银耳多糖药用效果大大下降。因此，建立高效、经济的银耳多糖提取方法是具有积极意义的。本试验主要研究使用果胶酶酶解银耳，热水提取的技术来提取银耳多糖的方法。且如今生物工程工艺发展迅速，各种生物制品价格也不断下降，这为用酶解法提取银耳多糖提供了方向和可行性。用酶解法提取银耳多糖不仅能大大缩短单纯用热水法提取的时间，也不会像酸碱法那样破坏银耳多糖的生物活性。因此找出最适的酶解银耳提取银耳多糖的条件是具有实用和良好的现实意义的。2 仪器、设备和试剂2.1 材料、与设备101 型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）YP202N 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）HH 系列恒温水浴锅（苏州金坛中大仪器厂）电子万用炉（北京市永光明医疗仪器厂）TDZ5-WS 型台式低俗离心机（长沙湘麓离心机仪器有限公司）722E 型可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）2.2 试剂及溶液的配制银耳(市售)葡萄糖(分析纯):取 1g 葡萄糖加入 1000ml 容量瓶中，定容至 1000ml;果胶酶：按 100ml:1g 加入果胶酶苯酚（分析纯）： 精确量取 6ml 苯酚放入 100ml 容量瓶中，定容至 100ml;浓硫酸(发烟硫酸)3.方法及试验步骤3.1 葡萄糖含量标准曲线的制作取 5 支洁净的试管，分别标记为 1、2、3、4、5 号管，依次加入标准糖溶液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL 和水 1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL，再分别加入苯酚试剂 1mL，浓硫酸 5mL，混匀，室温放置 30min，冷却后，在 490nm 波长处测定吸光3值，绘制含糖量标准曲线。糖含量测定标准曲线制作管号 1 2 3 4 5标准糖溶液/mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2苯酚试剂/mL 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0浓硫酸/mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0糖含量标准曲线 A 值测定结果管号 1 2 3 4 5糖含量/mg 0 0.2 0.4 0.6 0.8A 值 0 0.228 0.425 0.663 0.980y = 1.1975x - 0.0198R2 = 0.992-0.20.00.20.40.60.81.01.20 0.2 0.4 0.6 0.8 1糖 含 量 /mgA值糖含量标准曲线得到糖含量标准曲线为 y = 1.1975x - 0.0198 （糖含量为横坐标，A 值为纵坐标）方程的 R2 为 0.992，具有较高拟合度，可以作为糖含量的标准曲线。3.2 银耳多糖的提取方法取市售银耳适量，洗净，70烘干后，破碎成粉末状，称取粉末 0.5g（2%） ，果胶酶0.25g（1%） ，同时加入蒸馏水 25mL，迅速置于 45水浴锅中酶解，3 个样品为一组，第一组酶解 30min，第二组酶解 45min，第三组酶解 60min。酶解后迅速升温至 98将酶灭活，4然后每组样品分别于 98水浴中保温浸提 30min,45min,60min，浸提完成后置于冷水中冷却至室温，然后于 4500rpm 离心分离 10min，最后取上清液待用。处理条件编号表提取时间（min）酶解时间(min)30 45 6030 1 2 345 4 5 660 7 8 93.3 银耳多糖含量的测定银耳浸提液离心后，分别取上清液 1ml,加水 19ml,即稀释 20 倍，取银耳浸提稀释液1mL 于一洁净试管中，再加入苯酚试液 1.0mL，浓硫酸 5mL，混匀，室温放置 30min，冷却后，于 490nm 处测定吸光度。4 结果与分析4.1 银耳多糖含量测定结果银耳多糖含量 A490测定结果与提取液实际糖含量结果管号 A 值 稀释液糖含量/mg 提取液实际糖含量/mg1 0.350 0.31 154.42 0.405 0.35 177.43 0.464 0.40 202.04 0.377 0.33 165.75 0.455 0.40 198.26 0.523 0.45 226.67 0.385 0.34 169.08 0.460 0.40 200.39 0.530 0.46 229.65银耳多糖含量结果变化图由上图可知，固定酶解时间时，提高提取时间可显著提高提取效果，改变酶解时间时，提取效果有提高，但不大，且从 45min 增加到 60min 增加不显著。但总体提取效果与目前银耳中提取银耳多糖的主要工艺相比，提取效果得到了较大的提升，且比热水直接提取法所用的时间明显缩短，故用酶解法从银耳中提取银耳多糖是一种优于传统提取工艺的提取方法。4.2 酶解法提取银耳多糖结果分析由表可知，用酶解法提取银耳多糖，不同的酶解时间和热水浸提时间对银耳多糖的提取率有明显的差异。酶解时间从 30 到 45min 提取效果有增加，但从 45 到 60min 提取效果几乎不在增加，因此可以判断在 45min 左右时银耳已酶解充分，为节约时间，增加银耳多糖总提取效率，将酶解时间定为 45min 比较合适。与酶解时间相比，增加提取时间对提取效果的增加大于酶解时间的影响，且随提取时间增加显著提升，但在提取 60min 时的提取量已接近银耳中银耳多糖的理论含量，因此可以判断再增加提取时间提取量的增加也不显著，且会大大增加总提取工艺时间，影响提取工艺效率，对工业化生产银耳多糖不利，而且长时间高温提取，也会对银耳多糖活性产生影响，因此，综合考虑，将提取时间定为 60min 比较合适。综上所诉，酶解 45min，热水浸提 60min 的银耳多糖提取工艺不仅有较理想的提取率，还可以尽可能的缩短提取时间，减少人力和时间的浪费，有利于大规模生产银耳多糖工业的发展。6酶解时间和热水浸提时间对多糖提取率的影响管号 酶解时间/min 热水浸提时间/min 多糖提取率/%1 30 30 30.92 30 45 35.53 30 60 40.44 45 30 33.15 45 45 39.66 45 60 45.37 60 30 33.88 60 45 40.19 60 60 45.95 小结与讨论本试验采用果胶酶酶解银耳的方法提取银耳多糖。试验讨论了不同酶解时间与不同提取时间对提取效果的影响，最终确定最佳提取工艺为：在 45下，用 1%果胶酶酶解，水与银耳比例为 100ml:1g,酶解时间为 45min，然后于 98热水浴中浸提 60min。用此法提取银耳多糖，提取率可达 40% ，远远高于传统的银耳多糖提取工艺。相比传统工艺，果胶酶提取银耳多糖不仅有较高的提取率，还可以明显缩短提取的时间，更有利于银耳多糖提取大规模工业化的发展。随着社会的发展，银耳多糖的生物功效越来越受到人们的重视，其需求也在日益增加，故酶解法提取银耳多糖的工艺有着社会和经济的双重效益。银耳多糖的生物活性在长时间高温环境和酸碱性条件下容易受到破坏，酶解法提取环境温和，且提取时间较短，能较好的保留银耳多糖的生物活性。虽然我国银耳产量高，但银耳仍然是有限的，酶解法能很好的保留银耳多糖的生物活性，且提取效率很高，故该工艺条件对银耳资源的充分利用有明显的优势。7参考文献1 黄文涛，胡学智.酶应用手册M.上海.上海科学技术出版社，19892 林宇野，杨虹.酶法提取银耳多糖的研究J.食品与发酵工业，19993 何伟珍，吴丽仙.银耳多糖的提取分离与纯化J.海峡药学，20084 黄秀锦.银耳多糖的提取、分离、纯化及其功能性质研究J.食品科学