第二章 微生物多样性

第二章微生物多样性Chapter2MicrobialDiversity曹慧教授南京农业大学生命科学学院生物多样性(biodiversity)这个单词是一个新创造的组合词，由生物(bio)和多样性(diversity)组合而成。biologicaldiversity由托马斯·拉夫卓伊(ThomasLovejoy)于1980年提出，而biodiversity则由昆虫学家威尔逊(E.O.Wilson)于1986年在国家研究委员会(NationalResearchCouncil,NRC)举办的首次美国生物多样性论坛报告中提出。微生物多样性（MicrobialDiversity）是一定区域范围内的所有微生物种类和它们的生态环境总和。第一节什么是微生物多样性1.1微生物多样性概念微生物生态系统多样性（Microbialecosystemdiversity）Speciesdiversityisanindexthatincorporatesthenumberofspeciesinanareaandalsotheirrelativeabundance.Itisgenerallyamuchmoreusefulvaluethanspeciesrichness.微生物种群多样性（Microbialspeciesdiversity）微生物遗传多样性（Microbialgeneticdiversity）Geneticdiversityisalevelofbiodiversitythatreferstothetotalnumberofgeneticcharacteristicsinthegeneticmakeupofaspecies.Itisdistinguishedfromgeneticvariability,whichdescribesthetendencyofgeneticcharacteristicstovary.Ecosystemdiversityreferstothediversityofaplaceatthelevelofecosystems.Itiscontrastedwithbiodiversity,whichreferstovariationinspeciesratherthanecosystems.——FromWikipedia,thefreeencyclopedia1.2微生物多样性的三个层次1.3微生物多样性表现形式形态多样性（Morphologicaldiversity）代谢多样性（Metabolicdiversity）生态多样性（Ecologicaldiversity）-cellshapes:rods,cocci,spirals,filaments,amorphous,star-shaped,squares,……-cellorganization:multicellularfrompairsandtetradstofilaments,sheets,rosettes,microbialmats,……-cellssize:average1to5micronsrange0.1to660microns(Thiomargarita

namibiensis,giantsulfurbacteruiminNamibiansediments)MorphologicaldiversityDimensionsofsomebacteriaChemotrophs:energyisobtainedfromchemicals

lithotrophs:inorganicchemicals(sulfur,iron,hydrogen)-autotrophs:carbonisobtainedbyfixingCO2(sulfur-reducingArchaea,methanogens)-heterotrophs:carbonisobtainedfromorganiccompounds(sulfur-reducingArchaea)

organotrophsandheterotrophs:carbonandenergyareobtainedfromorganicchemicals(heterotrophs,E.coli,pathogens)MetabolicdiversityPhototrophs:energyisobtainedfromlight

heterotrophs:

carbonisobtainedfromorganiccompounds(halophilic

Archaeaandothers)

autotrophs:carbonisobtainedbyfixingCO2(mostcyanobacteria,photosyntheticbacteria)Ecologicaldiversity-salinity:fromfreshwatertomarineandhypersalineenvironments(DeadseaandtheGreatSaltLake,halophiles)-temperature:from–12to113oC(Pyrolobus)andbeyond(121oC)-pH:from0(Thiobacillus

thiooxidans)to13(Plectonema

nostocorum)pH0is1MHCl-redoxpotential:from–450mV(methanogens)to+850mV(ironbacteria)-hydrostaticpressure:from1to1400atm(barophiles)1.4微生物多样性影响因素（Drivefactors）营养物质环境因素生物关系Diversityarisesfromthebalancebetweenspeciationandextinctionrates.Diversitytheories“…onereasonforthehighgenomicdiversityobservedinprokaryoticcommunitiesinsoilandsedimentsisthelargepopulationsoforganismsandthecapacitytoaccumulatelargenumbersofmutations.”Howdoes“abundance”influencethisbalance?1.5微生物多样性价值科研价值经济价值生态价值EstimatesofbiodiversityareproblematicCultivatedCultivatedUncultivated(16SUncultivated(16SrDNArDNAclonediversity)clonediversity)传统平板培养方法（traditionalculture-dependentmethods）群落水平生理学方法（communitylevelphysiologicalprofile，CLPP）生物标记法（Biomakers）分子微生物学方法（Molecularmicrobialdiversity）第二节微生物多样性研究方法传统培养分离方法是将定量样品接种于培养基中，在一定的温度下培养一定的时间，然后对生长的菌落计数和计算含量，并通过在显微镜下观察其形态构造，结合培养分离过程生理生化特性的观察鉴定种属分类特性。培养分离方法采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少(仅占环境微生物总数的0.1%～10%)。而且，此方法繁琐耗时，不能用于监测种群结构的动态变化。2.1传统平板培养方法不同培养基培养的细菌种系型丰度趋势线不同培养时间培养的细菌种系型丰度趋势线该方法最初由美国的BIOLOG公司于1989年开发成功，最初应用于纯种微生物鉴定，至今已经能够鉴定包括细菌、酵母菌和霉菌在内的2000多种病原微生物和环境微生物。这种方法是基于微生物群落对95种不同碳源的利用度来描述群落中微生物的动态变化。其具体做法是：利用由95孔不同单一C源和1个对照孔组成的Biolog微平板系统，将土壤溶液接种到每一个微平板孔中，在一定的温育时间内，由于不同微生物对不同单一C源利用程度和强度不一样而发生不同生化代谢反应，最终使得每一个孔的溶液呈现出不同程度的颜色，微平板中每一孔的颜色变化可以通过酶标仪测定和记录下来，这样便可得到土壤微生物特有的“代谢指纹”(MetabolicFingerprint)。根据土壤微生物的代谢指纹图谱，结合有关的计算机分析软件和己有的菌种库资料，可以得到某些微生物的分类鉴定，对一般细菌的鉴定可以精确到种，有的甚至精确到种以下的分类单元。2.2BIOLOG鉴定系统磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。2.3脂肪酸谱图法(PLFAs、WCFA-FAMEs和其它方法)荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。它根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。该方法的特点是可以进行样品的原位杂交，应用于环境中特定微生物种群鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测，是目前在分子微生物生态学领域应用比较广泛的方法之一。2.4荧光原位杂交技术（fluorescentinsituhybridization,FISH）→FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→（染色体显带）→荧光显微镜检测→结果分析采用限制性内切酶识别双链DNA分子中特异的短列，在特定的位点将DNA切开，来自不同个体基因组的含同源序列的酶切片段具有不同的长度。通过常规的电泳分离，不同长度的片段停留在不同的位置，即形成了限制性片段长度多态性指纹图谱，ARDRA(扩增rDNA限制性分析)和T-RFLP(末端RFLP)都是由RFLP发展而来的方法。T-RFLP法在PCR扩增进程中使用荧光标记的引物，因而PCR产物被末端标记。RFLP(ARDRA，RFLP)方法通常选择rRNA(rDNA)的基因作为扩增对象，广泛用于研究土壤、水体和海洋沉积物等区系微生物群落的结构和多样性。2.5限制性片段长度多态性方法（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)环境微生物16SrDNA的文库构建提取微生物总DNA分离、纯化DNA用通用引物扩增16SrDNA酶连、转化构建质粒文库再以M13引物扩增插入质粒中的rDNA片段环境微生物群落结构限制性酶切分析归纳分类同样大小的DNA序列由于含有的碱基不同，各片段的Tm值也就不同。甚至一个碱基对的不同，都会引起Tm很大的差异，DGGE或TGGE就是应用这种差异来区分不同的基因序列。这种电泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺（DGGE），从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度（TGGE）。电泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。2.6变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）2.7高通量测序方法2005年，在国际顶级的学术期刊《Nature》上，来美国454生命科学公司的Margulies等人发表文章介绍了一种快速简单的测序方法：结合了DNA扩增的乳胶系统（emulsionsystem）和皮升大小焦磷酸（pyrophosphate）为基础的测序方法——焦磷酸测序（pyrosequencing）方法。发明者宣称，这种测序方法比传统的Sanger测序的方法快100倍，假如利用这种方法来进行人类基因组的测序，那么在100多天内就可以完成。在2005年年底，454公司的研究人员将这种崭新的测序技术转化成了商品化的仪器——GenomeSequencer20系统，并由罗氏应用科学部独家负责在全球的销售和技术服务等工作。GenomeSequencer20系统一经推出，就受到了国际上基因组学专家的广泛关注，并在世界各大测序实验室相继成功落户。可以说，随着GenomeSequencer20系统的不断推广应用和升级，快速基因组测序的时代已经来临，并对整个基因组学的研究将产生巨大的推动作用。1）454测序技术（GSFLX系统超高通量测序）454技术以平均序列读长240bp遥遥领先于同系列高通量测序仪，而序列平均读长在基因组测序拼接过程中至关重要。而且454GSFLX基因组测序仪是高性能并行计算机和服务器及配套软件，建立信息处理平台与数据库，大大提高生物信息学分析能力；拥有超强的功能验证和解析能力。2）Solexa

高通量测序技术Solexa

测序技术为新一代革新性技术分子生物学综合技术平台，具有高准确性，高通量，高灵敏度，和低运行成本等突出优势,该测序技术可在每一张芯片获取1G的碱基数据，超过了传统测序仪近百倍的工作量。Solexa

测序技术为广大用户提供了强大的下一代测序方法，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。高通量测序方法介绍①土壤微生物总DNA的提取方法直接提取法能够破坏土壤结构，使团聚体内部的微生物释放出来，是进行随机和非特异性裂解的有效方法反复冻融；冰冻－煮沸；玻璃珠匀浆；液氮研磨；超声波破碎等。土壤微生物学总DNA提取与纯化B.间接提取法CoarseparticlesPellet(microbialcell)SoilcolloidSoilC.直接提取法与间接提取法比较直接提取法：优点：DNA产量高，偏嗜度低；缺点：DNA片段小，杂质高。间接提取法：优点：DNA片段大，纯度高；缺点：耗时长，产量低。图2-2间接法和