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文档简介
1、下面内容综合了Agilent和网上查到的一些资料:一般来说,反相HPLC的流动相包括有机相和水相,有机相常用的为色谱甲醇和乙腈,不太常用的还有四氢呋喃和异丙醇。甲醇有其性价比的优势,但是甲醇活性高,可能与某些样品发生反应,而且甲醇在低波长下有紫外吸收,会降低分析方法的灵敏度;乙腈虽然价格很高,毒性比甲醇大,但是洗脱能力比甲醇强,很少与样品发生反应,用作流动相系统压力要比甲醇低很多,且截止波长比甲醇低20nm,增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性,所以我们一般倾向于多用乙腈,少用甲醇。但是当样品峰形不好或者分离不好时,更换溶剂是一个很好的选择,因为不同的溶剂可提供不同的选择性。在反相色谱
2、中,流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物,典型样品的保留随pH改变而明显变化,因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要,通常在pH24的条件下,保留时间对pH的微小改变稳定性最高,因此建议将这一pH范围作为大多数样品方法开发的起始pH,包括碱性化合物和一般的弱酸。考虑到重现性,所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位。当待分析物pKa或pKb未知时,应测试一种以上流动相pH(如pH2.0和pH6.5缓冲盐溶液),可提供最好结果。对流动相的优化主要体现在水相上。流动相pH值对色谱分离的影响有多钟方式,根据待分析物的结构
3、性质,pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是非极性较强或中性的化合物,pH对分离度和保留的影响一般不明显。如果是可离子化的化合物,如酸或碱,保留因子和选择性随pH改变非常明显。(1) 酸性分析物,应选择低pH缓冲液流动相,以防止分析物离子化。了解分析物的pKa,才能有效的选择流动相pH。缓冲范围应在其缓冲液离子pK值1 pH单位,使流动相的优化具有一定的灵活性。例如,醋酸盐的pKa为4.8,缓冲范围为pH3.85.8。(2) 碱性化合物,在高pH条件下才能得到其非离子形态,但这对色谱柱不利。通常许多碱性化合物在低pH条件的保留就已经满足要求了,所以可选择低pH条件。如果选择高pH条件,则注意需
4、选择耐强碱的色谱柱。水里可以加酸、加碱、加盐,从而改变pH值、改善峰形、提高分离度。常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。单纯做液相时,低波长下磷酸最合适;而做液质时首选三氟乙酸,或甲酸、乙酸。开发液相分析方法时流动相可首选0.1%的磷酸水溶液,然后再以此为基础做优化。在单独用酸不行的时候再考虑使用缓冲盐,缓冲盐的选择原则是:简单、稳定、缓冲能力强、配制简单,需要调pH值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐,主要是钾盐和钠盐,还有醋酸盐,常用的盐浓度在1020mM左右(根据实际情况,有时可以选择更低或更高浓度,建议最高浓度不超过50mM)。下表是Waters提供的一个资
5、料,常规实验室建议使用的缓冲盐体系。缓冲盐/流动相改性剂pKa缓冲范围挥发性?(1 pH)是否MS兼容?备注TFA0.3-是是离子对试剂,能够抑制MS信号,通常使用的浓度范围0.020.1%乙酸4.76-是是同乙酸铵一起使用具有最大的缓冲能力,通常使用的浓度范围0.11.0%甲酸3.75-是是同甲酸铵一起使用具有最大的缓冲能力,通常使用的浓度范围0.11.0%乙酸盐(铵盐)4.763.765.76是是通常使用110mM浓度,注意钾盐和钠盐是非挥发性的甲酸盐(铵盐)3.752.754.75是是通常使用110mM浓度,注意钾盐和钠盐是非挥发性的磷酸盐12.151.153.15否否传统的低pH缓冲体
6、系,UV透光度很好磷酸盐27.26.28.2否否当pH超过7时,降低操作温度/缓冲盐浓度以及使用保护柱可以延长色谱柱寿命磷酸盐312.311.313.3否否当pH超过8时,降低操作温度/缓冲盐浓度以及使用保护柱可以延长色谱柱寿命4-甲基吗啡啉8.47.49.4是是通常使用浓度为10mM或更少氨水碳酸氢铵9.210.3(HCO3-)9.2(NH4+)8.210.28.211.3是是通常使用浓度为510mM(用于MS工作时保持离子源温度超过150)。用氨水或乙酸调节pH值,在pH10时具有很好的缓冲能力。乙酸铵9.28.210.2是是通常使用浓度为110mM甲酸铵9.28.210.2是是通常使用浓度为110mM硼酸9.28.210.2否否降低温度,减少浓度并使用色谱柱来延长柱寿命CAPSO(3-环己胺基-2-羟基丙磺酸9.78.710.7否否两性离子缓冲液,同乙腈互溶,通常使用浓度为110mM,气味小Glycine甘氨酸2.4,9.88.810.8否否两性离子缓冲液,比使用硼酸盐对柱子的损伤更小些1-甲基哌啶10.29.311.3是是通常使用浓度为110mMCAPS10.49.511.5否否两性离子缓冲液,同乙腈互溶,通常使用浓度为110mM,气味小三乙胺(乙酸盐)10.79.
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