基因克隆及功能分析.ppt

1、高级分子生物学技术,济南大学 生物科学与技术学院 秦余香(一）分子生物学定义,从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学 ，主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。,一、绪论,（二）分子生物学的主要研究内容,DNA重组技术,基因表达调控研究,生物大分子结构与功能的研究,基因组、功能基因组与生物信息学研究,3,狭义上讲，基因工程是指基因与载体在体外的拼接，然后转入另一种生物体内，进行遗传并表达出新的性状。又称DNA重组技术。 广义上讲，基因工程是指重组DNA技术的产业化，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上

2、游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,（三）基因工程（与分子生物学的区别）,(四）、分子生物学的应用,1、机理研究 2、生活实践,珠蛋白的DNA探针 镰刀状细胞贫血症,基因诊断,镰刀状细胞贫血症,Leptin基因,Mice without the leptin gene are morbidly obese (right) compared to normal mice (left).,1994年，美国Rockfeller大学研究开发的肥胖相关基因Leptin 以2000万美元转让给Amge

3、n公司。,Effects of recombinant human leptin treatment in a child with leptin deficiency.,（五）授课内容,基因结构、克隆和功能分析,基因克隆,正向遗传学：由表型到基因 反向遗传学：由基因到表型,如何获得已测序物种的相关基因,Whole genome sequencing has now become routine,科研机构及网络资源中心,NCBI：美国国立卫生研究院NIH下属国立生物技术信息中心NCBI。 EMBnet：欧洲分子生物学网络http:/www.e

4、/ EMBL-EBI：欧洲分子生物学实验室下属欧洲生物信息学研究所。 http:/www.ebi.ac.uk/ ExPASy: (Expert Protein Analysis System)瑞士生物信息研究所SIB下属的蛋白质分析专家系统； /,国内生物信息中心举例,CBIPKU：北京大学生物信息中心 BioSino：中国生物信息 / 中国科学院上海生命科学院生物信息中心 上海生物信息技术研究中心 /,Nucleic acid sequence datab

5、ases,Protein sequence databases,代表性的基因组学数据库有： 人类基因组数据库GDB 中国水稻基因组数据库 NCBI基因组数据库Genome ,Genome databases,NCBI,概述 Entrez检索平台 GenBank Pubmed(PubMed/GoPubMed) Blast,如何根据已知物种的基因获得目的物种的基因片段,Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE),RACE 是采用PCR 技术由已知的部分cDNA 顺序来扩增出完

6、整cDNA5和3末端,是一种简便而有效的方法, 又被称为锚定 PCR (anchored PCR)和单边PCR(one side PCR)。,3 RACE-PCR,3 RACE takes advantage of the natural poly(A) tail found in mRNA as a generic priming site for PCR. In this procedure, mRNAs are converted into cDNA using reverse transcriptase (RT) and an oligo-dT adapter primer. Spec

7、ific cDNA is then amplified by PCR using a gene-specific primer (GSP) that anneals to a region of known exon sequences and an adapter primer that targets the poly(A) tail region. This permits the capture of unknown 3-mRNA sequences that lie between the exon and the poly(A) tail.,5-RACE,The 5 RACE Sy

8、stem is a set of prequalified reagents intended for synthesis of first strand cDNA, purification of first strand products, homopolymeric tailing, and preparation of target cDNA for subsequent amplification by PCR.,蛋白质序列比对,蒺藜苜蓿的LOL1属于ARGONAUTE家族，是拟南芥ARGONAUTE7的同源基因，在TAS3 ta-siRNA途径中起关键作用,基因的功能分析,转基因小

9、鼠和基因敲除小鼠是当前研究基因功能最常用的动物模型；植物模型为转基因拟南芥或水稻及其突变体库。目的载体的构建转基因操作转基因阳性系鉴定及基因功能研究,转基因技术,酶切连接的方法构建载体,超表达 pCAMBIA2300S 启动子 pBIN m-gfp5-ER和pBI121,目的载体的构建,ACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGAGACCCCCCCCCGCCAAGAAAGTCTGAAGAAAGCACCGATCAAAAGAGCTACCACAAATCAATCGCTCACCCTTC

10、CGCTTCCAACACTAATCAAATCGTCGATTCCTTCCACCAGCAGCTCGAATCCCCATCAACAATGTCGCTGATCCGCCGCAGCAACGTGTTCGACCCCTTCTCCCTCGACTTCTTCGACCCTTTTGACGGCTTCCCCTTCGGCTCCGGCAGCAGCAACAGCGGCGGCAGCCTCGTCCCGCGCACCTCCTCCGACACGGCGGCCTTCGCGGGCGCGCGCATCGACTGGAAGGAGACGCCCGAGGCGCACGTGTTCAAGGCGGACGTCCCCGGGCTGAAGAAGGAGGAGGTGAAGGTGGAGGT

11、GGAGGACGGCAACATCCTCCAGATCAGCGGCGAGCGGAACAAGGAGCAGGAGGAGAAGACCGACACCTGGCACAGGGTGGAGCGCAGCAGCGGCAAGTTCCTCCGCAGGTTCCGGCTCCCGGAGAACGCCAAGGCGGAGCAGGTGAAGGCGTCGATGGAGAACGGCGTGCTCACCGTCACCGTGCCCAAGGAGGAGGCCAAGAAGCCCGACGTCAAGTCCATCCAGATCTCCGGCTAGGCGTCTGCGTGCTCGCTGCGCGATGAGGTGGACTGCAGAGCAGAGGTGTGGAGTTTCGCCCC

12、GGTGGTAGTGATGAAATTAAAAAAAACCAGAGTCCGGCTGTCCGTGCGTGCGCTGTGTGTCTAGTACTCTAGCGTTGTGTGCGAATAAATCTCGTCTGTGTTTCCAATCCAGCACTCAATAATGA,ACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGAGACCCCCCCCCGCCAAGAAAGTCTGAAGAAAGCACCGATCAAAAGAGCTACCACAAATCAATCGCTCACCCTTCCGCTTCCAACACTAATCA

13、AATCGTCGATTCCTTCCACCAGCAGCTCGAATCCCCATCAACAATGTCGCTGATCCGCCGCAGCAACGTGTTCGACCCCTTCTCCCTCGACTTCTTCGACCCTTTTGACGGCTTCCCCTTCGGCTCCGGCAGCAGCAACAGCGGCGGCAGCCTCGTCCCGCGCACCTCCTCCGACACGGCGGCCTTCGCGGGCGCGCGCATCGACTGGAAGGAGACGCCCGAGGCGCACGTGTTCAAGGCGGACGTCCCCGGGCTGAAGAAGGAGGAGGTGAAGGTGGAGGTGGAGGACGGCAACATCCT

14、CCAGATCAGCGGCGAGCGGAACAAGGAGCAGGAGGAGAAGACCGACACCTGGCACAGGGTGGAGCGCAGCAGCGGCAAGTTCCTCCGCAGGTTCCGGCTCCCGGAGAACGCCAAGGCGGAGCAGGTGAAGGCGTCGATGGAGAACGGCGTGCTCACCGTCACCGTGCCCAAGGAGGAGGCCAAGAAGCCCGACGTCAAGTCCATCCAGATCTCCGGCTAGGCGTCTGCGTGCTCGCTGCGCGATGAGGTGGACTGCAGAGCAGAGGTGTGGAGTTTCGCCCCGGTGGTAGTGATGAAATT

15、AAAAAAAACCAGAGTCCGGCTGTCCGTGCGTGCGCTGTGTGTCTAGTACTCTAGCGTTGTGTGCGAATAAATCTCGTCTGTGTTTCCAATCCAGCACTCAATAATGA,表达载体构建 酶切位点的引入,8045:5-TCTAGACCCATCAACAATGTCGCTGATC-3(XbaI) 8043:5-GGTACCCTAGCCGGAGATCTGGATGGAC-3(KpnI),注意（1）应选择目的序列里没有的、载体多克隆位点中含有的限制性内切酶。（2）酶切位点加在引物的5端,Gateway技术构建载体,Gateway可以被视为一种克隆操作平台：把目的基

16、因克隆到入门载体（Entry Vector）后，不用使用限制性内切酶，只靠载体上已有的特定重组位点和重组酶，就可快速、高效地将目的基因克隆到目的载体（ Destination Vector）中。,其基本原理为：在Gateway系列的载体中，一般均包含两个重组位点序列，而在两者中间有一个大肠杆菌普通菌株的致死基因ccdB基因，克隆时没有被切开的载体或者自身环化的载体在遗传转化后因带有该致死基因，该大肠杆菌菌株不能生长，包含目的基因的载体因其ccdB基因已被目的基因替换，菌株才能正常生长繁殖。,无需DNA连接酶做连接，只需要在5端PCR引物上游设计上CACC四个碱基，TOPO酶即可将PCR产物进行

17、定向克隆到pENTR载体中作为gateway技术的入门载体,D-TOPO技术,混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway LR Clonase酶，产生表达克隆。,LR clonase,Gateway技术产生的分子生物学基础,转基因流程,转基因流程,转基因程序,基因过表达或互补分析,基因的亚细胞定位定位：蛋白质在细胞内表达部位,正向遗传学,基因的图位克隆,图位克隆的基本原理,功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，通过找到与目标性状紧密连锁的分子标记，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，由于某一物种全基因组序列的公布，我们可以得到已定位区段的候选基因，通过对候选基因进

18、行分析，确定目标基因，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。,图位克隆的步骤：,Primary mapping,Fine mapping,Candidate gene,Complementation test,Functional analysis,图位克隆能实现，关键在于全基因组（Col-0生态型）测序计划的完成和各种分子标记的发现。,开发新的标记： 新的SSR标记： InDel/Caps标记：将要开发标记的日本晴区段序列与93-11做一个blast，选取插入或者缺失比较大的位点设计引物。,Candidate gene,将最后精细定位区段在/cgi-bin/gbrowse/rice/ 中输入定位区间的物理位置，即可显示出候选基因。,找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因，可以通过比较扩增，测序，表达量检测及目标性状相关的生化和生理途径等方法来排除。当然最后要说明问题的话就是构建互补载体做一个互补验证。,Complementation