酶工程动植物细胞培养产酶

1、,第三章 动、植物细胞培养产酶 与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。,植物细胞结构,植物、动物、微生物细胞的特性比较,三者之间的差异主要有： 植物细胞动物细胞微生物细胞。 动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。 植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。 植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。 植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。 植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。,一、植物细胞培养产酶 从外植体中选育植物细胞高产稳定细胞培养各种产物 1.植物细胞培养的特点 提高产率和产品质量 缩短周期 易于管理,2.培养基特点 需要大量无机盐

2、需多种维生素和激素 氮源一般为无机氮 一般以蔗糖为碳源 应用最广的是MS培养基和LS培养基 MS培养基是1962年为烟草细胞培养而设计的培养基。LS培养基是在其基础上演变而来的。P82表3-3,3.培养工艺：悬浮细胞培养 工艺流程 外植体细胞的获取细胞培养分离纯化产物 外植体选择和处理 选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把茎、叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。用70%-75%乙醇，0.1%升汞消毒，无菌水漂洗。,外植体： 从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。 愈伤组织： 将上述外植体植入诱导培养基中，于25左右

3、培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。,水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织,外植体,愈伤组织,植物细胞获取 直接分离法 愈伤组织诱导法 原生质体再生法 细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反应器中进行培养 分离纯化：生化技术,机械法,酶法, 培养条件的影响与控制 温度：室温25 pH：微酸性范围。即pH 5.0-6.0 通气与搅拌 光照的控制：强度和时间有一定要求 前体的添加（饲喂） 刺激剂的应用,4.植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例 (1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10m

4、in，然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的半固体MS培养基中，在25，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。,(2)大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （苄基腺嘌呤） 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25，600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4

5、-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。,(3)酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。,二、动物细胞培养产酶 1.动物细胞培养的特点 动物细胞可以产生各种有效高价值的物质 需添加抗生素（常用青霉素和链霉素联合） 细胞生长速度慢 细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。 反应过程成本高，产品价格贵 细胞具有锚地依赖性。宜采用贴壁培养 原代细胞一般繁殖50代,2.培养方式 (1)悬浮培养 (2)贴壁培养 滚瓶培养 微载体培养(microcarrier culture) (3)固定化细胞

6、培养 包埋(entrapment)和中空纤维(microencapsulation)培养,3.工艺控制 工艺流程 种质细胞 （体细胞；杂交瘤细胞） 分散成悬浮细胞 细胞悬浮或贴壁培养 收集 分离纯化 产物,胰蛋白酶消化,培养条件的影响与控制 温度：一般控制在36.5. pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。 渗透压: 应与细胞内渗透压相同。 溶解氧：根据情况随时调节。,4.产酶实例 以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂为例 纤溶酶原 纤溶酶,纤溶酶原激活剂,种质细胞用胰蛋白酶处理，分散，pH7.4磷酸盐洗涤。稀释成细胞悬浮液 接种到反应器中，与37 CO2培养箱中，长成致密单层 去培养液，用pH7.4磷酸盐冲洗细胞 换无血清Eagle培养液，继续培养 每3-4天，取出培养液分离纯化 再加新鲜Eagle培养液，继续培养 亲和层析进行分离,细胞生产滚瓶培养装置,第一章作业：,1.概念 酶活力单位 酶比活力 2.酶工程的主要任务和主要内容是什么？ 3.写出酶活力测定的一般步骤。,第二章作业：,1.概念：产物阻遏；分解代谢物阻遏；酶合成的诱导 2.提高酶产量的策措施有哪些？ 3.试述发酵过程中对溶解氧进行控制的必要性及其依据。 4.影响酶生物合成模式的主要