转基因植物表达的RT-PCR检测

1、转基因植物表达的RT-PCR检测,实验原理,RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA 为模板进行逆转录反应（reverse transcription， RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。 RNA扩增包括两个步骤： 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA，加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA， 最后扩增靶DNA.,一步法： 利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP 直接进行mRNA反转录与PCR扩增。利用反转录酶和 Taq酶作用在同一体系中

2、直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。,RT-PCR一步法和两步法,两步法：由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且 容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，

3、适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。,RT-PCR一步法和两步法,外源基因的转录表达,基因表达,基因表达指基因组中某基因在细胞中 转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。,基因表达的改变预示着细胞在分子水平 上的变化。它往往是细胞形态功能变化之 前的变化。,目前研究转基因植物外源基因转录表达的常用方法,1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、real-time PCR (RNA ）,反转录PCR(RT-PCR),mRNA,cDNA,PCR,Oligo dT, 逆转录酶,特异性引物, Taq酶,用途: 获得所需cDNA

4、片段；检测基因表达,注意问题：,1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、共同扩增 4、扩增片段位置 5、mRNA丰度,仪器 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。 试剂 RNA 反转录酶，3U/L Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌dd water。,实验操作步骤：,1）RNA提取： 关键 防止RNA降解,RNA提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 重要的步骤。,2)逆转录： RNA、

5、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物（随机引物，Oligo dT; 特异引物),A）在0.2mL微量离心管中，加入如下各成分 总RNA 2L（1-5g） 10PCR buffer 1L dNTPmix（各2.5mM） 2L 逆转录酶（200u/L） 0.5L Oligo（dT） 或randorm 9 mers 2L ddH2O 至10L 混匀后稍离心，42孵育30min，99 5min然后4 保温5min，终止反应后置冰上。,3) PCR,特异性引物、模板、Taq 聚合酶。,（B）在0.2mL PCR 微量离心管中配制20L反应体系 10PCR buffer（含MgCl2） 3L 2.5mmol

6、/L dNTP 2L 10mol/L Primer1 1L 10mol/L primer2 1L 模板CDNA 5L 3U/L Taq酶 0.5L dd water 补足至 20L （C）根据具体的条件设置PCR仪的循环程序： （D）PCR结束后，取10L产物进行琼脂糖凝胶电泳。,RT-PCR全过程,Requiere el conocimiento de la secuencia para disear GSP and GSP1,【结果与分析】,利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录； 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。 RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因